一种用于功能基因的克隆及功能研究方法

一种用于功能基因的克隆及功能研究方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于功能基因的克隆及功能研究方法，所述方法先根据前人的研究结果明确所要研究的基因，制备该功能基因的多克隆抗体，利用Western blot和荧光PCR研究该功能蛋白在不同逆境胁迫下的表达变化情况，确定其与哪种逆境相关，再利用同源克隆分离该基因，随后根据研究结果有目的的对该基因进行后续研究，明确其在相关逆境下的表达规律、功能等。所述方法工作量小，过程简单，耗时少，目的性强。
【专利说明】
-种用于功能基因的克隆及功能研究方法
技术领域
[0001] 本发明基因克隆领域，涉及一种用于功能基因的克隆及功能研究方法。
【背景技术】
[0002] 随着对植物耐逆境分子机理的研究的不断发展，人们对植物在逆境胁迫下的分子 机制有了更加深入的了解。但是对与植物各种逆境都相关的关键功能基因的研究还比较 少，并且对其的克隆还比较难。已经有相关的研究报道阐明，在植物体内存在一些关键的功 能基因，各种逆境胁迫可W引起送些基因的响应，并且通过它们的差异表达来应对各种逆 境胁迫。
[0003] 对植物中与各种逆境都相关基因的研究，已经逐渐成为人们的研究热点。但目前 存在一个严重的障碍。与植物各种逆境胁迫相关的基因有很多，并且每天还在W惊人的速 度增加，特别是在各种植物的基因组测序不断完成后。但是，与各种逆境胁迫都相关的关键 攻功能基因鲜有报道，并且寻找十分困难。人们克隆得到一条基因，要想明确其是否与各种 逆境相关，要对其进行大量的后续试验。且不说对该基因进行各种逆境下的表达规律分析 费时、费力，就仅仅是各种逆境处理取样的过程就需要耗费相当长的时间。并且送种方式对 基因的研究十分盲目、目的性不强，往往在大量的试验工作之后却得不到明确的结果。随着 各种先进的分子生物学技术的发明与发展，分离克隆和研究相关基因显得相对简单。只有 更有效率合理的利用送些技术才能克服上面的障碍，才能目的性更加明确的找到相关功能 基因，有的放矢的对其进行研究。本发明的发明人在对大豆的耐逆性研究中发现，大豆的在 逆境胁迫下的分子机理十分复杂，一些功能基因在送一过程中起着十分关键的作用，但是 利用常规的方法发现送些基因并明确功能的过程繁复兀长。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种目的性更明确的基因克隆和功能研究方 法。
[0005] 本发明是通过W下技术方案来实现的： 一种用于功能基因的克隆及功能研究方法，包含W下步骤： (1) 制备目的功能基因的多克隆抗体； (2) 利用蛋白质印迹法（Western blot)和英光PCR检测该目的功能基因在不同逆境胁 迫下的表达变化情况，明确其与各种逆境的关系； (3) 利用同源克隆分离该基因。
[0006] 作为优选方式，还可W对所述步骤（3)中克隆得到的目的基因进行后续研究，明确 其在相关逆境下的表达规律和功能。
[0007] 作为优选方式，所述所述目的基因为FtsH基因。
[0008] 作为优选方式，所述FtsH基因的多克隆抗体通过W下步骤制备： 1)根据保守区域设计两条多肤，序列如下： P巧I ;MFVGVGASRV畑LFRKAKENAPC P巧2 ;LGARPPRGVLLVGLPGTGKC ; 2) 合成步骤I)所设计的多肤并分别与KLH偶联，得到偶联蛋白GmFtsH-KLH-I和 GmFtsH-KLH-2 ； 3) 分别用上述步骤中所得偶联蛋白对大白兔进行初次免疫，并进行3次加强免疫； 4) 对免疫后的大白兔行耳静脉取血，测定免疫效价； 5) 对免疫后的大白兔行颈动脉取血，离必收集多抗血清，分别收集两种多肤对应的多 克隆抗体。
[0009] 作为优选方式，所述步骤（2)为：W分别在干旱、盐、冷害和大豆胞囊线虫四种胁 迫下大豆的叶片为材料，提取大豆蛋白，利用蛋白质印迹法（Western blot)和英光PCR检 测FtsH蛋白在上述各种胁迫下的表达情况。
[0010] 作为优选方式，所述同源克隆步骤为：W盐处理的大豆叶片为材料提取RNA并反 转录成cDNA，W所得的CDNA作为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物连接到T载体上进 行测序验证。
