具有增强的光合作用的植物及其生产方法
【专利摘要】公开了具有增强的光合作用的转基因植物。所述转基因植物是用编码异源碳酸氢盐转运体的转基因多核苷酸转化的。所述碳酸氢盐转运体可以来自藻类或蓝藻细菌物种。所述转基因多核苷酸包含在功能性植物启动子的控制下编码所述碳酸氢盐转运体的核酸序列并可选地包括与所述碳酸氢盐转运体异源的叶绿体被膜靶向肽。公开了形成转基因植物和转基因多核苷酸的方法。
【专利说明】具有増强的光合作用的植物及其生产方法
[0001] 相关申请的引证
[0002] 本申请要求于2013年12月31日提交的美国申请号61/922,141的优先权，将其公开 内容通过引证整体结合于此。
[0003] 政府支持声明
[0004] 本发明是部分W来自美国能源部的政府支持完成的。政府对本发明享有一定权 利。
[0005] 序列表
[0006] 通过引证结合在于此的序列表是作为ASCII文本文件W电子形式提交的，创建于 12/30/13,优先权信息更新于 12/23/2014,并且命名为"UMA0050PCT_sequence_ST25"。
技术领域
[0007] 本公开设及使用碳酸氨盐转运体增强植物中的光合作用的方法W增强期望的作 物属性的产量，包括生物质产量、种子产量、种子中的油含量、淀粉含量或薦糖含量。此外， 运些改变可W导致耐旱性增加。
【背景技术】
[000引作物生产力受限于许多因素，主要的因素是在光合作用过程中将光能量光化学转 化为固定碳的相对低效率。该低效率的主要促成原因是通过生产性光和路径固定C02和在 非生产性的光呼吸路径中固定02的酶，核酬糖-1,5-二憐酸簇化酶/加氧酶(rubisco)的双 重特异t生。（Whitney SM,Houtz RL,&Alonso H(2011)Adv曰ncin邑 our underst曰ndin邑曰nd capacity to engineer nature's CO2-sequestering enzyme,Rubisco.Plant Physiol 155(1):27-35.)0
[0009] 植物中的C4和CAM代谢的进化表明通过在rubisco处浓缩C〇2(即通过最小化光呼 吸作用)来增加生产性簇化酶活性与非生产性加氧酶的活性的比率显著地增加植物物种的 环境范围和生物质产量，最高达50% (Peterhansel C(2011)Best practice procedures for the establishment of a C4cycle in transgenic CSplants.J Exp Bot 62(9): 3011-3019.)。不幸地是，运些复杂的新陈代谢策略不会容易地转变为更普遍的C3作物种 类，因为它们依赖于不同的，细胞特异的叶绿体类型的详细解剖结构（例如C4代谢中的 Kranz解剖学)和生物起源(Peterhansel 2011)。增加光合效率的可替代策略为使用诱变策 略W增加作物物种中rubisco的簇化酶/加氧酶活性的比率。不幸地是，改变rubisco的酶性 质来实现运些目标是有挑战性的（Taniguchi Y,et al.(2008)0ve;rp;roduction of C4photosynthetic enzymes in transgenic rice pi曰nts:曰n approach to introduce the C4-like photosynthetic pathway into rice.J Exp Bot 59(7):1799-1809， Hibberd JM&Covshoff S(2010)The regulation of gene expression required for C4photosynthesis.Annu Rev Plant Biol 61:181-207.)。
[0010] 基于植物种子油的液体运输燃料(例如生物柴油和绿色柴油)作为环境、经济和技 术上可实行的石油来源燃料的替代物具有极大的潜力。植物种子油相比当前使用的作为燃 料源的源自玉米或甘薦的乙醇具有明显的优势。植物油可W直接用现有技术转化为燃料， 并且因此可W在几十年内替代很大部分的基于石油的燃料。源自种子油的生物燃料是最小 碳中性的。每年用由等量的固定C〇2组成的作物替代作为燃料消耗的生物质，并且由于较低 的硫和氮含量，来自生物燃料的排放是比柴油更清洁的。各种的含油种子作物是美国农业 的支柱，因此增加运些作物的耕作与现有的农业实践是很大程度上相适合的。
[0011] 基于生物油的生物燃料目前在美国代表相对小部分的可再生能源市场，在2001年 占5.1%的高速公路柴油市场并且在2015年仅计划达到6.8% (Tyson TK，Bozell J， Wallace R,Petersen E,&Moens L(2004)Biomass oil analysis:research needs and recommendations,National Renewable Energy Laboratory Technical Report,NREL/ TP-510-34796)。在美国目前的生产依赖于由食物油生产的传统方法繁育的作物物种(例如 大豆、葵花和油菜巧），并且因此如生物柴油的燃料主要是由食品工业的废产物生成的 (Tyson et al.2004)。因此，用于转化为生物燃料的油的产量相对较低。增加来自粮食作物 的种子油直接转换为燃料生产将直接与食物油生产相竞争，从而对食物油价格和可获得性 具有负面后果。增加生物油生产的第二个限制是油作物物种(大豆或油菜巧)相比其他用于 乙醇生产的商品作物（例如玉米或甘薦）较低的生产力（Johnston M,Foley JA Jolloway T,Kucharik C,Monfreda C(2009)Resetting global expectations from agricultural bio化els.化viron Res Lett 4(1))。因此，基于生物油的燃料的大量增加需要开发具有较 低农艺要求的，高生产力的专用含油种子作物。
[0012] 因此，存在对于具有增强的光合作用和/或作物产量的转基因植物及方法，W及用 于其中的增强植物中的光合作用和作物产量的组合物的需要。
【发明内容】
[0013] 本文公开了相比野生型植物，具有增强的光合作用的转基因植物。
[0014] 在实施方式中，该转基因植物包含异源碳酸氨盐转运体，其中该转基因植物具有 比不包含异源碳酸氨盐转运体的相同种类的野生型植物至少5%更高的C〇2同化速率。
[0015] 在实施方式中，转基因植物包含异源碳酸氨盐转运体，其中该转基因植物具有比 不包含异源碳酸氨盐转运体的相同种类的野生型植物至少5%更低的降低的蒸腾速率 (tr曰nspir曰tion r曰te)。
[0016] 在实施方式中，用包含与编码异源碳酸氨盐转运体的多核巧酸可操作地连接的可 植物表达的转录调节序列的重组DNA构建体来转化转基因植物。
[0017] 本文还公开了用于增强植物中的光合作用的方法和组合物。
[0018] 在实施方式中，重组体多核巧酸包含与可植物表达的转录调节序列可操作地连接 的编码异源碳酸氨盐转运体的核酸序列，其中编码碳酸氨盐转运体的核酸序列可选地进一 步可操作地连接至编码叶绿体被膜祀向肤的核酸序列。
[0019] 在实施方式中，生产具有增强的光合作用的转化植物的方法包括用公开的重组体 多核巧酸转化植物细胞；由该植物细胞生长植物直至植物产生种子；W及由其中与未表达 异源碳酸氨盐转运体的相应植物相比，光合作用增强的植物选择种子。
[0020] 当在W下部分中提供详细说明和实施例时，本发明的运些和其他实施方式、优势 和特征将变得显而易见。
【附图说明】
[0021 ]现在参考附图，其中，在多个附图中，相同的元素编号相同：
[0022] 图1示出了融合至蓝藻细菌BicA碳酸氨盐转运体(上部)或蓝藻细菌SbtA碳酸氨盐 转运体(下部）的atTic20转运肤（"atTic20TP" ;N端)和cMyc表位(C端）的示意图。
[0023] 图2示出了将或atTic20TP_BicA_cMyc体外引入分离的叶绿 体中。A.用于体外表达融合蛋白的质粒构建体，缩写为BicA/SbtA T7(pUC18)，表示BicA或 SbtA存在于质粒中。在图中，"T7启动子"表示T7隧菌体转录启动子；"lacOr表示乳糖操纵 子操纵序列；并且"17终止子"表示T7隧菌体转录终止子。B.体外表达和叶绿体蛋白引入试 验的缩略流程图。C.体外引入[ 35S]atTic20TP_BicA_cMyc融合蛋白的结果。用分离的叶绿体 在促进蛋白质引入的条件下溫育体外翻译的蛋白质（泳道1)。〇.体外引入[ 35S]atTic20TP_ SbtA_cMyc融合蛋白的结果。用分离的叶绿体在促进蛋白质引入的条件下溫育体外翻译的 蛋白质（泳道1)。蛋白质与叶绿体结合，并且部分处理为其成熟形式(泳道2)。引入之后用嗜 热菌蛋白酶处理叶绿体(泳道5-7)表明成熟形式已经引入。叶绿体分级为膜和基质部分表 明蛋白质局部化至叶绿体膜(比较泳道3至4与6至7)。
[0024] 图3示出了编码克隆为双运载体(binary vector) ,pEarleyGate 100(右侧）并且 用于亚麻莽的核转化的 atTic20TP_BicA_cMyc、atTic20TP_SbtA_cMyc、CCPl_cMyc 或 LCIA_ CMyc的单基因构建体的示意图。在运些图中，"KanK"表示卡那霉素抗性基因；"LB"表示T-DNA(转化DNA)左边界序列；"BaK"表示BASTA抗性基因；"35S"表示35S花挪菜花叶病毒启动 子；"0CS"表示章鱼碱合酶转录终止子;并且"RB"表示T-DNA右边界序列。
