一种用于凡纳滨对虾种质鉴定的分子标记组合及其应用
【专利摘要】本发明涉及水产动物遗传育种领域的种质鉴定技术，具体地说，一种用于凡纳滨对虾种质鉴定的分子标记组合及其应用。分子标记组合为13对高多态性微卫星位点的引物；利用所述13对高多态性微卫星标记建立了种质鉴定的方法，对现有国外进口种质包括但不限于正大品种、SIS品种、科拿湾品种(Kona Bay)、莫洛凯品种(Molokai)等，以及国内人工选育种质包括但不限于“科海1号”、“桂海1号”等品种进行微卫星分型，获得的分型数据构建不同种质资源的分子数据库，利用分子标记实现不同种质的鉴定。对于未知来源的凡纳滨对虾可以使用该panel分型后与已建立的不同种质资源的数据库进行比较，鉴定其种质来源。本专利提供了一种利用分子手段准确鉴定凡纳滨对虾不同种质材料的方法，对于不同种质溯源、评价、保护和利用具有重要的意义。
【专利说明】
-种用于凡纳滨对邮种质鉴定的分子标巧组合及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及水产动物遗传育种领域的种质鉴定技术，具体地说，一种用于凡纳滨 对邮种质鉴定的分子标记组合及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国的凡纳滨对邮最早由中国科学院海洋研究所的张伟权研究员于1988年从美 国夏威夷引进，由于该品种适于海水养殖，且经过淡化后可W在内陆淡水地区养殖，因此该 品种已经成为我国养殖规模最大的对邮品种，近几年养殖年产量达100多万吨，年产值逾 500亿元。
[0003] 农W种为先，良种同样也是整个凡纳滨对邮产业健康发展的基础。由于凡纳滨对 邮为引进品种，且在世界范围内广泛养殖，因此世界上从事该品种选育的公司较多，美国是 最早进行凡纳滨对邮良种选育的国家，早在上世纪80年代即开始进行凡纳滨对邮的良种选 育工作，另外泰国、墨西哥、W及我国的良种选育也已经取得了较多的成果。
[0004] 目前市面上的凡纳滨对邮商品种质来源有两种，一种是国外进口品种，另外一种 是国内自主选育品种。国外进口的品种引自美国对邮改良系统有限公司（SIS )、泰国正大h 蜂集国（CP )、美国科拿湾海洋资源公司化ona Bay )、美国莫洛凯亲邮公司(Mo 1 okai )、美国 普瑞莫亲邮公司（普瑞莫)等，国内选育品种中通过原良种委员会审定选育目前有五个，分 别为"科海巧"、"中科巧"、"中兴巧"、"桂海巧"、"壬海巧"。虽然不同品种各自具有其 特点，但是从表型上很难对不同品种进行区分。市面上从事凡纳滨对邮品种培育和育苗工 作的公司多且杂，由于现在尚未推行种质种苗认证制度，使得品种和苗种的真实性难W保 证，运就容易给品种培育公司、育苗场、养殖户带来诸多不便，市场上容易出现W甲进口品 种替代乙进口品种，或者非选育品种替代选育品种的情况，运严重扰乱了正常的市场经营 秩序，并且由于不同品种的苗种在苗期并没有明显的差异，但是在后期养殖过程中差异巨 大，养殖户在拿到劣质苗种后养殖效益会受到极大损失，因此对不同的凡纳滨对邮种质进 行鉴定十分必要。
[0005] 鉴于不同种质材料的表型差异小，因此只能通过分子手段对其进行鉴别，分子鉴 别技术主要基于RAPD、AFLP、SSR、SNP等标记技术，其中最成熟、应用范围最广的快速鉴定方 法是利用SSR标记进行检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是建立一种用于凡纳滨对邮种质鉴定的分子标记组合及其应用。
[0007] 为实现W上目的，本发明采用的方案为：
[000引一种用于凡纳滨对邮种质鉴定的分子标记组合，分子标记组合为13对高多态性微 卫星位点的引物
[0009]
[0010] -种用于凡纳滨对邮种质鉴定的分子标记组合的应用，所述分子标记组合在对不 同的种质材料进行微卫星分型、利用获得的微卫星分型数据构建不同种质资源的分子数据 库或不同种质分子鉴定中的应用。
[0011] 所述分子标记组合的分型方法:上述13个微卫星标记的正向引物进行FAM巧光标 记，使用标记后的引物扩增不同种质材料的DNA，产物使用ABI3730)(L遗传分析仪对13个位 点进行微卫星分型，分型结果使用Genmapper软件读取每个位点的分型数据。
