一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用
【专利摘要】本发明公开一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用，涉及生物医学、电化学检测和单分子自组装领域。该芯片包括构建在芯片表面上的单分子自组装层，芯片表面具有芯片微孔；所述芯片微孔中分别固定有捕获探针和检测探针，所述捕获探针上捕获有病原菌16S rRNA靶分子；所述检测探针形成16S rRNA分子探针识别层。其有益效果在于：采用纳米金与单壁碳纳米管纳米复合物标记检测探针，利用生物素与亲和素高度专一和生物稳定性，用来连接探针和纳米复合粒子；细菌具有简单、迅速、检测成本低、灵敏度高的优点，为指导临床合理用药提供了强、有力的支持。
【专利说明】
-种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物巧片及其技术 应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物医学、电化学检测和单分子自组装领域，具体地说是一种检测尿 路病原菌ISSrRNA的电化学生物忍片及其技术应用。
【背景技术】
[0002] 尿路感染化rina巧化act Infections,UTI)是W膀脫刺激征，即尿频、尿急、尿 痛、甚至全身感染为临床特征的感染性疾病。UTI的易感因素和病因已经十分明确，即由病 原微生物(主要是细菌)入侵尿道而引发，绝大部分为革兰阴性杆菌，如大肠埃希菌、奇异变 形菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌。但UTI是一类发病率高而 临床医生较易忽视的疾病，临床症状不典型，容易复发，治疗不当极易造成耐药菌株的出 现，形成难治性尿路感染。由UTI引起的肾功能衰竭、高血压等疾病极大地降低了人们的生 活质量，给人们的生命健康带来了严重的危害，因此及时准确地诊治UTI尤其重要。
[0003] 目前UTI的诊断方法虽然较多，但尚无大家公认的简便、特异性高的有效方法。在 新近发展的多科学交叉检测体系中，电化学是其中的一种方法。既研究发生在两相界面处 伴随电荷转移现象的一口学科，基于电化学原理建立某一化学反应与电流响应的关系，通 过测量如电位、电流、电导或电量等物理量，求得物质的含量或考量。自组装技术作为一种 新型技术，在分子水平上设计分子的结构，具有灵敏度高、选择性好的优点，在电化学分析 领域得到了巨大的应用。
[0004] 目前，传统UTI的诊断方法检测时间长、成本高、操作繁琐，易发生交叉污染，假阳 性率高;可见基因忍片技术并未实现真正意义上的快速检测。
[0005] 综上所述，目前亟需一种对尿路感染病原菌快速检测的新方法，W实现对尿路感 染病原菌多通量、低成本、操作简易，检测快速，并能在普通实验室完成检测，更好地满足各 级医院的需要。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种检测尿路病原菌ISSrRNA的电化学生物忍片，另 一个目的是提供上述检测尿路病原菌电化学生物忍片的应用方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明所述一种检测尿路病原菌ieSrRNA的电化学生物忍片，包 括忍片，W及构建在忍片表面上的单分子自组装层，忍片表面具有忍片微孔;所述忍片微孔 中分别固定有捕获探针和检测探针，所述捕获探针上捕获有病原菌16S rRNA祀分子;所述 检测探针形成16S rRNA分子探针识别层，其实现步骤如下：
[000引a.在忍片表面构建单分子自组装层，进行活化单分子自装层；
[0009] b.捕获探针在忍片微孔中固定；
[0010] C.捕获探针捕获病原菌16S rRNA祀分子；
[0011] d.加入检测探针后，构建16S rRNA分子探针识别层；
[0012] e.通过电化学生物忍片将分子杂交信息W电子信号的形式输出；
[0013] f.加入辣根过氧化物酶W电子传递变化作为指示信号，实现对不同种类病原菌的 快速检测。