[0025] 图4示出了在分离的叶绿体中体外引入并局部化atTic20TP_SbtA_cMyCeA.将体外 翻译的[35s]atTic20TP_SbtA_cMyc或[35s]atTic20TP_BicA_cMyc融合蛋白（泳道 1)与分离 的叶绿体在促进蛋白质引入(import)的条件下溫育。两种蛋白质与叶绿体结合并且处理为 它们的成熟形式(泳道2)并与叶绿体膜结合(泳道3)。叶绿体分级分离(fractionation)为 全部的膜（泳道3)、基质（Shoma)(泳道4)、内包膜（inner enveIope)(泳道5)和类囊体膜 (泳道6)表明SbtA_cMyc或BicA_cMyc与内包膜（泳道5)的初级结合（primary association)。在可靠的内膜蛋白atTic20处分布无法分辨（第S子图（panel))，然而 Rubisco的小亚基唯一地W基质分离（第四子图）。8.叶绿体部分中每种引入的蛋白质相对 于总叶绿体中发现的量的分布的定量分析确定B i C A_cMy C或Sb t A_cMy C在内包膜中的局部 化。每种蛋白质从左到右，部分为:总体、膜、基质、内包膜和类囊体。
[0026] 图 5 示出了 atTic20TP_SbtA_cMyc、atTic20TP_BicA_cMyc、CCPl_cMyc 和 LCIA_cMyc Tl转化体的选择。A.来自在用BASTA处理之前的±壤上发芽的转化的亚麻莽的Tl种子的实 例。B.在用200mg/L的BASTA处理S次后的与A中相同的植物。BASTA抗性转化体是显而易见 的。C.移植的 BASTA 抗性品系的实例。D.代表性的 atTic20TP_SbtA_cMyc、atTic20TP_BicA_ cMyc、CCPl_cMyc和LCIA_cMyc Tl转化体的基于PCR的基因分型(genotyping)表明转基因的 存在。在野生型植物中没有检测到转基因。将扩增编码肌动蛋白的基因的引物用作PCR反应 的对照。
[0027] 图6示出了转化的亚麻莽中CCPl_cMyc或LCIA_cMyc的表达。将来自五周的T1CCP1_ cMyc转化体或TlLCIA_cMyc转化体的叶提取物通过SDS-PAGE解析(resolve)并用抗cMyc免 疫印迹W检测CCPl_cMyc(A)或LCIA_cMyc(B)蛋白质的表达。在每种构建体的五个独立的Tl 品系中而非在野生型提取物中W不同的表达水平检测到预测的分子大小的蛋白质。
[002引图7示出了用抗cMyc抗体免疫印迹W检巧化icA_cMyc(A)或SbtA_cMyc(B)的，来自 IOiig的魏豆叶绿体和5至30yg的亚麻莽叶绿体的总体(T)、膜(P)和可溶解的基质（S)部分的 结果的照片。
[0029] 图8示出了在表达CCPl_cMyc的亚麻莽T3纯合品系中植物C〇2同化作用、气孔下 (substomatal)C〇2浓度、气孔导度（stoma1:al conductance)和蒸腾作用的图。（A)在恒定的 400皿〇1/1112大气0)2和恒定光照下的0)2同化作用。（8)4中的植物的气孔下0)2浓度斯，（〇 来自A的C〇2同化作用与来自B的Ci的比率。（D)来自A的叶的气孔导度。化)来自A的叶在恒定 的50%湿度下的蒸腾速率。误差棒(error bar)代表平均值的标准误差。
[0030] 图9示出了当水在7天期间内保留时，37和50天的亚麻莽CCP1-20植物比较野生型 (野生型，wild type)的照片。
[0031] 图10示出了在亚麻莽CCP1-20和野生型(对照)植物W250ml/天或175ml/天诱水的 限制条件下叶含水量的图。诱水值对应于田地值(field value)的典型范围。符号**和*分 别表示在双尾t测试中P = O. Ol和P = 0.0 5处的显著性。
[0032] 图11示出了代表性的CCPl亚麻莽品系在受限的水处理下C〇2同化速率(A)和种子 产量(B)的图。种子产量量化为每株植物的种子重量。
[0033] 图12示出了 CCP1-20和野生型（对照）植物在不同的氮肥施加下氮利用效率(A)和 碳/氮比率(B)的图。
[0034] 图13示出了在不同的氮下生长的野生型(WT)亚麻莽和T3纯合CCPl亚麻莽的A/Ci 曲线。（A)在标明的不同的氮肥比率下生长的亚麻莽品系CCP1-20和野生型植物的A/Ci (净 0)2同化速率A相对于计算的气孔下C〇2浓度Ci)曲线。（B)WT亚麻莽和两种独立的表达CCP1_ cMyc的纯合CCPl_cMyc转化品系的A/Ci曲线。对每个散点图示出最佳匹配趋势线。在插图中 示出两种品系中CCPl_cMyc的表达水平。
[0035] 图14示出了来自在充足的氮的氮;标记为"标准溫室条件"）或减少的氮 (1化pm的氮)下生长的CCP1-20亚麻莽和野生型(对照)植物的种子产量的图。种子产量测量 为每株植物的总种子重量。每个样品代表平均最少10株植物。误差棒代表平均值的标准误 差。
[0036] 图15显示了来自田地测试的CCPl亚麻莽品系相对于野生型（对照)植物的生物质 产量数据。
[0037] 图16显示了来自田地测试的碳酸氨盐转运体品系相对于野生型（对照）植物的种 子产量数据。
[0038] 图17显示了来自田地测试的碳酸氨盐转运体品系相对于野生型（对照）植物的油 产量数据。符号*表示假设不等方差(unequal variance)的两个样品的t测试中P = 0.05处 的显著性。
[0039] 图18显示了 BicA或SbtA亚麻莽T3纯合品系和野生型(对照)植物中的植物C〇2同化 作用和内部[C02]的图。A.恒定的400皿ol/m 2大气C〇2和恒定光照下的C〇2同化作用.B.转基 因品系中的气孔下C〇2 (Ci)。C. C〇2同化作用与Ci的比率。光照水平是600皿01 Hf 2S-I。植物在 2加仑花盆中生长。在5周的植物上进行测量。误差棒代表平均值的标准误差。**和*分别表 示在双尾t巧聯中P = O. Ol和P = 0.0 5处的显著性。
【具体实施方式】
[0040] 本文公开了包含异源碳酸氨盐转运体的转基因植物。已经出乎意料地发现工程化 W包括外源碳酸氨盐转运体的植物示出了增强的碳光合捕获/固定速率。表达外源碳酸氨 盐转运体的植物展现出相对于野生型植物更高的C〇2同化速率。转基因植物还示出增加的 水和氮利用率和生物质生产的总体增加。公开的转基因植物表现出通过工程化增加 C〇2在 rubisco的可用性来增加作物生产力的潜力。
[0041] 由于将来自蓝藻细菌和其他生物体的C〇2浓缩机制的蛋白质引入植物，转基因植 物具有改善的通过光合作用固定碳的能力。例如，SbtA蛋白质是蓝藻细菌碳酸氨盐转运体， 其增加 C〇2可用性并适应于较低的C〇2。因此增大光合作用的产量可W增加作物产量。此外， 除可用于植物生长的固定碳的量增加之外，转基因植物还可W导致增加的氮利用率和减少 的需水量。
[0042] 蓝藻细菌和藻类进化出两种替代的高效碳浓缩机制(CCM) W增加簇化酶/加氧酶 的活性（Price GD, et al.(2013)J Exp Bot 64(3) :753-768. ,Meyer M&Griffiths H (2013)J Exp Bot 64(3) :769-786.)。第一种使用高亲合性的碳酸氨盐膜转运体W增加细 胞的HC03-1。第二种策略在蓝藻细菌中称为簇酶体并且藻类中称为淀粉核的微室内隔绝 rubisco与碳酸酢酶。肥化-由碳酸酢酶在微室中迅速转化为CO2W显著增加 rubisco处的C〇2 浓度，从而将碳同化增加几个数量级。
[0043] 近来的研究已经模型化植物细胞的内隔室内的二氧化碳传导。运些研究表明叶绿 体被膜在细胞内形成对C〇2扩散有显著抗性的阻隔化vans JR&Von Caemmerer 8(1996) Plant Physiol 110(2):339-:346.,Tholen D&Zhu XG(2011)Plant Physiol 156(1):90-105.)，由此限制叶绿体基质中由rubisco固定碳的速率化vans&Von Caemmerer 1996; Price GD,Badger MR,&von Caemmerer S(2011)Plant Physiol 155(1):20-26.)。在叶绿 体被膜中引入来自微生物和藻类CCM的碳酸氨盐转运体具有减轻该扩散阻隔的潜力。已经 在蓝藻细菌中确认了多个确定的且提出的肥化-转运体，包括化+协同转运体（sympoder) (BicA和SbtA)、ATP驱动的（BCTl)和NADPH驱动的（NDHU)吸收系统(Price GD,Badger MR, Woodger FJ,化ong BM(2008)J Exp Bot 59(7):1441-1461.)0
[0044] 此外，响应低CO2环境绿藻如莱茵衣藻表达诱导>1000倍的假定叶绿体H(XV转运 体。运些包括局部化在叶绿体被膜的LCIA和CCP巧日CCP2(CCPl/2)转运体(Miura K，et al. (2004)PlantPhysioll35(3):1595-1607;ChenZY，Lavi即eLL，MasonCB，&Moron巧JV (1997)Plant I%ysiolll4(l) :265-273. ;Spalding MH&Jef打巧 M(1989)Plant Physiol89 (I) :133-137. KLCIA是促进的阴离子转运体的甲酸盐/亚硝酸盐转运体家族的成员 (Mariscal V，et al.(2006)Protist 157(4) :421-433) eLCIA 在爪赡卵母细胞中的表达提 供了其用作低亲合性碳酸氨盐转运体的证据。也提出CCPl和CCP2用作碳酸氨盐转运体。它 们局部化在衣藻中的叶绿体被膜并且与线粒体载体蛋白的家族相关，包括ADP/ATP易位体 (translocatorKMoroney JV&Mason CB(1991)&n J Bot 69(5):1017-1024. ;Ramazanov Z,Mason CE,Geraghty AM,Spalding MH,&Moroney JV(1993)Plant Physiol 101(4): 1195-1199. )dCCP1和CCP2是96%-致的。它们的基因位于包括多个编码另外的CCM组分的 基因的基因簇内（Merchant SS, et al.(2007)Science 318(5848) :245-250.)。
