一种测定单胺氧化酶的试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定单胺氧化酶的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂R1：Tris缓冲液50~150 mmol/L、苄胺12~38 mmol/L、α?酮戊二酸2~18 mmol/L、EDTA 0.3~1.7 mmol/L，其溶剂为纯化水，试剂R2：Tris缓冲液50~150 mmol/L、乙酰辅酶A 0.5~2.5 mmol/L、还原型辅酶0.2~1.8 mmol/L、谷氨酸脱氢酶0.5~3.5 KU/L，其溶剂为纯化水，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的单胺氧化酶的浓度。本发明具有操作方便、准确度高等优点。
【专利说明】
-种测定单胺氧化酶的试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定单胺氧化酶的试剂盒 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 单胺氧化酶(MAO)，是催化单胺类物质氧化脱氨反应的酶，单胺氧化酶存在与细胞 的线粒体外膜上，在人体内分布极广，尤W肝、脑及肾等组织细胞内的含量最高，由于需要 黄素腺嚷岭二核巧酸作辅助因子，因此它属于黄素蛋白酶或含黄素胺氧化酶。
[0003] 临床上，MAO活性的高低是反映肝纤维化的程度，诊断肝硬化的重要指标，且血清 单胺氧化酶活性升高与肝表面结节形成的进程相平行，MAO活性升高还可见于甲亢、糖尿病 合并脂肪肝、充血性屯、衰、肢端肥大症等疾病。
[0004] 目前测定单胺氧化酶活性的方法有巧光法、免疫抑制法和化学分光光度法，相比 而言化学分光光度法更为普遍，巧光法有巧光剂污染环境，免疫抑制法会产生较多的MO同 工酶，测定起来更加困难，而且测定的准确度差，虽然化学分光光度法较为普遍，但化学分 光光度法所需物质提取均较为复杂，过程繁琐。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、测定准确度低的缺 陷，而提供一种测定单胺氧化酶的试剂盒及其制备方法。
[0006] 本发明解决上述技术问题提供的技术方案是:本发明公开了一种测定单胺氧化酶 的试剂盒，包括彼此独立的试剂Rl和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂Rl: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 节胺 12~38 mmol/L 日-酬戊二酸 2~18 mmol/L 邸TA 0.3~1.7 mmol/L 其溶剂为纯化水。
[0007] 试剂R2: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 乙酷辅酶A 0.5~2.5 mmol/L 还原型辅酶 0.2~1.8 mmol/L 谷氨酸脱氨酶 0.5~3.5 KU/L 其溶剂为纯化水。
[000引作为优选，本发明公开了一种测定单胺氧化酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂Rl 和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂Rl: Tris缓冲液 100 mmol/L 节胺 25 mmol/L a-酬戊二酸 10 mmol/L 邸TA 1.0 mmol/L 其溶剂为纯化水。
[0009] 试剂 R2: Tris缓冲液 100 mmol/L 乙酷辅酶A 1.5 mmol/L 还原型辅酶 1.0 mmol/L 谷氨酸脱氨酶 2.0 KU/L 其溶剂为纯化水。
[0010] 作为优选，所述的试剂Rl中，所述的化is缓冲液的pH值为6~8。
[0011] 作为优选，所述的试剂R2中，所述的化is缓冲液的pH值为6~8。
[0012] 作为优选，本发明还公开了上述测定单胺氧化酶的试剂盒的制备方法和使用方 法，包括W下步骤： (a)按照下列组分含量配制好试剂： 试剂Rl: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 节胺 12~38 mmol/L 日-酬戊二酸 2~18 mmol/L 邸TA 0.3~1.7 mmol/L 其溶剂为纯化水。
[0013] 试剂R2: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 乙酷辅酶A 0.5~2.5 mmol/L 还原型辅酶 0.2~1.8 mmol/L 谷氨酸脱氨酶 0.5~3.5 KU/L 其溶剂为纯化水。
[0014] (b)将待测样本与试剂Rl和试剂R2混合，使其充分反应； (C)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d)根据吸光度变化值计算出样本中的单胺氧化酶的浓度。
[0015] 本发明的检测原理是:试剂中的节胺在血清单胺氧化酶的作用下生成氨，氨在谷 氨酸脱氨酶的作用下与Q-酬戊二酸和还原型辅酶反应，使得还原型辅酶在340nm波长处的 吸光度降低，通过测定吸光度的变化率反映血清中单胺氧化酶的活性。
[0016]