[0014] 所述忍片为一种基础界面，该基础界面的实现方法为：第一种就是在处理过程中 向忍片微孔加入了极少量的带负电荷的物质，在微孔中形成一个预先覆盖层，减少带负电 荷生物分子之间的非特异性反应;第二种化学试剂就是牛血清蛋白，它被加入到忍片微孔 中，牛血清蛋白能够包被自组装单分子膜层，通过减少电极表面的非特异性反应降低背景 信号，增强检测信号强度;第=种化学试剂是酪蛋白，和酶溶液一起混匀，酪蛋白的功能类 似于牛血清蛋白，但能够阻止酶和自组装单分子层链接，增强反应的特异性。
[0015] 所述单分子自组装层为11-琉基十一烧酸-BPA单分子自组装层。
[0016] 所述捕获探针在忍片微孔中的固定方法:①有机金属硫醇连接上有机复合物或者 在末端修饰上醇基后形成单分子层自组装层，该层具有抵抗蛋白质或核酸的沉积的功能， 同时可曝露出功能化的末端集团；单分子自组装层在生物交联剂和亲和素的共同作用能够 被活化;②在活化后的单分子自组装层表面，加入捕获探针。
[0017] 所述生物交联剂为邸C、N服中的一种。
[0018] 所述捕获探针和检测探针为针对6种尿路病原菌(大肠埃希菌、奇异变形菌、肺炎 克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌H6S rRNA的特异性核酸分子探针体 系，利用序列分析系统ARB(Software environment for sequence data)、NCBI(化tional Center of Biotechnology Information)和RDP-n:(The Ribosomal Database Project)信息系统进行6种尿路病原菌16S rRNA特异性核酸探针的初步筛选;探针系统设 计的区域选择如下：
[0019] 据文献（Soumitesh化akravorty,DanicaHelb,et al .JMicrobiol 化USTAL Methods.2007，69(2) :330-339):168 rRNA含有V1-V9九个高变区，运九个区保守与特异性 兼备，能够用于分子探针体系的构建。W大肠埃希菌为例，在大肠埃希菌16S rRNA的1540个 碱基中，选择适合于检测大肠埃希菌的V2与V3之间的保守序列区（242-433)设计检测探针， V3高变序列区（433-497)设计捕获探针。
[0020] WNCBI和RDP-II中为探针数据库源，分别输入6种尿路病原菌16S rRNA进行查询， 得到该6种尿路病原菌的16S rRNA序列，设定6种尿路病原菌的16S rRNA碱基序列范围，进 行FAST比较筛选。利用CLUSTAL X软件进行多序列对位排列，找出特异性最高的序列组合。
[0021] W大肠埃希菌为例(如图1)，在设计并筛选出的探针系列中，通过分子生物学方法 利用筛选出的特异性较高的探针对大肠埃希菌16S rRNA的检测，得到大肠埃希菌捕获探针 和检测探针。
[0022] 针对奇异变形菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌的检 测探针与捕获探针结构设计也是基于上述步骤，构建出常见尿路感染病原菌16S rRNA核酸 分子探针库。
[0023] 所述捕获探针为生物素化的捕获探针。
[0024] 所述检测探针为合成的生物素化DNA检测探针，所述合成的生物素化DNA检测探针 上设置有修饰层。
[0025] 所述检测探针上设置的修饰层为单壁碳纳米管-纳米金复合物;所述单壁碳纳米 管-纳米金复合物的制备方法为:首先制备出含有簇基端单壁层碳纳米管，再用次憐酸钢液 相还原方法制备纳米金溶胶;然后在制备出的径基化的纳米金溶胶中的金颗粒表面原位生 长单壁层碳纳米管层;最后利用溶剂萃取法去除有机模板剂，再经超临界干燥后制备出单 壁层纳米管-纳米金复合物。