[0045] 已经出乎意料地发现转基因植物中局部化至植物的叶绿体被膜的异源碳酸氨盐 转运体(例如来自蓝藻细菌或藻类)的表达导致转基因植物中光合作用水平的显著改善。
[0046] 本文公开了具有增强的光合作用的转基因植物。
[0047] 在实施方式中，该转基因植物包含异源碳酸氨盐转运体。在实施方式中，转基因植 物包含编码与可植物表达的转录调节序列可操作地连接的异源碳酸氨盐转运体的重组体 核酸序列，其中该核酸序列可选地进一步编码与异源碳酸氨盐转运体可操作地连接的叶绿 体被膜祀向肤。在实施方式中，用包含与编码异源碳酸氨盐转运体的多核巧酸可操作地连 接，和可选地与编码叶绿体被膜祀向肤的多核巧酸可操作地连接的可植物表达的转录调节 序列的重组DNA构建体来转化转基因植物。在运些实施方式的任一个中，表达的异源碳酸氨 盐转运体局部化至叶绿体被膜。
[0048] 在实施方式中，转基因植物具有比同样种类的野生型植物的C〇2同化速率至少 5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的C〇2 同化速率。在本文中野生型植物是指不包含异源碳酸氨盐转运体的植物。
[0049] 在实施方式中，转基因植物具有比同样种类的野生型植物的蒸腾速率至少5%、至 少10%、至少15%、至少20%或至少25%更低的蒸腾速率。
[0050] 在实施方式中，转基因植物具有比同样种类的野生型植物的种子产量至少5%、至 少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40或至少50%更高的种子产量。
[0051] 在实施方式中，转基因植物具有比同样种类的野生型植物的水利用率(W肥）至少 5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的WUE。
[0052] 在实施方式中，转基因植物具有比同样种类的野生型植物的氮利用率(N肥）至少 5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的NUE。
[0053] 在实施方式中，转基因植物具有比同样种类的野生型植物的成熟速率至少5%、至 少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的成熟速率。
[0054] 在本文中，"碳酸氨盐转运体"蛋白质是通过任何转运机制转运碳酸氨盐的蛋白 质。碳酸氨盐转运体的类别包括阴离子交换体和Na7HC〇3-i协同转运体。
[0055] 在任何公开的实施方式中，碳酸氨盐转运体可W是来自蓝藻菌的碳酸氨盐转运 体，例如BicA多肤或SbtA多肤，或来自藻类的碳酸氨盐转运体，例如CCPl多肤或LCIA多肤。 蓝藻菌可W是集胞藻，例如集胞藻（Synechococ州S)PCC6803,或聚球藻（Synechococcus)， 例如聚球藻P(X700。藻类可W是衣藻属，例如莱茵衣藻。
[0056] 为本发明的目的，"植物"是指所有植物界的高等和低等植物的种和属。该术语包 括成熟的植物、种子、芽和苗，W及部分、繁育材料、植物器官组织、原生质体、愈伤组织和其 他培养物，例如源自他们的细胞培养物，W及所有其他给出功能或结构单元的植物细胞的 组的种类。成熟的植物是指处于任何超过苗的发育阶段的植物。苗是指处于早期发育阶段 的幼小、不成熟的植物。
[0057] "植物"包括所有一年生和多年生的单子叶或双子叶植物并且包括(举例来说，但 不限于)南瓜属、菩薇属、葡萄属、胡桃属、草替属、莲属、首猜属、红豆草属、=叶草属、胡卢 己属、班豆属、相枯属、亚麻属、天竺葵属、木馨属、胡萝h属、拟南芥属、芸苔属、萝h属、芥子 属、颠茄属、辣椒属、曼巧罗属、赏窘属、番茄属、烟草属、轮螺属、矮牵牛属、毛地黄属、牛至 属、菊宦属、向日葵属、窝宦属、雀麦属、天口冬属、金鱼草属、宣草属化eterocallis)、龙面 花属(Nemesia)、天竺葵属、泰属(Panieum)、狼尾草属、毛赏属、千里光属、蝴蝶花属、黄瓜 属、紫水晶属(Browallia)、大豆属、魏豆属、菜豆属、黑麦草属、稻属、玉蜀泰属、燕麦属、大 麦属、黑麦属、小麦属、高梁属、云杉属和白杨属的那些。
[0058] 优选的植物是来自W下植物家族的那些:宽科、菊科(Asteraceae)、芸苔科、石竹 科、襲科、菊科(Composi化e)、十字花科、葫芦科、唇形科、豆科、蝶形花科、百合科、亚麻科、 锦葵科菩薇科、茜草科、虎耳草科、玄参科、茄科、梧桐科、番杏科、山茶科、伞形科。
[0059] 本发明可W特别有利地应用与双子叶植物生物体。优选的双子叶植物具体选自双 子叶作物植物如，例如菊科(Asteraceae)如向日葵属、万寿菊属或金盏花属及其他；菊科 (Compositae),具体地窝宦属，非常具体地栽培属(窝宦)及其他;十字花科，具体地芸苔属， 非常具体地油菜属（油巧油菜）、芸苔中（campestris)(甜菜）、oleracea CV Tastie(卷屯、 菜）、oleracea CV Sonwball W菜花）和oleracea CV Emperor(花挪菜）和其他甘蓝类；W 及拟南芥属，非常具体地南芥属(thaliana)，和水芹或卡诺拉(canola)及其他;葫芦科如甜 瓜、南瓜(pumpkin)/南瓜（squash)或西葫芦及其他;豆科，具体地大豆属，非常具体地大豆 属(max) (soybean)、黄豆，和首猜、魏豆、菜豆(bean)或花生及其他;茜草科，优选地唇形亚 纲如，例如阿拉比卡咖啡（Coffea arabica)或大果咖啡（Coffea Iiberica)(咖啡树)及其 他;茄科，具体地番茄属，非常具体地西红柿(esculentum)属（西红柿（西红柿））、茄属，非常 具体地马铃馨（tuberosum)属（马铃馨（potato))和茄子(melongena)(茄子(aubergine)) W 及辣椒属，非常具体地辣椒(annuum)属(辣椒(pepper))和烟草或红辣椒及其他;梧桐科，优 选地五哑果亚纲如，例如可可（Theobroma cacaoK可可树)及其他；山茶科，优选地五哑果 亚纲如，例如野茶树(Camellia sinensis)或茶树(Thea sinensis)(茶树（tea shrub))及 其他;伞形科，具体地胡萝h属(非常具体地胡萝Kcarota)属（胡萝K胡萝h))和芹属（非常 具体地堇（graveolens dulce)(芹菜））及其他；W及亚麻巧、棉花、大麻、亚麻、黄瓜、渡菜、 胡萝K糖甜菜和各种树木、坚果和葡萄藤属，具体地香蕉和奇异果。
[0060] 还包括有观赏植物，实用或观赏树木、花弁、插瓶花、灌木或草皮。可W提及的植物 为(举例来说但不限于)被子植物、苔薛植物如，例如苔类(liver flower)和薛类(苔薛）；藤 类如羊齿、马尾和石松;裸子植物如松柏类、苏铁类、银杏和买麻腾(Gnetatae),菩薇科的家 族如玫瑰，石南科如杜酷花属(rhododeiKlron)和杜酷花(azalea)，大戟科如一品红和己豆， 石竹科如石竹花，茄科如矮牵牛花，苦宦苔科如非洲紫宦苔，凤仙花科如含羞草，兰科如兰 花，尊尾科如唐富蒲(gladioli)、尊尾花、小苍兰和番红花，菊科如金盏花，牛儿苗科如天竺 葵，百合科如龙血树(化acena)，桑科如无花果，天南星科如龟背竹和许多其他。
[0061] 用于转化特别感兴趣的是油类作物植物的植物。油类作物植物被理解为是含油量 是自然地较高和/或其可W用于油类的工业生产的植物。运些植物可W具有高含油量和/或 特定的在工业上感兴趣的脂肪酸成分。优选的植物是具有至少按重量计1%的脂质含量的 那些。油类作物包括，举例来说:玻璃宦(Borago Officinalis)(玻璃宦(borage));亚麻莽 属(亚麻莽）；芸苔属如芸苔、欧洲油菜(B.napus)、宪菁、埃塞俄比亚芥(B.carinataK芥末、 油巧油菜或宪菁油菜）；大麻（Cannabis sativa)(大麻（hemp));红花（Carthamus t i nc tori us)(红花（safflower));挪子（Co COS nucifera)(挪子（CO conut));海甘蓝 (化ambe abyssinicaK两节莽）；專距花属（产生中链长度，特别是用于工业应用的脂肪酸 的專距花属物质）；非洲油栋桐化Iaeis guinensis)(非洲油栋桐(A打ican oil palm));美 洲油栋桐（美洲油栋桐(American oil palm));大豆(Glycine max)(大豆（soybean));陆地 棉（美洲棉）；海岛棉（埃及棉）；草本棉（亚洲棉）；向日葵化eIianthus anmms)(向日葵 (sunflower));亚麻（Linum usitatissimum)(亚麻半子或亚麻（flax));月见草（Oenothera biennis)(月见草（evening primrose));油橄揽（橄揽）；水稻（0;ryza sativa)(水稻 (rice));篇麻（Ricinus communis)(藍麻（castor));芝麻（Sesamum indicum)(芝麻 (sesame));小麦属(小麦）；玉米属(玉米），和各种坚果属诸如，例如胡桃或扁桃。