[0011] 作为优选方式，所述同源克隆步骤包括： 1) 引物设计，根据已经报道的FtsH基因序列，设计兼并引物； 2) 通过预实验确定引物序列； 3) PCR扩增， 反应体系；4 U 1模板，4 U 1浓度为2. 5 ml的H磯酸脱氧核巧酸，5 U 1 IOX的缓冲液， 5 y 1正向引物（Primer F)，5]il反向引物（Primer R)，0. 5 y 1浓度为加 nit/ y 1的聚合酶， 26. 5 U 1 (1地2〇 ; 反应程序： 95°C,5 min ； 94°C，45 s，55°C，45 s，72°C，2min20 s;35 个循环； 72°C，10 min ;PCR 产物回收； 4) 连接、转化， 连接；I y I载体，3 y I酶切回收产物，5y I连接酶混合物I y I无菌水混匀，室温 反应30 min W上； 转化；取出一8(TC保存的感受态细胞（D册a )，放在冰上缓慢解冻，将感受态细胞加入 连接产物中混匀，冰上放置30 min,然后42°C热激90 S，再冰浴2 min后，加入800 Ul无 抗性的18培养基，371：培养45 111111，5000巧111离必3 111111，弃大部分上清，留约100-150111， 重悬菌体，选择有相应抗性的LB平板，涂板，瞭干，于37C培养箱中倒置培养过夜； 5) 测序；选取PCR验证正确的克隆进行测序。
[0012] 本发明的另一目的在于提供上述的方法克隆得到的基因，该基因具有如SEQ ID NO. 1所述的核巧酸序列。该基因的所述的核巧酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 述。
[0013] 本发明的有益效果： 多克隆抗体的制备、Western blot、同源克隆等技术经过长期的发展，无论是方法还是 设备的使用都非常成熟。本发明的发明人非常巧妙的把送几种技术结合起来，一反常态从 蛋白表达入手，先对目的基因的蛋白表达进行研究，明确其功能相关性，再对其进行克隆分 离，然后有目的性的对该基因进行后续研究，发明了一种目的性更明确的基因克隆和功能 研究方法，所述方法工作量小，过程简单，耗时少，目的性强。利用本发明的方法，可W明确 的克隆功能基因，例如通过此方法可W直接分离得到与植物逆境相关的关键功能基因，进 一步了解植物的耐逆性分子机制。
【附图说明】
[0014] 图1为实施例2中免疫效价测定结果图， 图2为实施例4中PCR扩增产物的电泳图，其中M为Marker ;1为样品1 ;2为样品2 ; 图3为实施例5中干旱胁迫下GmFts肥基因的相对表达量分析； 图4为实施例5中低温胁迫下GmFts肥基因的相对表达量分析。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，应该理解的是，送些实施例仅用 于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[001引 实施例1 用本发明的方法克隆基因 FtsH基因，其具体步骤为： (1) 制备FtsH基因的多克隆抗体； (2) 利用蛋白质印迹法（Western blot)和英光PCR检测FtsH基因在不同逆境胁迫下 的表达变化情况，明确其与各种逆境的关系； (3) 利用同源克隆分离该基因。
[0017] 实施例2; 本实施例为上述FtsH基因的多克隆抗体的制备，其具体步骤为： 根据FtsH基因的保守区域设计两条多肤，序列如下： GmFt sH-1 ;MFVGVGASRV畑LFRKAKENAPC GmFtsH-2 ：LGARPPRGVLLVGLPGTGKC ； 2) 合成步骤I)所设计的多肤并分别与KLH偶联，得到偶联蛋白GmFtsH-KLH-I和 GmFtsH-KLH-2 ； 3) 分别用上述步骤中所得偶联蛋白（GmFtsH-KLH-I和GmFtsH-KLH-2)作为免疫原对 大白兔进行初次免疫，并进行3次加强免疫；免疫用兔子为2. Okg左右的新西兰大白兔，免 疫之前耳静脉取阴性血清，然后取200ug免疫原，用生理盐水稀释到200-500U1，再加入等 体积弗氏佐剂(初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂）；用混匀仪器将溶 液和佐剂混匀，形成油包水。将混匀好的免疫原进行背部皮下注射免疫，打8-10个点。所 述耳静脉取阴性血清的具体步骤为：用75%酒精擦拭兔子耳部静脉，擦至静脉充分扩张。然 后用注射器插入静脉抽取阴性血l-2ml，全血在室温静置30min-120min后，500化pm离必 IOmin,收取血清。