式中：A Au/min待测样品平均每分钟的吸光度变化值 A Ae/min校准液平均每分钟的吸光度变化值 Cs校准液中MO的浓度 与现有技术相比，本发明具有W下有益优点： 可W应用于临床全自动生化分析仪，操作简单，和W往的巧光法相比，没有巧光剂造成 的污染，也无需像化学分光光度法提取特殊的物质，操作方便，该技术可W大规模应用于临 床检测，本发明还采用了酶之间相互偶联的检测方法，使得检测结果更加灵敏和准确，另外 本发明通过添加邸TA,邸TA的中文名称是乙二胺四乙酸，是化学中一种良好的配合剂，它有 六个配位原子，形成的配合物叫做馨合物，EDTA是馨合剂的代表性物质，一般是测定金属离 子的含量，在生物应用中，用于排除大部分过度金属元素离子，如铁（III)、儀(II)、儘（II) 等的干扰，在蛋白质工程及试验中可在不影响蛋白质功能的情况下去除干扰离子，因此本 发明通过添加抓TA作为馨合剂，能够有效去除血清中部分金属离子的干扰，因此本发明对 单胺氧化酶的检测的准确度比较高。
【具体实施方式】
[0017] W下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于运些实施例。
[001引实施例1 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂Rl和试剂R2双液体组分，其中 试剂Rl: Tris缓冲液 100 mmol/L 节胺 25 mmol/L a-酬戊二酸 10 mmol/L 邸TA 1.0 mmol/L 其溶剂为纯化水。
[0019] 试剂R2: Tris缓冲液 100 mmol/L 乙酷辅酶A 1.5 mmol/L 还原型辅酶 1.0 mmol/L 谷氨酸脱氨酶 2.0 KU/L 其溶剂为纯化水。
[0020] 实施例2 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂Rl和试剂R2双液体组分，其中 试剂Rl: Tris缓冲液 150 mmol/L 节胺 38 mmol/L a-酬戊二酸 2mmol/L 邸TA 1.7 mmol/L 其溶剂为纯化水。
[0021] 试剂R2: Tris缓冲液 50 mmol/L 乙酷辅酶A 0.5 mmol/L 还原型辅酶 0.2 mmol/L 谷氨酸脱氨酶 3.5 KU/L 其溶剂为纯化水。
[0022]实施例3 试剂盒的制备和使用方法 1、按照下列组分含量配制好试剂： 试剂Rl: Tris缓冲液 100 mmol/L 节胺 25 mmol/L a-酬戊二酸 10 mmol/L 邸TA 1.0 mmol/L 其溶剂为纯化水。
[002；3]试剂 R2: Tris缓冲液 100 mmol/L 乙酷辅酶A 1.5 mmol/L 还原型辅酶 1.0 mmol/L 谷氨酸脱氨酶 2.0 KU/L 其溶剂为纯化水。
[0024] 2、全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测溫度:37°C; (b) 检测波长:主波长340皿、副波长405皿； (C)反应时间：8min，其中，解育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度Al, 3min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d)反应方向：负反应。
[00巧]3、检测步骤 (a) 取2(K)山试剂Rl与20山待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下解育5min; (C)加入50iil试剂R2,立即测定读取吸光度Al，3min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 AA = A2-A1； (d)
计算出样本中的单胺氧化酶的浓度。
[00%] 实施例4 试剂盒的制备和使用方法 1、按照下列组分含量配制好试剂： 试剂Rl: Tris缓冲液 150 mmol/L 节胺 38 mmol/L a-酬戊二酸 2mmol/L 邸TA 1.7 mmol/L 其溶剂为纯化水。
[0027] 试剂R2: Tris缓冲液 50 mmol/L 乙酷辅酶A 0.5 mmol/L 还原型辅酶 0.2 mmol/L 谷氨酸脱氨酶 3.5 KU/L 其溶剂为纯化水。
[0028] 2、全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测溫度:37°C; (b) 检测波长:主波长340皿、副波长405皿； (C)反应时间：8min，其中，解育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度Al, 3min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d)反应方向：负反应。
[0029] 3、检测步骤 (a) 取2(K)山试剂Rl与20山待测样本混匀； (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下解育5min; (C)加入50iil试剂R2,立即测定读取吸光度Al，3min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 AA = A2-A1； (d)