[0062] 亚麻莽属，通常称为亚麻莽，是欧洲的地中海区域和亚洲当地的，并且看起来特别 适应于冷半干旱气候区域(干草原和大草原）。亚麻莽属在历史上作为含油种子作物培养W 生产植物油和动物饲料。其已经引入加拿大的高原区域和美国的部分作为工业的含油种子 作物。由于其种子的高含油量(~35%)、其抗冻性、短生产周期(60-90天)和抗虫性，其是用 于增强光合作用W改善其作为生物燃料的生产来源的潜力的感兴趣的目标。
[0063] 本文还公开了重组体多核巧酸，包含与可植物表达的转录调节序列可操作地连接 的编码碳酸氨盐转运体的核酸序列，其中编码碳酸氨盐转运体的核酸序列可选地进一步可 操作地连接至编码叶绿体被膜祀向肤的核酸序列。
[0064] 在一些实施方式中，编码碳酸氨盐转运体的核酸序列进一步包含编码表位标记的 序列，W帮助表达的碳酸氨盐转运体的亲合性捕获或局部化。表位标记是，其中将已知的表 位借助遗传工程融合至重组体蛋白质的技术。第一个可商购的表位标记最初是设计用于蛋 白质纯化的。此外，通过选择可获得对其的抗体的表位，该技术使得可W检测不可获得对其 的抗体的蛋白质。表位标记的另外的实例包括FLAG、6X化S、谷脫甘肤-S-转移酶(GST)、HA、 cMyc、AcV5或串连亲和纯化表位标记。
[0065] 可W由其获得碳酸氨盐转运体基因的种类的实例包括东方曲壳藻、阿格藻属、透 明虽形藻（Amphiprora hyaline)、咖啡形双眉藻、咖啡形双眉藻线型变属（Amphora coffeiformis var.linea)、咖啡形双眉藻点状变属（Amphora coffeiformis var .punc1:a1:a)、咖啡形双眉藻盾状变属（Amphora coffeiformis var. taylori)、咖啡形双 眉藻薄状变属(Am地ora coffeiformis var.tenuis)、优美双眉藻、优美双眉藻头状变属 (八111口110^(1日1；[。日1：133；[1]1日￥日1'.。日9；[1日1：日）、双眉藻属、鱼腥藻、纤维藻、镶型纤维藻、布朗尼 葡萄藻、包特氏菌属、丛粒藻、葡萄藻（BotiTococcus sudeticus)、片球藻、Bracteococ州S medionuc Ieatus、四鞭藻、纤细角毛藻、牟勒氏角毛藻、牟勒氏角毛藻广盐变属 (畑aetoceros muelleri var.subsalsum)、角毛藻属、具孔衣藻、小球藻（畑lore Ila 曰nitr曰t曰）、小球藻（Chlorell曰曰nt曰rctic曰）、小球藻（Chlorell曰曰ureoviridis)、小球藻 (加 Iorella Candida)、小球藻（加 Iorella capsulate)、干枯小球藻（加 lore Ila desiccate)、楠圆小球藻、浮水小球藻、融合小球藻（畑IorelIa fuse a)、小球藻变属 (畑Iorella fusca var.vacuolata)、小球藻（畑Iorella glucotropha)、水溪小球藻 (Chlorella infusionum)、水溪小球藻海岸变属（Chlorella infusionum var.actophila)、7jC溪小球藻变属（Chlorella infusionum var.auxenophila)、小球藻 (Chlorella kessleri)、小球藻（Chlorella lobophora)、小球藻（Chlorella luteoviridis)、小球藻变属（Chlorella Iuteoviridis var.aureoviridis)、小球藻变属 (Chlorella luteoviridis var. lutescens)、小球藻（Chlorella miniata)、小球藻 (Ch Iorella minutissima)、小球藻（Chlorella mu tabilis)、小球藻（Chlorella nocturna)、小球藻（化Iorella ovalis)、小球藻（Qilorella parva)、嗜光小球藻、小球藻 (Chlorella pringsheimii)、原始小球藻、原始小球藻酸居变属、规则小球藻、规则小球藻 极小变属、规则小球藻变属（化lore Ila regular is var .umbricata)、小球藻（Qilore Ila re isiglii)、嗜糖小球藻、海洋小球藻楠圆变属、海水小球藻、单纯小球藻、耐热性小球藻、 小球藻属、球抱小球藻、小球藻(ChlorelIa Stigmatophora)、万尼氏小球藻、普通小球藻、 小球藻(化IorelIa vulgaris fo.T&rtia)、普通小球藻自养变属、普通小球藻绿色变属、普 通小球藻普通变属、普通小球藻变属（Qilorella vulgaris var.vulgaris fo.Te;rtia)、普 通小球藻变属（畑Iorella vulgaris var.vulgaris fo.Viridis)、小球藻（化Iorella xanthella)、小球藻（Chlorella zofingiensis)、小球藻（Chlorella trebouxioides)、普 通小球藻、水溪绿球藻、绿球藻属、绿梭藻、蓝隐藻、金球藻属、卡氏球巧板藻属、隐甲藻、隐 藻属、隐秘小环藻、梅尼小环藻、小环藻属、衣藻（化1日1117(101]1〇]1日8 1]1〇6?〇13；[；0、莱茵衣藻、衣 藻属、杜氏藻属、杜氏藻化unaliella bardawil)、杜氏藻(Dunaliella biocula1:a)、颗粒杜 氏藻(DunalielIa granulate)、海生杜氏藻、微小杜氏藻、己夫杜氏藻、杜氏藻(DunalielIa pei;rcei)、杜氏藻化unaliellap;rimolecta)、盐生杜氏藻（Dunaliellasalina)、陆生杜氏 藻（DunalielIa terricola)、杜氏藻（DunalielIa tertiolecta)、绿色杜氏藻、杜氏藻 (Dunaliella tertiolecta)、绿色独球藻、独球藻属、后棘藻属、裸藻属、披刺藻属、克罗脆 杆藻、脆杆藻属、蓝股藻属、丝藻属、雨生红球藻、膜胞藻属、等鞭金藻（Isochry sis aff .Galbana)、等鞭金藻（Isockrysis ga化ana)、麟孔藻、微星藻、微星藻、微小单针藻、单 针藻属、保囊菌属、盐生微绿球藻、微绿球藻、截形舟形藻、舟形藻（Navicula biskanterae)、舟形藻（Navicula pseudotenelloides)、具膜舟形藻（Navicula pelliculosa)、腐生舟形藻、舟形藻属、肾鞭藻属、肾鞭藻属、普通菱形藻、亚历山大菱形藻、 新月菱形藻、普通菱形藻、细端菱形藻、碎片菱形藻、汉氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、 小头菱形藻、微小菱形藻、楠圆微小菱形藻(NitzscMa pusilla elliptica)、微小菱形藻 (Nitzschia pusilla monoensis)、四边微小菱形藻（Nitzschia quadrangular)、菱形藻 属、掠鞭藻属、小卵囊藻、卵泡藻、卵囊藻属、沼泽颤藻、颤藻属、亚短颤藻(颤藻SiAbrevis)、 类小球藻(ParachlorelIa kessleri)、嗜酸盐藻(Pascheria acidophila)、己夫藻属、S角 褐指藻、隧菌体、席藻属、扁藻属、颗石藻（Pleurochrysis carter ae)、颗石藻 (Pleurochiysis dentate)、颗石藻属(Pleurochrysis sp.)、威克海姆原壁藻(Prototheca wickerh am ii)、原壁藻（Prototheca stagnora)、波多黎各原壁藻（Prototheca portoricensis)、原壁藻(Prototheca moriformis)、饶氏原壁藻(Prototheca zopf ii)、7jC 生假小球藻（Pseudochlorella aquatica)、塔胞藻（Pyramimonas sp.)、桑甚藻、不透明红 球菌、绿球藻（Sarcinoid chrysophyte)、被甲栅藻、裂殖壶菌、水棉、纯顶螺旋藻、裂丝藻 属、集球藻属、集胞藻、万寿菊、孔雀草、四角藻、四片藻属、瑞典四片藻、威氏海链藻W及鲜 绿球藻(Viridiella fridericiana) 0
[0066]在一些实施方式中，碳酸氨盐转运体来自蓝藻菌并且编码蓝藻细菌碳酸氨盐转运 体的核酸序列进一步包含编码与碳酸氨盐转运体编码序列可操作地连接的叶绿体被膜祀 向肤的序列。蓝藻菌的实例包括集胞藻属，例如集胞藻属PCC6803和聚球藻属，例如聚球藻 P(X7002。在本文中"叶绿体被膜祀向肤"是指当嵌合体蛋白表达自核基因组时，可W祀向包 括该肤的嵌合体蛋白至叶绿体被膜，如叶绿体内包膜的肤序列。适合的叶绿体被膜祀向肤 的实例包括叶绿体被膜膜蛋白的前体的转运肤，例如拟南芥atTic20前体（Uniprot Q8GZ79,版本52;NP_171986.3)的转运肤(aa 1-110);叶绿体丙糖憐酸醋/憐酸醋易位体前 体的转运肤，例如魏豆叶绿体憐酸丙糖醋/憐酸醋易位体前体化niprot P21727,版本73)的 转运肤(aa 1-72);拟南芥白化属或浅绿突变型1蛋白（GenBank登录号BAB62076.1的氨基酸 1-51)的转运肤，或莱茵衣藻CCPl前体或LCIA前体的转运肤。
[0067] 蓝藻细菌碳酸氨盐转运体可W是依赖化+的肥03-转运体，例如BicA多肤或SbtA多 肤。BicA在海洋蓝藻细菌的基因组中广泛表现并且属于许多细菌中的目前注释为硫酸盐转 运体或透性酶的真核和原核转运体的大家族(SulP家族）。
[0068] 在一些实施方式中，碳酸氨盐转运体来自藻类。藻类可W是衣藻属或任何下表1和 2中列举的藻类。衣藻属可W是，例如莱茵衣藻。藻类碳酸氨盐转运体可W是CCPl多肤或 LCIA多肤.