[0018] 4)对免疫后的大白兔行耳静脉取血，测定免疫效价，具体步骤为： 首先配置W下所述的试剂： 包被液；碳酸钢-碳酸氨钢缓冲液，pH9. 6 PBS缓冲液抑7. 4 封闭液；1%BSA或脱脂奶粉溶于PBS缓冲液中 洗液；PBS - T (0. 05%吐温溶于PBS) 显色液：1%A液+10%B液（A液；1%TMB溶于二甲基亚讽DMSO ;B液；0. 1% &〇2溶于巧樣 酸缓冲液） 终止液；2M硫酸 二抗；山羊抗兔IgG/HRP ; 然后用包被液稀释抗原，终浓度为化g/ml，lOOul/孔，4°C，过夜；后用洗液洗涂2次； 封闭液封闭，200ul/孔，37C赔箱，2h ;后用洗液洗涂1次； 多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释（in PBS)，空白对照（blank)为PBS，阴性对照 (negative)为阴性血清200倍稀释（in PBS);均为IOOul/孔，37°C赔箱，比；后用洗液洗涂 3次； 加入PBS稀释20000倍的二抗，IOOul/孔，37°C赔箱，Ih ;取出后用洗液洗涂3次； 显色，显色液IOOul/孔，显色时间为5-15min ; 每孔加入50ul终止液终止； 双波长（450,603)测吸光值，记录保存数据，并做图分析； 效价为大于最大0D/2的最小OD读数所对应的稀释度。结果如表巧日图1所示，效价 达要求。 「mi9l 要1化掠动价加Il吿结革
巧汪；效价刃天十最天UD/2的最小UD巧数所刈化的稀粋度。
[0020] 5)对免疫后的大白兔行颈动脉取血，离必收集多抗血清，分别收集两种多肤对应 的多克隆抗体（Anti-GmFtsH-I和Anti-GmFtsH-2)。具体步骤为： 用麻醉剂麻醉兔子(戊己比妥钢，30mg/kg，静脉、腹腔、肌肉注射均可）； 兔子麻醉后，用固定架固定；用手术器械剪开脖子外层皮毛，于气管侧面下方找到颈动 脉，止血谢夹紧动脉管并剪断放血，收集全血； 全血在室温静置30min-120min后，5000巧m离必lOmin，两次离必后收取血清。
[00川 实施例3 本实施例为针对天然材料的Western blot检测： W在干旱、盐、冷害和大豆胞囊线虫等胁迫下大豆品种抗线3号的叶片为材料，提取大 豆蛋白，利用Western blot和英光PCR研究FtsH蛋白在各种胁迫下的表达情况。结果如 图2所示，FtsH的蛋白质大小预测在60-75kD，目前GmFtsH-I的抗体（Anti-GmFtsH-I)可 W识别目的蛋白质。
[002引 实施例4 本实施例为FtsH基因的同源克隆。通过已经报道的FtsH基因序列，利用同源克隆的 方法，设计兼并引物；W盐处理的大豆叶片为材料提取RNA并反转录成CDNA作为模板进行 PCR扩增。将得到的PCR产物连接到T载体上进行测序验证。发现扩增得到的基因序列与 拟南芥的Fts肥的同源性最为接近。在NCBI中查找相关的FT甜序列，并进行保守区分析。 具体步骤为： 1) 设计引物： FTSH-IF:ATGTCGGCGTTGGAGTATCTC FTSH-2F:ATGGCAGCRYCATCTCRGCATG FTSH-3F:ATGAAGCAAGTTMAWATC FTSH-MR:GTYTT肥CWGTBCCWGGRGACC FTSH-MF:GGTCYCCWGGVACWGGDAARAC FTSH-Rl:CTGCAATGGGAGGAGAGACCC FTSH-R2:GGAGTTGAAGGAGGGACMC FTSH-R3:CTAAAGGTGAAGACCCRCCACC 通过预实验确定引物序列为： 正向引物（Primer F) ;CATGCCATGGAGATGGCAGCATCATCAGCATGC 反向引物（Primer R) ; CGGGATCCAACAGTGGCTGGTACTGG 2) PCR扩增 反应体系；4 U 1 模板，4 U 1 dNTPs (2. 5 ml)，5 U 1 Buffer (IOX)，5 U 1 Primer F，5 U 1 Primer R，0. 5 y I (加 nit/ y I)聚合酶，26. 5 y I d地20。
[002引反应程序： 95T.5
mi.n 55°C，45 S 35 个循环 72°C,2min20 s 720C，10 min。
[0024] PCR产物回收戚脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI)，产物的凝胶电泳结果如图2所 /Jn O
[00幼 3)连接、转化 连接；1 Ul载体，3 Ul酶切回收产物，5 Ul连接酶混合物（TaKaRa, DNA ligation Kit Ver 2. 0) 1 y 1无菌水混匀，室温反应30 min W上。