[0026] 所述单壁层碳纳米管-纳米金复合物在合成的生物素化DNA检测探针上的修饰:生 物素-亲和素系统是级联放大检测信号的系统，亲和素的每个亚基含有一个与生物素结合 的位点，并与生物素或其衍生物形成高度稳定的复合物，其亲和常数为仅比一般的 共价键低一个数量级，但比抗原抗体反应高10-100万倍，结合快，呈不可逆反应，而且在 pH、溫度、有机溶剂或变性剂较大的变化范围内均能稳定存在；由于生物素亲和素系统之间 高度专一和强烈的相互作用，利用生物素(Biotin)-亲和素(Avidin)之间的特异性不但可 将单壁层碳纳米管-纳米金复合物和检测探针连接到一起，而且具有级联放大信号的作用。
[0027] 所述检测探针上标记有辣根过氧化物酶生物活性物质。检测探针与待检病原菌核 酸杂交后，在辣根过氧化物酶的催化与信号放大作用下，W电化学生物忍片表面各个反应 微孔电子传递变化作为指示信号，实现对不同种类病原菌的快速检测
[0028] 所述检测尿路病原菌电化学生物忍片的应用方法，如图7所示：
[0029] A.处理临床收集的尿液标本，裂解尿液中病原菌曝露出ieSrRNA序列；
[0030] B.忍片微孔中修饰有捕获探针，生物素化的检测探针将识别祀基因序列；
[0031] C.捕获探针将祀基因捕获，同时加入具有电化学信号放大作用的亲和素-辣根过 氧化物酶；
[0032] D.通过化学键的相互作用形成类"立明治"的辣根过氧化物酶-亲和素-生物素-分 子探针立体结构；
[0033] E.通过酶的电化学传递及信号放大作用，电化学忍片将分子杂交信息W可读的电 化学信号输出。
[0034] 生物传感界面在电化学电极阵列检测应用时的灵敏度和准确度上起着重要作用。 在金膜上构建的硫醇自组装单分子层是一种高度组织有序的分子层系统，能抵抗蛋白质或 核酸沉积及阻止生物分子间易于产生的非特异性杂交，含有功能化的末端基团，被广泛的 应用于电极表面修饰。
[0035] 细菌检测原理:常见的尿路感染病原菌，其特异性ieSrRNA和相应的探针杂交会产 生各自的特异性电流信号值，通过电流信号值的不同来区分感染菌种类。
[0036] 本发明所述一种检测尿路病原菌ieSrRNA的电化学生物忍片及其技术应用，其有 益效果在于:采用纳米金与单壁碳纳米管纳米复合物标记检测探针，利用生物素与亲和素 高度专一和生物稳定性，用来连接探针和纳米复合粒子;其中单壁碳纳米管作为电子储备 中屯、，金纳米粒子作为电子高速传输通道，两者结合能够提高分子探针的检测特异性与电 化学生物忍片传感阵列的整体性能;该忍片是基于电化学检测系统，得到原始的电流值和 分析浓度之间的定量关系，然后进行一系列电化学分析过程;细菌检测分析速度快，通过 对ieSrDNA基因保守区进行检测，能够早期、快速判断细菌存在与否及其类别，具有简单、迅 速、检测成本低、灵敏度高的优点，为指导临床合理用药提供了强、有力的支持。
【附图说明】
[0037] 图I为大肠埃希菌16S rRNA探针组合；
[0038] 图2为单分子自组装层结构示意图；
[0039] 图3为电化学生物忍片表面DNA分子识别层的构建；
[0040] 图4为纳米复合粒子修饰检测探针；
[0041] 图5中：A.电化学电极阵列经不同修饰后在TMB-出化溶液中的循环伏安图，扫速 50mV/s;B.电化学电极阵列经不同修饰后在TMB-出化溶液中的计时电流图；
[00创图6中:A.祀DNA分子不同浓度下的差分脉冲图（皿01凡）；B.祀DNA分子浓度与峰电 流值线性关系；
[0043] 图7为电化学生物忍片检测流程。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1
[0045] 1.尿液标本的收集及处理：
[0046] ①标本收集对象：
[0047] 医院口诊及住院尿路感染患者:随机抽样400例，年龄7-60岁。
[004引②处理方法：
[0049] 收集上述医院口诊及临床住院尿路感染患者的尿液，收集到的分离标本被装在含 有15%的甘油布鲁氏菌培养基小瓶中-70°C保存。过夜保存的标本在没有杂菌干扰的情况 下接种到LB培养基上去，在生长到对数期为止。正式使用前，将在LB上培养的尿液W冷冻小 管的形式储存在-70°C的环境中。
[0050] ③病原菌的快速检测：