[0069] 在实施方式中，碳酸氨盐转运体包含集胞藻属PCC6803的SbtA基因（核巧酸序列， 沈Q ID NO: 1，登录号NC_000911.1，区域：1600659.. 1601783 ;GI: 16329170;多肤序列，SEQ ID ^:2，登录号邮_441：340.1)。
[0070] 在实施方式中，碳酸氨盐转运体包含聚球藻属PCC7002的BicA基因（核巧酸序列， 沈QIDN0:3，登录号NC_010475.1，区域：2452833..2454533);多肤序列，SEQIDN0:4，登 录号 YP_001735604.1)。
[0071] 在实施方式中，碳酸氨盐转运体包含莱茵衣藻的CCPl基因（核巧酸序列，SEQ ID N0:5,登录号XM_001692145.1的编码序列）；多肤序列，SEQ ID N0:6,登录号XP_ 001692197.Do
[0072] 在实施方式中，碳酸氨盐转运体包含莱茵衣藻的LCIA蛋白基因（核巧酸序列，SEQ ID N0:7,登录号XM_001691161.1的编码序列）；多肤序列，SEQ ID N0:8,登录号XP_ 001691213.Do
[0073] 只要碳酸氨盐转运体具有碳酸氨盐转运体活性，碳酸氨盐转运体包括与SbtA、 BicAXCPl或LCIA同源的碳酸氨盐转运体。"同源物"是用于本领域的统称术语，表示拥有与 对象序列高度的序列相关性的多核巧酸或多肤序列。运种相关性可W通过确定比较的序列 之间一致性和/或相似性的程度来量化。落在该统称术语内的是术语"直系同源物 (odholog)"，意指是另一物种的多核巧酸或多肤的功能等效物的多核巧酸或多肤，W及 "横向同源物(paralog)"，意指当认为在相同的物种内时，功能上类似的序列。存在于相同 的物种中的横向同源物或其他物种中的碳酸氨盐转运体基因的直系同源物可W通过在本 领域中众所周知的分子生物技术，不用过度的实验而容易地识别。如在本文中使用的SbtA、 BicA、CCPl或LCIA分别指訊tA、BicA、CCPl或LCIAW及它们的同源物和直系同源物。
[0074] 具有与莱茵衣藻CCP1、莱茵衣藻LCIA、聚球藻属PCC7002BicA或集胞藻属 PCC6803SbtA显著的相似性，适用于实施公开的方法W生成具有增强的光合作用的转基因 植物的已知的编码序列和/或蛋白质序列在下表1-4中列出。对于莱茵衣藻CCPl或莱茵衣藻 LCIA，运些编码序列和蛋白质序列是通过用适当的查询序列的GenBank的tBLASTN捜索确定 的，如表1-2中所示。表1-2中仅示出具有<E-10的E值的序列。对于聚球藻属PCC7002BicA或 集胞藻属PCC6803SbtA，蛋白质序列是通过用适当的查询序列的GenBank的BLASTP捜索确定 的，如表3-4所示。在表3和4中仅分别示出具有与聚球藻属PCC7002BicA或集胞藻属 PCC6803訊tA>60%的氨基酸序列一致性的序列。
[0075] 表1.使用莱茵衣藻CCPl蛋白的登录号XM_001692145由GenBank的tBLASTN捜索确 定的示出与莱茵衣藻CCPl显著的相似性的DNA和蛋白质序列。 「nn7Al
[0116]
[0117] 如在本文中使用的两种氨基酸序列或两种核酸序列的"百分比同源度"是使用 Karlin and Altschul(1990)Proc.化tl.Acad.Sci. ,U.S.A.87:2264-2268的算法确定的。 运样的算法被结合在Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol. 215:403-410的NBLAST和XBLAST 程序中。用NBLAST程序，分数=100，字长12进行BLAST核巧酸捜索W获得与本发明的核酸分 子同源的核巧酸序列。用XBLAST程序，分数= 50,字长=3进行BLAST蛋白质捜索W获得与参 照多肤(例如SEQ ID N0:5)同源的氨基酸序列。为获得间隙比对(gapped alig皿ent)用于 比较目的，如在Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述的利用 间隙化AST(gapped BLAST)。当利用化AST和间隙化AST程序时，通常使用默认参数（见 http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
[0118] 此外，包括基本与编码SbtA、BicA、CCPl或LCIA多肤的多核巧酸相同的多核巧酸。 "基本上相同"是指具有与参照氨基酸或核酸序列的序列至少约85%，具体地约90%，并且 更具体地约95%或更多相同的序列的多肤或多核巧酸。对于多肤，参照多肤序列的长度通 常为至少约16氨基酸，或具体地至少约20氨基酸，更具体地至少约25氨基酸，并且最具体地 至少约35氨基酸。对于核酸，参照核酸序列的长度通常为至少约50核巧酸，具体地至少约60 核巧酸，更具体地至少约75核巧酸，并且最具体地至少约110核巧酸。
[0119] 通常，可W通过杂交确认同源序列，其中杂交处于严格的条件下。使用严格杂交 (即洗涂核酸片段两次，其中每次洗涂为用2X氯化钢和巧樣酸钢(SCC缓冲液；1.150mM氯化 钢和15mM巧樣酸钢，pH 7.0)和0.1 %十二烷基硫酸钢(SDS)在室溫下30分钟，随后在50°C下 用2X SCC和0.1 %SDS洗涂一次30分钟;并且然后洗涂两次，其中每次洗涂为用2XSCC在室溫 下10分钟），可W确定包含最多约25至约30%的碱基对错配，或约15至约25%的碱基对错 配，或约5至约15 %的碱基对错配的同源序列。
[0120] 编码SbtA、BicA、CCPl或LCIA多肤序列的多核巧酸允许制备具有特异地杂交至运 种基因序列的能力的相对短的DNA(或RNA)序列。较短的核酸序列可W用作在给定的样品中 检测互补序列的存在的探针，或可W用作引物W检测、扩增或突变编码SbtA、BicA、CCPl或 LCIA多肤的DNA序列的限定片段。用于杂交研究的核酸序列长度可W大于或等于约14核巧 酸W保证片段有足够长度形成稳定的和选择性的双链分子。例如，通过直接由化学方法合 成片段，通过应用核酸复制技术，如PCR技术，或通过由含有适当的插入物和适合的限制位 点的重组质粒剪切选定的核酸片段来制备运种片段。
[0121] 术语碳酸氨盐转运体包括编码訊tA、BicA、CCPl或LCIA多肤或含有置换、插入或删 除多肤主链的全长蛋白质的多核巧酸。相关的多肤通过将同源度分配给各种删除、置换和 其他修改来与SbtA、BicA、CCPl或LCIA比对。同源性可W沿着整个多肤或多核巧酸，或沿着 连续残基的子集确定。百分比相同性是当比较两个序列时氨基酸或核巧酸相同的百分比。 相似性百分比是当比较两个序列时氨基酸或核巧酸化学上类似的百分比。訊tA、BicA、CCPl 或LCIA与同源的多肤优选地是大于或等于约75%、优选地大于或等于约80%，更优选地大 于或等于约90 %或最优选地大于或等于约95 %相同的。
[0122] 例如，可W通过常规的位点定向诱变多核巧酸(其是用于程序地确定分子的残基 功能上重要与否的一个途径），由随机突变、由化学合成或由多肤的化学品或酶切割来产生 同源的多肤。
[0123] 在多肤序列与参照序列小于100%相同的情况下，不相同的位置优选地但并非必 要地为参照序列的保守置换。保守置换通常包括在W下的组内的置换:甘氨酸和丙氨酸;鄉 氨酸、异亮氨酸和亮氨酸;天冬氨酸和谷氨酸;天冬酷胺和谷氨酷胺;丝氨酸和苏氨酸;赖氨 酸和精氨酸；W及苯丙氨酸和酪氨酸。
[0124] 在认为特定的多肤具有与限定长度的参照多肤特定的百分比相同性时，该百分比 相同性是相对于参照肤。因此，50%相同于100氨基酸长的参照多肤的肤可W是完全相同于 参照多肤的50氨基酸长的部分的50氨基酸多肤。其也可W是在参考多肤的整个长度上50% 与其相同的100氨基酸长的多肤。当然，许多其他的多肤符合该标准。