[0026]转化： 取出一8(TC保存的感受态细胞（D册a )，放在冰上缓慢解冻； 将感受态细胞加入连接产物中混匀，冰上放置30 min ; 42°C 热激 90 S; 冰浴2 min后，加入800 U 1无抗性的LB培养基； 37 °C 培养 45 min ; 5000巧m离必3 min,弃大部分上清，留约100-150 U 1，重悬菌体，选择有相应抗性的 LB平板，涂板； 瞭干，于37C培养箱中倒置培养过夜。
[0027] 4)测序 选取PCR验证正确的克隆进行测序。
[002引 实施例5 本实施例为安照本发明所述方法克隆得到的FTSH基因的表达试验，采用相对实时 定量PCRCrelative quantitativereal time PCR)分析，提取样品的总RNA,反转录获得 。0臟，^大豆1'册]^抑（邑17。6阿1(16117(16-3-口11〇3口11曰16(16117化〇邑6]1曰36)为内参基因，采用 实时反转录聚合酶链式反应（rea-1 time PCR)方法，检测在干旱、高温、盐胁迫和热胁迫 下、高温和低温胁迫下技皿巧5化表达水平，结果显示该基因与干旱和低温有关（图3和图 4)。
[0029] W上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改 变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。
[0030] 沈卵ENCE LISTING <110〉 <120〉一种用于功能基因的克隆及功能研究方法 <130〉 <160〉 <170〉 <210〉 <211〉 <212〉 DNA <213〉GmFts肥基因的核巧酸序列 <400〉 1 1过tggc过gc过t C过tc过gc过tg CCttgt过ggg过过tggttt过t Ct过C过Cgggg t过过t过g过过t过 61 actcttaaga aggacttcaa tggaagaaga tatctctact catcttggag actttcatta 121 ttg过过C过过C过过t过过ggc过tc过过过过gc过ttt tcc过t过过过gg C过tctttgg过gc过过过ggc过过 181 gaagaaagga gaagggggtt tctgaaactg ttgcttggaa atctgggagt tggtttgcct 241 gc过Ct过ttgg g过过gtggc过过过gctt过tgct g过tg过过C过过g gggtttc过tc ctcc过g过过tg 301 tctt过ctcc过ggtttctgg过gt过tttgg过C过过gg过C过g过g tt过过过过过过gt gg过tcttt过t 361 g过C过过tgg过过过C过ctgctgt tgttg过ggct gtttcgcccg 过gttgggg过过 CCggtC过C过g 421 t过tgtt过g过g ttc过过ctccc tgg过Ctt过过C C过过g过gctcc ttc过g过过过tt c过ggg过过过过g 481 aatattgact ttgcagctca tagtccccaa gaagagtcag gttctctttt agctaacctg 541 attgggaatc tggctttccc tttgctcttg attggaggat tgttccttct ctcgagacga 601 tccggaggga tgggaggtcc tggtggccct ggatttcctc ttgcttttgg tcaatccaaa 661 gcc过过gtttc过过过tgg过过CC过过过C过CCgg过gtg过C过tttg过tg过tgttgc tggggtgg过t 721 g过过gcc过过gc Sggsctttst gg过ggtggtg g过gttttt过过过g过过gcctg过 g过ggttt过Ct 了81 gctgttgggg ctcgcattcc taaaggagtt cttcttgttg gtcctccagg aactgggaag 841 accttgttag ccaaggctat tgctggtgaa gctggtgttc catttttctc tatatcaggt 901 tctgagtttg ttgagatgtt tgttggtgtt ggtgcttctc gtgttcgtga tttgttcaag 961过过ggcg过过过g过g过过tgcccc ttgc过ttgtc tttgttg过tg过g过ttg过tgc tgttgg过过g过 1021 C过过过g过ggg过Ctgg过过ttgg tgg过ggg过过t g过tg过过过g过g过gc过g过CCCt C过过CC过过Ctt 1081 ttg过C过g过过过tgg过tgggtt