[0051] a.在LB培养小管中尿液样本用离屯、机WlOOOX IOg离屯、5min，然后丢弃悬浮液，得 到细菌裂解液在含有ImoVl化0H，0.1 %TritonX-100，2mmol/l每升邸TA和含有Img/ml溶 解酵素的20mm〇Vl的TRIS-HCL，Ph8.0的溶液中室溫下解育5分钟；
[0化2] b. SOiil的含有2.5 %的牛血清蛋白和0.25皿〇1/1的检测探针的Imo Vl的憐酸盐 缓冲液，PH7.4,在65°C环境溫度下加入到细菌裂解液中解育lOmin，和祀探针完全杂交； [0053] C.4山的裂解菌液和检测探针的混合液然后加入到忍片中的工作电极上在65°C潮 湿条件下解育15min，等到被洗干净干燥后，4山的辣根过氧化物酶化RP)加到工作电极上解 育15min，在忍片被清洗和干燥后，把一个预先做好的塑料模具覆盖在忍片表面，同时把制 备好的SOiil催化溶液加入到各个微孔里面，一直到反应液把所有的电极都覆盖住，然后用 多通道恒电位仪检测16个微孔上的电化学反应信号，通过不同的输出电化学信号值来鉴定 不同的细菌种类。
[0054] 实施例2
[0055]如图5-6所示;在电化学电极阵列表面成功构建11-琉基十一烧酸-BPA单分子自组 装层后，分别向2、8、14、16号反应槽中加入化10.化111〇1/1的生物素化0臟检测探针，将电化 学电极阵列放入到充满氮气的解育盒中IOmin后取出，用PBS轻轻冲洗5s，分别再往2、8、14、 16号反应槽中加入1化O.Oljimol/UliiLO. 10皿〇1凡、1化0.05皿〇1几、1化0.03叫1〇1凡的 皿P-Avidin功能化的大肠杆菌DNA祀分子探针序列，然后将解育盒放入65°C水浴箱中充分 解育杂交40min后取出，用PBS缓冲液冲洗5s，迅速在2、8、14、16号反应槽中分别加入20化 TMB-出化溶液，放入读数器内进行检测。
[0056]在电化学电极阵列表面成功构建硫醇自组装单分子层的基础上修饰了 HRP-Avidin。分别采用循环伏安法和计时电流法对电化学电极阵列的生物功能化进行了研究， 其中6号反应槽电极为裸电极，其相对应反应曲线为(6)，当4号电极表面成功构建11-琉基 十一烧酸自组装单分子层后，反应曲线为(4)，与曲线(6)相比电流减小，2号电极表面构建 有11-琉基十一烧酸-BPA分子组装层，因为有大生物分子BPA的存在，曲线(2)电流明显的减 小。8号电极表面成功修饰上HRP-Avidin,曲线(8)反应电流明显增大，因为HRP催化出〇2产生 化氧化TMB，发生强烈的氧化还原反应而产生明显的电流变化。与循环伏安法相应的计时电 流检测曲线，其中（10)为裸电极在118-此〇2的计时电流曲线，（12)为构建11-琉基^^一烧酸 单分子自组装层后的反应曲线，（14)是构建有11-琉基十一烧酸一BPA分子组装层曲线， (16)为在分子自组装层修饰上HRP-Avidin的反应曲线。研究表明经生物功能化修饰后的电 化学电极阵列性能良好，10、12、14、16号电极的计时电流稳态值(单位：1X1(^5A)分别为 0.0051、0.3020、0.9640、1.0900，能检测出因构建和修饰不同生物大分子后电化学电极阵 列表面产生的1.26 X ICT6A电流变化。表1为常见尿路感染菌属及其16S rDNA相互补的探针 基因序列。
[0化7] 表1:
[005引常见尿路感染菌属及其ieSrDNA相互补的探针基因序列
[0化9]
【主权项】
1. 一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，包括芯片，其特征在于：在芯片表 面上构建单分子自组装层，芯片表面具有芯片微孔;所述芯片微孔中分别固定有捕获探针 和检测探针，所述捕获探针上捕获有病原菌16S rRNA靶分子;所述检测探针形成16S rRNA 分子探针识别层，其实现步骤如下： a. 在芯片表面构建单分子自组装层，进行活化单分子自装层； b. 捕获探针在芯片微孔中固定； c. 捕获探针捕获病原菌16S rRNA靶分子； d. 加入检测探针后，构建16S rRNA分子探针识别层； e. 