[01巧]在本文中设及SbtA、BicA、CCPl或LCIA的核巧酸或氨基酸序列也包括设及运些序 列的自然存在的变体。不同于SEQ ID N0:l、3、5或7(核巧酸)和2、4、6或8(氨基酸)并且保持 生物功能的非自然存在的变体也包括在本文中。优选地，该变体包含具有保守的氨基酸变 化，即类似的带电或不带电氨基酸的变化的多肤。遗传编码的氨基酸通常分为四个家族： (1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸）；碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸）；（3)非极性(丙氨酸、鄉氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）；W及(4)不带电极性(甘氨酸、天 冬酷胺、谷氨酷胺、半脫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共 同归类为芳香族氨基酸。由于每个家族的成员具有与相同家族的其他成员类似的物理的与 化学性能，有理由期待用异亮氨酸或鄉氨酸单独替换亮氨酸、用谷氨酸单独替换天冬氨酸、 用丝氨酸单独替换苏氨酸，或用结构上相关的氨基酸类似地替换氨基酸对得到的分子的结 合性能不会具有主要的影响。氨基酸的变化是否产生功能的多肤可W容易地通过试验含有 SbtA、BicA、CCPl或LCIA衍生物的转基因植物的性能来确定。
[01%] 设及訊tA、BicA、CCPl或LCIA也设及SbtA、BicA、CCPl或LCIA的多肤衍生物。如在本 文中使用的"多肤衍生物"包括来自天然存在的SbtA、BicA、CCPl或LCIA的不同长度的那些 多肤，并且包含如在SbtA、BicA、CCPl或LCIA中发现的相同的一级顺序中约五个或更多个的 氨基酸。具有与訊tA、BicA、CCPl或LCIA基本上相同的氨基酸序列但是拥有少数的基本上不 影响SbtA、BicA、CCPl或LCIA多肤衍生物分别与SbtA、BicA、CCPl或LCIA特异的分子，如抗体 相互作用的能力的氨基酸置换的多肤是在SbtA、BicA、CCPl或LCIA多肤衍生物的定义之内 的。多肤衍生物还包括糖基化的形式，与其他分子的聚集结合物和与不相关的化学部分的 共价结合物。
[0127] 在一个实施方式中，碳酸氨盐转运体(例如，Sbt A、Bi CA、CCP1或LCIA基因或它们的 同源物)在适用于体内表达如，例如植物表达系统的载体中表达。碳酸氨盐转运体多核巧酸 插入在重组体表达载体或多个载体中。术语"重组体表达载体"是指已经通过插入或结合碳 酸氨盐转运体遗传序列来操纵的质粒、病毒或其他在本领域中已知的方式。术语"质粒"通 常在本文中根据本领域技术人员熟知的标准命名规则，由在大写字母和/或数字之前和/或 之后的小写的P标明。在本文中公开的质粒是可商购的，公众在无限制的基础上可获得的， 或可W通过常规应用众所周知的，公开的程序由可获得的质粒构建的。许多质粒及其他克 隆和表达载体是众所周知的和容易获得的，或本领域普通技术人员可W容易地构建许多适 于使用的其他质粒。运些载体转化至适合的宿主细胞W形成用于生产多肤的宿主细胞载体 系统。
[0128] 术语重组体多核巧酸或核酸是指通过由遗传工程技术或由化学合成通过人工操 作多核巧酸的分离的片段实现结合两个另外分离的序列片段而制成的多核巧酸。运样做 时，可W将期望的功能的多核巧酸区段结合W生成期望的功能的组合。
[0129] 在本文中可互换地使用的术语"分离的"或"纯化的"是指核酸、多肤或其他生物部 分，其从其自然地相关联的组分中移开。术语"分离的"可W指单独的并且分离于在自然界 中发现该分子的整个生物体，或基本上没有其他同样类型的生物大分子存在下存在的多 肤。术语"分离的"相对于多核巧酸可W指核酸分子完全或部分没有在自然界与其正常地关 联的序列;或如其存在于自然界中，但是具有与之关联的异源序列的序列;或脱离自染色体 的分子。通常使用分析化学技术，例如聚丙締酷胺凝胶电泳或高效液相色谱确定纯度和均 匀性。在一些实施方式中，术语"纯化的"是指核酸或蛋白质是至少85%纯的，具体地至少 90%纯的，更具体地至少95%纯的，或更加具体地至少99%纯的。
[0130] 术语转基因是指包含编码蛋白质或RNA分子的编码序列的重组体多核巧酸或核 酸。
[0131] 碳酸氨盐转运体多核巧酸插入适合于植物、细菌、酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动 物细胞中的表达的载体中，该载体进一步包含在植物、细菌、酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动 物细胞中表达核酸分子所需的，与编码碳酸氨盐转运体的核酸分子可操作地连接的调控元 件。用于植物表达适合的载体包括T-DNA载体。"可操作地连接"是指其中如此描述的组分处 于允许它们W它们希望的方式作用的关系的排列（jux化postion)。连接与编码序列可操作 地连接的表达控制序列从而在与表达控制序列相适合的条件下实现编码序列的表达。如在 本文中使用的术语"表达控制序列"是指调节其可操作地连接的核酸序列的表达的核酸序 列。当表达控制程序控制和调节核酸序列的转录和翻译(视情况)时，表达控制程序可操作 地连接至核酸序列。因此，表达控制序列可W包括适当的启动子、增强子、转录终止子、蛋白 质编码基因之前的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号(如果存在内含子的话）、基因的 正确读取框架的维护W允许mRNA正确的翻译，W及终止密码子。术语"控制序列"旨在至少 包括其存在可W影响表达的组分，并且还可W包括其存在是有利的另外的成分，例如，前导 序列和融合配偶体(fusion padner)序列。表达控制序列可W包括启动子。"启动子"是指 足W引导转录的最小序列。还包括足W致使启动子依赖的基因表达对细胞类型特异、组织 特异是可控制的，或可W由外部信号或试剂诱导的那些启动子元件，运种元件可W位于基 因的5'或3'区域。包括组成型和诱导性启动子两者。如果启动子是诱导型的，存在显示表达 的介导调节的序列从而只有当植物或植物组织可使用诱导物(例如光)时转录相关的序列。 示例性的启动子是35S花挪菜花叶病毒(CaMV)启动子，提供基础表达并避免转基因植物的 过表达。
[0132] 关于编码序列，术语"植物可表达"是指编码序列(核巧酸序列）可W有效地由植物 细胞、组织和/或整个植物表达。如在本文中使用的，植物可表达的编码序列具有符合在植 物细胞中可接受的基因表达的GC组合物，足够低的CpG含量从而编码序列的表达不会受植 物细胞的限制，W及符合植物基因的密码子使用。在期望植物可表达的基因的特性与那些 自然存在的基因相同时，植物可表达的同源物会具有同义的编码序列或基本上同义的编码 序列。基本上同义的编码序列是其中存在编码与比较序列类似的氨基酸的密码子，或如果 取代的氨基酸在性能上与其替换的氨基酸不类似，该变化对至少一种该酶的底物的酶活性 没有显著的影响的序列。如在本文中讨论的，应充分理解在大多数情况下，氨基酸序列存在 一些灵活性因而功能不会显著地变化。氨基酸序列中的保守变化和生成的类似的蛋白质可 W容易地使用如本文中公开的那些流程来测试。在期望植物可表达的基因具有不同的性能 时，氨基酸序列与野生型的基因相比可W存在变化，并且增强的光合作用的性能可W容易 地如本文中描述的确定。
[0133] "植物可表达的转录和翻译调节序列"是可W在植物、植物组织和/或植物细胞中 起作用W影响它们结合的核巧酸序列的转录和翻译表达的那些。包括定性地控制基因表达 (响应于环境信号如光，或W组织特异的方式打开或关闭基因表达)的5'序列和有利地增加 下游基因表达的水平的定量调节序列。用作翻译控制序列的序列基序的实例是核糖体结合 位点序列。聚腺巧酸化信号是位于祀序列下游的转录调节序列的实例。示例性的侧翼序列 包括根瘤±壤杆菌Ti质粒的nos基因的3'侧翼序列。还可W利用细菌的merA编码序列的上 游未翻译序列W改善植物中其他序列的表达。
[0134] 植物可表达的转录调节序列可选地包含组成型启动子W驱动贯穿整个植物或大 部分的植物组织的基因表达。在一个实施方式中，组成型启动子在比单子叶植物 (endogenous plant)基因启动子更高的水平下驱动基因表达。在一个实施方式中，组成型 启动子在至少比单子叶植物基因启动子至少两倍更高，具体地至少五倍更高，并且更具体 地至少十倍更高的水平下驱动基因表达。适合的组成型启动子包括植物病毒启动子如花挪 菜花叶病毒(CaMV)35S和19S启动子。示例性的植物病毒启动子是花挪菜花叶病毒35S启动 子。适合的组成型启动子进一步包含组成地表达的植物基因的启动子，如植物泛素、 Rubi SCO，和肌动蛋白启动子如ACTl和ACT2植物肌动蛋白基因。示例性的植物基因启动子包 括来自拟南芥的4机2启动子（座位413618780;56〇10^):12)和来自水稻的4(：1'1启动子 (GenBank登录号S44221.1;SEQ ID NO: 13)。