[0012] -种构建不同种质资源的分子数据库的方法，获得每个种质材料利用权利要求1 所述13对高多态性微卫星位点的引物所得相应微卫星位点的分型数据，根据分型数据将相 同种质的材料标记为同一群体，不同群体的分型数据转换为Genpop格式后输入GenClass2 软件中，构建每个种质的"分子标记数据库"，之后将每种来源的种质材料个体作为"待归类 个体"导入GenClass2软件，即获得不同种质资源的分子数据库。
[0013] 利用所述建立的种质"分子标记数据库"在实现每种种质材料间鉴定的应用。
[0014] -种鉴定凡纳滨未知对邮材料种质来源的方法：
[001引（I)提取待分析个体材料的DNA;
[0016] (2)使用权利要求1所述微卫星标记组合对每个待分析个体进行微卫星分型，分型 结果使用Genmapper软件读取每个位点的分型数据；
[0017] (3)将待分析材料的分型数据导入GeneClass2软件，作为待归类材料，使用权利要 求3获得不同种质资源的分子数据库作为参考材料，运行GeneClass2获知待分析材料的种 质来源。
[0018] 具体地说是利用自主开发的13个高多态性微卫星标记建立了种质鉴定的方法，对 现有国外进口种质包括但不限于正大品种、SIS品种、科拿湾品种化ona Bay)、莫洛凯品种 (Molokai)等，W及国内人工选育种质包括但不限于"科海1号"、"桂海1号"等品种进行微卫 星分型，获得的分型数据构建不同种质资源的分子数据库，利用分子标记实现不同种质的 鉴定。
[0019]本发明的优点：
[0020] 本发明利用13对高度多态性的微卫星标记，建立一种用于凡纳滨对邮种质分子鉴 定方法，利用本发明方法可W实现凡纳滨对邮不同种质的准确鉴定。
[0021] 1.本发明克服了通过表型特征无法鉴别凡纳滨对邮种质的问题，为实现准确的种 质鉴定提供了一种方法。
[0022] 2.本发明提供的方法不受对邮生长W及发育时期的限制，即使是冷冻加工过后邮 仁也可进行鉴定，对于对邮产品的溯源具有重要作用。
[0023] 3.本发明中包含的微卫星标记均为=碱基重复微卫星位点，利于分型后的片段大 小判别，提高了微卫星分型的准确性。
[0024] 4.本发明提供的种质鉴定方法对保护育种企业、育苗企业和养殖户权益中具有重 要的作用。
【具体实施方式】：
[0025] 下面结合实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于W下的实施例内容。
[0026] 实施例1:通过微卫星标记组合鉴定凡纳滨对邮种质方法的开发
[0027] 1.材料来源:收集正大、科拿湾、SIS、莫洛凯、厄瓜多尔、科海1号、桂海1号的种质 材料，其中正大材料包括2012年、2014年两年的材料，科拿湾包括2012年、2014年和2015年3 年的材料，SIS包括2015和2016年两年的材料，桂海1号、科海1号、莫洛凯和厄瓜多尔为2014 一年的材料，样品总计192个。
[00%] 2.DNA提取:使用天根植物基因组提取试剂盒分别提取上述材料的DNA，方法参考 试剂盒说明书，提取的DNA使用化no化OP1000 (Thermo，美国）测定浓度后，置于-20度冰箱中 保存。
[00巧]3.将上述提取的DNA分别稀释至50-lOOngAil，使用本发明13对高多态性微卫星标 记引物进行PCR扩增，微卫星引物如下：
[0030]
[0031]
[0032]
[0033] PCR扩增程序:94度变性4分钟;如下进行35个循环:94度变性30秒，55度退火30秒， 72度延伸30秒;之后72度延伸10分钟。
[0034] 上述分别获得的扩增产物使用ABI PRISMTM 3730x1遗传分析仪（Genetic Analyzer)进行微卫星分型，分型结果使用Genmapper软件读取每个位点的分型数据。
[0035] 4.构建凡纳滨对邮种质资源的"分子标记数据库"，具体如下:记录下每个个体的 13个位点的分型数据，将相同种质的材料标记为同一群体，带有种群标记的192个个体数据 转换为Genpop格式后输入GenClass2软件中，构建每个种质的"分子标记数据库"，不同种质 的微卫星分型结果见附表1。