计算出样本中的单胺氧化酶的浓度。
[0030] 表1为实施例1所制得的测定单胺氧化酶的试剂盒W及实施例2所制得的测定单胺 氧化酶的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的单胺氧化酶的浓度为 10U/L，测定结果见表1:
由表1可知，本发明所制得的测定单胺氧化酶的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较 小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0031] 表2为实施例1所制得的测定单胺氧化酶的试剂盒W及实施例2所制得的测定单胺氧化 酶的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的单胺氧化酶的浓度为22U/L， 测定结果见表2: 表2
由表2可知，本发明所制得的测定单胺氧化酶的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较 小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
[0032] 表3为实施例3所制得的测定单胺氧化酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反 复测定W及实施例4所制得的测定单胺氧化酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测 定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下： 表3
田巧；3 W知本发巧所制得的测足早胺'氧化觸的巧刑盧的棉酱巧化救巧，阳且田巧1可 知，实施例3为最优的选择。
[0033] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人±皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所掲示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种测定单胺氧化酶的试剂盒，其特征在于:包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液 体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 苄胺 12~38 mmol/L α_酮戊二酸 2~18 mmol/L EDTA 0.3-1.7 mmol/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 乙醜辅酶A 0.5~2.5 mmol/L 还原型辅酶 0.2~1.8 mmol/L 谷氨酸脱氢酶 0.5~3.5 KU/L 其溶剂为纯化水。2. 根据权利要求1所述的一种测定单胺氧化酶的试剂盒，其特征在于:包括彼此独立的 试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为： 试剂R1: Tris缓冲液 100 mmol/L 苄胺 25 mmol/L α_酮戊二酸 10 mmol/L EDTA 1.0 mmol/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 100 mmol/L 乙酰辅酶A 1.5 mmol/L 还原型辅酶 1.0 mmol/L 谷氨酸脱氢酶 2.0 KU/L 其溶剂为纯化水。3. 根据权利要求1或2所述的一种测定单胺氧化酶的试剂盒，其特征在于:所述的试剂 R1中，所述的Tris缓冲液的pH值为6~8。4. 根据权利要求1或2所述的一种测定单胺氧化酶的试剂盒，其特征在于:所述的试剂 R2中，所述的Tris缓冲液的pH值为6~8。5. 根据权利要求1或2所述的一种测定单胺氧化酶的试剂盒的制备方法和使用方法，其 特征在于:包括以下步骤： (a)按照下列组分含量配制好试剂： 试剂R1: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 苄胺 12~38 mmol/L α_酮戊二酸 2~18 mmol/L EDTA 0.3-1.7 mmol/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: Tris缓冲液 50~150 mmol/L 乙醜辅酶A 0.5~2.5 mmol/L 还原型辅酶 0.2~1.8 mmol/L 谷氨酸脱氢酶 0.5~3.5 KU/L 其溶剂为纯化水 (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应； (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值； (d) 根据吸光度变化值计算出样本中的单胺氧化酶的浓度。
【文档编号】C12Q1/26GK105861628SQ201610273291
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】蔡晓辉, 庄庆华, 吴铮, 徐运
【申请人】安徽伊普诺康生物技术股份有限公司