[0135] 在调控元件将连接至组成型启动子时，通常使用截短的（或最小的）启动子，例如 截短的花挪菜花叶病毒的35S启动子。其他组成型启动子的截短的版本也可W用于提供 CAAT和TATA同源区域;运种启动子序列可W源自根瘤±壤杆菌T-DNA基因如nos、ocs和mas W及植物病毒基因如CaMV 19S基因或拟南芥的ACT2基因的那些。在本文中具体地举例的翻 译控制序列是细菌信号的ATG翻译起始密码子的8和13上游之间的核巧酸并且来自植物的 ATG翻译起始密码子的1至7上游核巧酸。
[0136] 最小启动子含有RNA聚合酶结合和引发转录所需的DNA序列信号。对于RNA聚合酶 II启动子，该启动子是由转录起始位点的约20至50碱基对上游的TATA同源序列基序和转录 起始位点的约50至120碱基对上游的CAAT同源序列基序所识别的。按照惯例，转录上游的核 巧酸由延伸自起始位点的上游(在5'方向）逐渐增大的数目开始。在一个实施方式中，在植 物组织中由最小启动子引导的转录是较低的并且不会正面或负面地响应环境的或发育信 号。示例性的适合用于植物的最小启动子是截短的CaMV 35S启动子，其含有35S基因的-90 至+8的区域。在期望高水平的基因表达时，可W将上调基因表达水平的转录调节序列与在 其中使用的最小启动子可操作地连接。运种定量的调节序列列举为转录增强调节序列如增 强子。
[0137] 在一个实施方式中，植物可表达的转录调节序列包括组织或器官特异的启动子W 在选择的器官如根或芽W及其中的组织中驱动基因表达。在一个实施方式中，器官特异的 启动子驱动地下的组织如根和根毛中的基因表达。在一个实施方式中，器官特异的启动子 驱动地上组织如芽和叶中的基因表达。示例性的叶特异的启动子是SRSl启动子.在一个实 施方式中，器官特异的启动子在花和生殖组织中驱动基因表达。
[0138] 植物可表达的转录调节序列可选地包括诱导型启动子W响应于选择的刺激驱动 基因表达。适合的诱导型启动子包括光诱导型启动子如SRSl启动子，和叶绿素 A/13结合蛋 白可光诱导转录调节序列。
[0139] 用于构建重组DNA分子的载体的选择取决于期望的功能性，例如复制、蛋白质表达 W及要转化的宿主细胞。在一个实施方式中，载体包含原核复制子，即当引入原核宿主细胞 如细菌宿主细胞时，具有引导自主复制并染色体外维持重组DNA分子的能力的DNA序列。此 夕h载体还可W包含，当引入那些转化细胞中时，其表达为细菌宿主细胞带来选择性优势， 如耐药性的基因。适合的细菌耐药性基因是带来对氨节西林或四环素（W及其他选择性试 剂)的耐性的那些。新霉素憐酸转移酶基因具有其在真核W及原核细胞中表达的优势。
[0140] 载体通常包括对于插入重组DNA分子方便的限制位点。适合的载体质粒包括可获 得自 BioRad Laboratories (Richmond，Cal if.)的pUC8、pUC9、地R322和地R329 W及可获得 自曲a;rmacia(Piscataway，N.J.)的pPL、地和K223 W及可获得自 Stratagene化a Jolla, Calif .)的pBLUESCRIPT'K和pBS。适合的载体包括，例如可获得自Stratagene化a Jol Ia，Cal if.)的包括AZAP载体的A隧菌体载体。其他示例性的载体包括pCMU。其他适当的 载体还可W根据已知的方法合成;例如，载体pCMU/K哺pCMUII，其是pCMUIV的修饰。
[0141] 能够在植物细胞中表达重组体核酸序列并且能够在宿主植物细胞中引导稳定整 合的适合的表达载体包括源自根瘤±壤杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，和一些其他已知 在植物中作用的表达载体系统。例如，见Verma et al. ,NO.W087/00551通过引证结合在本 文中。其他适合的表达载体包括用于在转基因植物中表达蛋白质的通路克隆（gateway cloning)相容植物目标载体，例如pEarleyGate 系列化 arley et al. The Plant Journal Volume 45,Issue 4,pages 616-629,February 2006)。
[0142] 表达和克隆载体可选地含有可选择标记，即编码用该载体转化的宿主细胞生存或 生长所需的蛋白质的基因。虽然运种标记基因可W携带在另一多核巧酸序列上共同引入宿 主细胞，其最经常包含在克隆载体上。仅标记基因已经引入其中的那些宿主细胞会在选择 性的条件下生存和/或生长。适合的选择基因编码的蛋白质(a)带来对抗生素或其他毒性物 质，例如氨节西林、新霉素、甲氨蝶岭等的抗性；（b)补足营养缺陷的缺点;或(C)提供不可由 复合培养基获得的关键营养素。适当的可选择标记的选择将部分取决于宿主细胞。
[0143] 选择转基因植物最常使用的标记之一是对草锭麟（W各种商品名包括Basta和 Finale出售的除草剂)的耐性。对草锭麟的耐性是由编码草下麟乙酷转移酶(PAT)的细菌双 丙氨麟抗性基因（BAR)带来的。草锭麟选择的主要优点是其可^在±壤中生长的植物上进 行并且不需要使用无菌技术。
[0144] 在一个实施方式中，将碳酸氨盐转运体编码序列克隆入适用于在不同的组成型启 动子，包括CaMV 35S启动子W及来自拟南芥和水稻的肌动蛋白启动子的控制下在亚麻莽中 表达的载体中。在一个实施方式中，由器官或组织特异的或诱导型的启动子调节碳酸氨盐 转运体编码序列。示例性的组织特异启动子是叶特异的SRSl启动子。在一个实施方式中，将 碳酸氨盐转运体编码序列克隆入包含启动子、方便的克隆位点和nos转录终止子(NOSt)的 植物表达盒构建体或载体中。在一个实施方式中，将碳酸氨盐转运体克隆入祀arlygate质 粒中的植物表达盒中。
[0145] 使用表达载体其他DNA转化宿主细胞是通过本领域技术人员众所周知的常规方法 进行的。"转化"是指结合新的DNA(即细胞外源的DNA)后在细胞中诱导的永久的或暂时的遗 传变化。在细胞是植物细胞时，永久的遗传变化通常是通过将DNA引入细胞的基因组实现 的。"转化细胞"或"宿主细胞"是指借助重组DNA技术将编码碳酸氨盐转运体（例如SbtA、 BicAXCPl或LCIA多肤）的DNA分子或其片段引入其中（或引入其前体)的细胞(例如原核的 或真核的）。
[0146] 在本发明上下文中，重组体宿主细胞是遗传地修改W含有分离的DNA分子的那些。 可W通过适合于特定的细胞类型的方式引入DNA，包括但不限于转染、转化、脂质转染或电 穿孔。
[0147] 本文还包括已经用碳酸氨盐转运体基因转化的转基因植物。"转基因植物"是遗传 地修改W含有并表达重组DNA序列为调控RNA分子或蛋白质的事物。如在本文中具体列举 的，转基因植物是遗传地修改W含有并表达与在植物细胞或组织或整个植物中作用的转录 控制序列可操作地连接或在其调控控制下的重组DNA序列。如在本文中使用的，转基因植物 还包含初始转基因植物的后代，其中那些后代含有并且能够在本文中描述的植物可表达的 转录控制序列的调控控制下表达重组体编码序列。含有转基因胚的种子包括在该定义之 内。
[0148] 表达重组体基因的，转基因植物的群体之内的单株植物可W具有不同的基因表达 水平。不同的基因表达归因于多种因素，包括重组体基因的多重拷贝、染色质的影响和基因 抑制。因此，转基因植物的表型可W测量为群体内的单个植物的百分比。在一个实施方式 中，大于或等于约25%的转基因植物表达表型。具体地，大于或等于约50%的转基因植物表 达表型。更具体地，大于或等于约75%的转基因植物表达表型。表型是增加的C〇2同化、降低 的蒸腾速度、增加的水分利用率、增加的氮利用率或增加的种子产量。
[0149] 转基因植物是用包含与植物可表达的转录调节序列可操作地连接的碳酸氨盐转 运体编码序列的重组体多核巧酸或核酸分子转化的。适合的碳酸氨盐转运体编码序列包括 与碳酸氨盐转运体基因同源的序列。示例性的碳酸氨盐转运体基因包括集胞藻属 PCC6803SbtA(沈Q ID N0:1)、聚球藻属PCC7002BicA(沈Q ID N0:3)、莱茵衣藻CCPUSEQ ID N0:5)和莱茵衣藻LCIA(SEQ ID N0:7)。转基因植物表达异源的碳酸氨盐转运体蛋白质，其 局部化至植物的叶绿体被膜，例如内包膜。在一个实施方式中，碳酸氨盐转运体是与CCPl蛋 白质同源的。适合的碳酸氨盐转运体蛋白质包括来自蓝藻细菌的碳酸氨盐转运体蛋白质。 示例性的碳酸氨盐转运体蛋白质包括集胞藻属？此68035^4(56〇10^):2)、聚球藻属 PCC7002BicA(沈Q ID N0:4)、莱茵衣藻CCPUSEQ ID N0:6)和莱茵衣藻LCIA(SEQ ID NO: 8)。