[0036] 5.将每种来源的种质材料个体作为"待归类个体"导入GenClass2软件，使用上述 建立的凡纳滨对邮种质"分子标记数据库"作为参考进行分析，查看每种来源个体鉴定的准 确率。结果显示正大品种的鉴定准确率为100 %，SI S品种的鉴定准确率为100 %，科拿湾品 种的鉴定准确率为94%，莫洛凯品种的鉴定准确率为100%，厄瓜多尔引进品种的鉴定准确 率为100%，科海1号品种的鉴定准确率为98%，桂海1号品种的鉴定准确率为100%，综合鉴 定准确率为98 %。
[0037] 实施例2:用于凡纳滨对邮种质分子鉴定方法的应用
[0038] 鉴于本发明建立的方法对于不同种质具有较高的鉴定准确率，因此可W使用本发 明的方法实现凡纳滨对邮不同种质的鉴定和未知来源材料的品种溯源。所提供的方案如 下：
[0039] 1.收集国内国际上不同商品种质公司的种质材料，每种来源种质的个体数在30个 W上，且尽量包含多代W及多个地区取样的材料。使用天根植物基因组提取试剂盒提取上 述材料的DNA，方法参考试剂盒说明书，提取的DNA使用Nano化OP1000 (Thermo，美国）测定浓 度后，置于-20度冰箱中保存。
[0040] 2.将上述提取的DNA分别稀释至50-lOOngAU，使用上述所述的panel的13对高多 态性微卫星标记引物对上述来源不同种质材料进行PCR扩增，扩增产物使用ABI PRISMTM 3730x1遗传分析仪(Genetic Analyzer)进行微卫星分型，分型结果使用Genmapper软件读 取每个位点的分型数据。
[0041 ] 3.构建每个种质资源的"分子标记数据库"，具体如下：记录下每个个体的13个位 点的分型数据，将相同种质的材料标记为同一群体，带有种群标记的所有个体数据转换为 Genpop格式后输入GenClass2软件中，构建每个种质的"分子标记数据库"
[0042] 4.对于未知来源的材料，通过该panel分析后获得分型结果，将结果进行格式转换 后导入GeneClass2软件作为"待归类个体"，使用步骤3建立的不同种质"分子标记数据库" 作为参考进行种质鉴定分析，查看结果文件获得该材料的种质来源信息。
[0043] 附表1:使用本发明微卫星标记组合对不同种质分型结果
【主权项】
1. 一种用于凡纳滨对虾种质鉴定的分子标记组合，其特征在于：分子标记组合为13对 高多态性微卫星位点的引物一柙?乂利妥豕1所还用tn纲浜对si卜柙质签足的分于称记組甘的应用，其特征在于： 所述分子标记组合在对不同的种质材料进行微卫星分型、利用获得的微卫星分型数据构建 不同种质资源的分子数据库或不同种质分子鉴定中的应用。3. -种构建不同种质资源的分子数据库的方法，其特征在于：获得每个种质材料利用 权利要求1所述13对高多态性微卫星位点的引物所得相应微卫星位点的分型数据，根据分 型数据将相同种质的材料标记为同一群体，不同群体的分型数据转换为Genpop格式后输入 GenClass2软件中，构建每个种质的"分子标记数据库"，之后将每种来源的种质材料个体作 为"待归类个体"导入GenClass2软件，即获得不同种质资源的分子数据库。4. 按权利要求3所述的构建不同种质资源的分子数据库的方法，其特征在于:利用所述 建立的种质"分子标记数据库"在实现每种种质材料间鉴定的应用。5. -种鉴定凡纳滨未知对虾材料种质来源的方法，其特征在于： (1) 提取待分析个体材料的DNA; (2) 使用权利要求1所述微卫星标记组合对每个待分析个体进行微卫星分型，分型结果 使用Genmapper软件读取每个位点的分型数据； (3)将待分析材料的分型数据导入GeneClaSS2软件，作为待归类材料，使用权利要求3 获得不同种质资源的分子数据库作为参考材料，运行GeneClaSS2获知待分析材料的种质来 源。
【文档编号】C12N15/11GK105861729SQ201610406687
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】于洋, 相建海, 李富花, 王全超, 张晓军
【申请人】中国科学院海洋研究所