通过电化学生物芯片将分子杂交信息以电子信号的形式输出； f. 加入辣根过氧化物酶以电子传递变化作为指示信号，实现对不同种类病原菌的快速 检测。2. 如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所 述芯片为一种基础界面，该界面的实现方法为：第一种就是在处理过程中向芯片微孔加入 了极少量的带负电荷的物质，在微孔中形成一个预先覆盖层，在我们先前的试验中已经证 实这种分子层能够减少带负电荷生物分子之间的非特异性反应;第二种化学试剂就是牛血 清蛋白，它被加入到芯片微孔中，牛血清蛋白能够包被自组装单分子膜层，通过减少电极表 面的非特异性反应降低背景信号，增强检测信号强度。第三种化学试剂是酪蛋白，和酶溶液 一起混匀，酪蛋白的功能类似于牛血清蛋白，但能够阻止酶和自组装单分子层链接，增强反 应的特异性。3. 如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所 述单分子自组装层为11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层。4. 如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所 述捕获探针在芯片微孔中固定方法:①有机金属硫醇连接上有机复合物或者在末端修饰上 醇基后形成单分子层自组装层，该层具有抵抗蛋白质或核酸的沉积的功能，同时可曝露出 功能化的末端集团；单分子自组装层在生物交联剂和亲和素三者的共同作用能够被活化； ②在活化后的单分子自组装层表面，在最优化条件下加入捕获探针。5. 如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所 述生物交联剂为H)C、NHS中的一种。6. 如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所 述捕获探针为生物素化的捕获探针。7. 如权利要求1所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所 述检测探针为合成的生物素化DNA检测探针，所述合成的生物素化DNA检测探针上设置有修 饰层。8. 如权利要求7所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所 述检测探针上设置的修饰层为:单壁碳纳米管-纳米金复合物;所述单壁碳纳米管-纳米金 复合物的制备方法为:首先制备出含有羧基端单壁层碳纳米管，再用次磷酸钠液相还原方 法制备纳米金溶胶;然后在制备出的羟基化的纳米金溶胶中的金颗粒表面原位生长单壁层 碳纳米管层;最后利用溶剂萃取法去除有机模板剂，再经超临界干燥后制备出单壁层纳米 管-纳米金复合物。9. 如权利要求8所述一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片，其特征在于：所 述检测探针上标记有辣根过氧化物酶生物活性物质。10. -种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片的应用方法，其特征在于： A. 处理临床收集的尿液标本，裂解尿液中病原菌曝露出16SrRNA序列； B. 芯片微孔中修饰有捕获探针，生物素化的检测探针将识别靶基因序列； C. 捕获探针将靶基因捕获，同时加入具有电化学信号放大作用的亲和素-辣根过氧化 物酶； D. 通过化学键的相互作用形成类"三明治"的辣根过氧化物酶-亲和素-生物素-分子探 针立体结构； E. 通过酶的电化学传递及信号放大作用，电化学芯片将分子杂交信息以可读的电化学 信号输出。
【文档编号】C12Q1/68GK105861646SQ201610116239
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月2日
【发明人】刘成桂, 林永红, 赵朝辉, 沈伟, 黄成 , 王秦, 王雪梅, 许健, 陈莉农
【申请人】成都市妇女儿童中心医院, 成都贝斯纳生物科技有限公司