tg过gggt过过C过C过ggt过tc过ttgtcgttgc过gc过过Ct过过C 1141 过gggCtg过C过 ttcttg过C过C ggCCttgttg 过g过CCtggCC g过tttg过t过g 过C过ggtg过C过 1201 gttg过tgttc C过g过t过t过过g ggg过过gg过Ct g过过过tcct过过过ggttc过tgc t过gc过过C过过过 1261 aagtttgatg ctgatgtttc tcttgaagtg attgcaatga gaacacctgg ctttagtgga 1321 gctg过tcttg Cgsstctgtt g过过tg过过get get过t过tt过g ctggtcgccg tgg过过gg过C过 1381 get过tttc过t Ct过过过g过过过t tg过tg过ttct过ttg过t过gg过ttgtggctgg过过tgg过过gg过 1441过C过gtg过tg过C过g过tggg过过g过gc过过过过gt tt过gtggc过t过tc过tg过过gt tggtc过tgct 1501 atttgtggaa ctttgactcc tggtcatgat gctgtgcaaa aggtaacgct agttcctcgc 1561 ggtcaagctc gtggacttac atggttcatt cctaacgatg acccaactct gatctccaaa 1621 C过过C过过Ctct ttgc过过g过过t tgt过gg过gg过Ct过ggtggg过gggctgc过g过过g过过过tt过tt 1681 ttcggtg过gc Ctg过过gtt过C 过过Ctgg过gc过 gctggtg过tt tgc过gc过过过t C过CCSgtttg 1741 gc过过过过C过g过tggtg过CC过C过tttgg过过tg tctg过t过ttg gtccttggtc gctt过tgg过过 1801 CC过tc过gc过C过过ggtgggg过tgtc过tc过tg过g过过tg过tgg C过过gg过过etc过过tgtc过g过g 1861过ggcttgc过g过过g过C过ttg过tgctgcc过tc过过g过gg过tct C过g过tg过过gc过t过tg过过过tt 1921 gc过CtggsgC过t过t过过gg过过C过过CCgtg过g gee过ttg过Cg过g过ttgtgg过过gtccttctg 1981 g过g过过gg过g过 ctctg过gcgg 过g过tg过过ttc Cgtgctstst tgtctg过gtt tgttg过过过tt 2041 ccagctgaaa accgtgttgc tccttcaact ccagtaccag ccactgtttg a <210〉 2 〈211〉 <212> PRT 〈213〉GmFtsH2基因的核昔酸序列对应的氨基酸序列 〈400〉 2 1 maassaclvg nglstrgnri tlkkdfngrr ylysswrlsl Innnkaskaf sikasleqrq 61 eerrrgfIkl Ilgnlgvglp allgsgkaya deqgvsssrm sysrfleyld kdrvkkvdly 121 dngntavvea vspelgnrsq yvrvqlpgln qellqkfrek nidfaahspq eesgsllanl 181 ignlafplll igglfIlsrr sggmggpggp gfplafgqsk akfqmepntg vtfddvagvd 241 eakqdfmevv eflkkperft avgaripkgv Ilvgppgtgk tllakaiage agvpffsisg 301 sefvemfvgv gasrvrdlfk kakenapciv fvdeidavgr qrgtgigggn dereqtlnql 361 Itemdgfegn tgiivvaatn radildtall rpgrfdrqvt vdvpdirgrt eiIkvhasnk 421 kfdadvslev iamrtpgfsg adlanllnea ailagrrgrt aisskeidds idrivagmeg 481 tvmtdgksks Ivayhevgha icgtltpghd avqkvtlvpr gqargltwfi pnddptlisk 541 qqlfarivgg Iggraaeeii fgepevttga agdlqqitsl akqmvttfgm sdigpwslme 601 ps过qggdvim rmm过rnsmse rl过edid过过i krisde过yei 过Iehirnnre 过ideivevll 661 eketlsgdef railsefvei paenrvapst pvpatv
【主权项】
1. 一种用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，包含以下步骤： (1) 制备目的功能基因的多克隆抗体； (2) 利用蛋白质印迹法和荧光PCR检测该目的功能基因在不同逆境胁迫下的表达变化 情况，明确其与各种逆境的关系； (3) 利用同源克隆分离该基因。2. 根据权利要求1所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，还包括 以下步骤： 对所述步骤（3)中克隆得到的目的基因进行后续研究，明确其在相关逆境下的表达规 律和功能。3. 根据权利要求1或2所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述 目的基因为FtsH基因。4. 根据权利要求3所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述 FtsH基因的多克隆抗体通过以下步骤制备： 1) 根据保守区域设计两条多肽，序列如下： Pepl ：MFVGVGASRVRDLFRKAKENAPC Pep2 ：LGARPPRGVLLVGLPGTGKC ； 2) 合成步骤1)所述的多肽并分别与KLH偶联，得到偶联蛋白GmFtsH-KLH-1和 GmFtsH-KLH-2 ； 3) 分别用上述步骤中所得偶联蛋白对大白兔进行初次免疫，并进行3次加强免疫； 4) 对免疫后的大白兔行耳静脉取血，测定免疫效价； 5) 对免疫后的大白兔行颈动脉取血，离心收集多抗血清，分别收集两种多肽对应的多 克隆抗体。5. 根据权利要求3所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述步 骤（2)为：以分别在干旱、盐、冷害和大豆胞囊线虫四种胁迫下大豆的叶片为材料，提取大 豆蛋白，利用蛋白质印迹法和荧光PCR检测FtsH蛋白在上述各种胁迫下的表达情况。6. 根据权利要求3所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述同 源克隆步骤为：以盐处理的大豆叶片为材料提取RNA并反转录成cDNA，以所得的cDNA作为 模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物连接到T载体上进行测序验证。7. 根据权利要求3所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述同 源克隆步骤包括： 1) 引物设计，根据已经报道的FtsH基因序列，设计兼并引物； 2) 通过预实验确定引物序列； 3. PCR扩增， 反应体系：4 μ 1模板，4 μ 1浓度为2. 5 mM的三磷酸脱氧核苷酸，5 μ 1 10X的缓冲液， 5μ 1正向引物，5μ 1反向引物，0. 5μ 1浓度为5unit/y 1的聚合酶，26. 5μ 1 ddH20 ; 反应程序： 95。。，5 min ; 94°C，45 s，55°C，45 s，72°C，2min20 s;35 个循环； 72°C，10 min;PCR 产物回收； 4) 连接、转化， 连接：1 μ 1载体，3 μ 1酶切回收产物，5μ1连接酶混合物1 μ 1无菌水混匀，室温 反应30 min以上； 转化：取出一 80°C保存的感受态细胞，放在冰上缓慢解冻，将感受态细胞加入连接产 物中混匀，冰上放置30 min，然后42°C热激90 s，再冰浴2 min后，加入800 μ 1无抗性的 LB培养基，37°C培养45 min，5000 rpm离心3 min，弃大部分上清，留约100-150μ1，重悬菌 体，选择有相应抗性的LB平板，涂板，晾干，于37°C培养箱中倒置培养过夜； 5) 测序：选取PCR验证正确的克隆进行测序。8. -种根据权利要求1所述的方法克隆得到的基因，其特征在于该基因具有如SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。9. 根据权利要求8所述的基因，其特征在于：该基因的所述的核苷酸序列对应的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
【文档编号】C12N15/10GK105861633SQ201510023370
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月19日
【发明人】金勋
【申请人】金勋