[0150] 本发明人已经用在核基因组中编码异源碳酸氨盐转运体的重组DM分子转化了植 物。表达的重组体碳酸氨盐转运体局部化至叶绿体的内包膜。表达重组体异源碳酸氨盐转 运体基因的转基因植物和植物细胞相比不包含重组体异源碳酸氨盐转运体的同样种类的 野生型植物示出了增强的C〇2同化和降低的蒸腾速度。转基因植物相比不包含重组体异源 碳酸氨盐转运体的同样种类的野生型植物还示出了增加的种子产量。
[0151] 将包括植物可表达的基因或其他感兴趣的DNA的重组DNA构建体通过适合的方法 插入植物的基因组中。合适的方法包括，例如根瘤±壤杆菌介导的的DNA转移、直接DNA转 移、脂质体介导的DNA转移、电穿孔、共培养、扩散、粒子轰击、显微注射、基因枪、憐酸巧共沉 淀、病毒载体和其他技术。适合的植物转化载体包括源自根瘤±壤杆菌的Ti质粒的那些。除 源自±壤杆菌的Ti或根诱导(Ri)质粒的植物转化载体外，可W使用替代方法将DNA构建体 插入植物细胞。可W通过选择转化的种子或选择转化植物细胞并随后再生来生产转基因植 物。
[0152] 在一个实施方式中，在CaMV 35S启动子和3'OCS终止子的控制下将碳酸氨盐转运 体编码序列亚克隆至植物表达T-DNA双运载体pEarleyGatelOO中。先前证明该编码序列和 启动子在大多数植物组织中是强烈转录表达的。使用真空渗入技术转化亚麻莽，并且筛选 BASTA耐性的Tl生成种子。生产用分离的碳酸氨盐转运体多核巧酸转化的转基因植物。在一 个实施方式中，植物还表达第二碳酸氨盐转运体编码序列。
[0153] 在一个实施方式中，生长(例如在±壤上)并收获转基因植物。在一个实施方式中， 与地下组织分开收获地上组织。适合的地上组织包括芽、茎、叶、花、谷粒和种子。示例性的 地下组织包括根和根毛。在一个实施方式中，收获整个植物并随后将地上组织与地下组织 分离。
[0154] 通过W下非限制性的实施例进一步地说明本发明。技术人员想到的任何列举的成 分和方法的变化旨在处于本发明的范围内。
[0155] 实施例
[0156] 实施例1.碳酸氨盐转运体表达载体的构建和植物转化
[0157] 訊tA基因融合的构建和祀向至叶绿体的确认
[0158]将基因构建体设计为将来自蓝藻细菌的SbtA(集胞藻属（Syncchocystis) PCC6803)碳酸氨盐转运体祀向至叶绿体。框内编码的每种构建体融合来自拟南芥的 atTic20的叶绿体转运肤（110氨基酸)至SbtA的N-末端W在由亚麻莽核基因组表达时将蛋 白质祀向至叶绿体（图l)〇AtTic20是良好表征的叶绿体内包膜（inner envelope membrane)蛋白（Chen et al.，2000，Plant Physiol.122:813-822)。此外，含有 C-末端的基 因融合至C-Myc表位标记(邱itope化g)W便于确认在转基因植物中的表达和局部化。示例 性的訊构建体提供为沈Q ID N0:11。
[0159] 将SbtA(atTic20TP_SbtA_cMyc)构建体插入含有上游隧菌体T7启动子和下游T7终 止子序列的源自PUC18的载体PJe邱ress414中，W允许使用T7连接的转录-翻译系统体外翻 译构建体。
[0160] 将构建体在[35S]甲硫氨酸的存在下翻译并用分离的魏豆叶绿体溫育W研究它们 适当地祀向至叶绿体并结合内包膜的能力。如由atTic20转运肤的切割W产生较高移动性 的物质（泳道2)证明的，蛋白质引入反应的分析（图2)表明体外翻译产物(泳道1)引入至分 离的叶绿体中。处理叶绿体随后引入嗜热菌蛋白酶W消化叶绿体外侧剩余的蛋白质表明两 种蛋白质的处理的形式是保护不受蛋白水解的并且因此被完全引入(比较泳道2和5)。为确 认转运体整合至叶绿体膜中，通过碱提取（alkaline extraction)和差示沉降 (differential sedimentation)分离基质和膜部分。随膜颗粒部分分离的转运体（比较泳 道6和7)符合适当的插入。
[0161] 将[35S]甲硫氨酸标记的atTic20TP_SbtA_cMyc引入分离的魏豆叶绿体中，并且随 后将叶绿体分离W产生内包膜、基质和类囊体部分。将分布与引入atTic20的那些、真实的 内包膜蛋白和Rubisco的小亚基（SSU)，已知的基质蛋白质相比较。图4示出atTic201T_ SbtA_cMyc被引入，处理成其成熟形式(SbtA_cMyc)，并主要结合至膜部分（图4A，第二子图， 比较泳道1、2和3)。訊tA_cMyc主要随内包膜分离（图4A，第二子图，比较泳道4-6和图4B)。大 于75%的蛋白质与内包膜相结合（图4B)。该分布模式与引入的前atTic20(pre-atTic20) (图44，第立子图和4B)相似，表明SbtA_cMyc适当地局部化至内包膜。相对地，引入的SSU几 乎唯一地局部化至基质部分（图4A底部子图和4B)。体外引入试验的结果是明确的，并且因 此我们已经将訊tA碳酸氨盐转运体祀向至叶绿体的内包膜。
[0162] 通过核转化构建用于将訊tA融合物引入植物的转化载体
[0163] 将单独的编码atTi c20TF*_SbtA_cMyc的单基因构建体插入基于祀ar IeyGate 100 (PEG 100)的，含有修改的35S花挪菜花叶病毒(CaMV)启动子的双植物转化载体中W提供在 转基因植物中的基础表达和避免过表达。将运些构建体（图3; "PEG IOOSbtA")由±壤杆菌 介导的，基于确立的方法的化u&Kang，2008，Plant Cel 1 Rep，27，273-278)花器浸薩转化法 (floral dip transformation)转化至亚麻莽中。对每种载体转化45-50株植物。收集来自 TO植物的种子。
[0164] 使用存在于T-DNA插入中的BASTA可选择标记筛选来自运些植物的Tl巧苗。图5示 出了通过施加200mg/L的BASTA除草剂成功选择Tl巧苗(seedling)的实例（图5,比较A和B)。 移植耐BASTA的植物（图5C)并且使用来自T1品系的基因组DNA与基因特异性引物(Sb tA)或 对照引物(肌动蛋白）的PCR的基因分型确定该品系为atTi c20TP_SbtA_cMyc转化体(见图5D 中的实例）。野生型亚麻莽基因组DNA对肌动蛋白对照是阳性的，但是缺乏转基因（图5D)。
[01化]将亚麻莽叶绿体从由atTi c20TP_SbtA_cMyc构建体表达SbtA_cMyc的品系中分离。 在分离叶绿体之后，使用抗-CMyc抗体的免疫印迹实验示出转基因的蛋白质局部化至叶绿 体，处理至其成熟形式，并且结合至叶绿体膜（图7B)。选择纯合的T3转基因品系用于光合作 用分析。
[0166] 表达来自蓝藻细菌的BicA的亚麻莽核转化体的生成
[0167] 在祀G 100中生成与上述的对于SbtA的那些相似的表达蓝藻细菌BicA碳酸氨盐转 运体的构建体(见图1和图3)。
[0168] 将运些构建体（"pEG 100BicA_cMyc")通过基于确立方法的，±壤杆菌介导的花器 浸薩转化法转化至亚麻莽中。对每种载体转化45-50株植物，并且收集来自TO植物的种子。 使用如上文描述的存在于T-DNA插入中的BASTA(草锭麟)可选择标记筛选来自运些植物的 Tl巧苗。通过基因组DNA的PCR确认Tl转化植物（图加）。将亚麻莽叶绿体从由atTic20TP_ BicA_cMyc构建体表达BicA的品系中分离。在分离叶绿体之后，使用抗-cMyc抗体的免疫印 迹实验示出转基因蛋白质局部化至叶绿体，处理至其成熟形式，并且结合至叶绿体膜（图 7A)。
[0169] 随后，选择纯合的T3转基因品系用于光合作用分析。
[0170] 表达来自衣藻的CCPl碳酸氨盐转运体的亚麻莽核转化体的生成
[0171] 来自衣藻的CCPl基因作为增加叶绿体[0)2]的转运体是对SbtA有吸引力的替代。 CCPl已经示出增加低[C02]耐受性并且应当含有对于叶绿体祀向的所有植物特异信息，
[0172] 我们将稠合至cMyc表位标记的CCPl插入pEG 100双运载体（图3)和转化的亚麻莽 属植物。使用BASTA选择筛选T1转化体(作为实例见图5A-C)并由PCR确认基因型（图5D)。
[0173] CCPLcMyc品系示出较快的Tl成熟。使用可商购的cMyc单克隆抗体通过Tl植物提 取物的免疫印迹法测试转基因的表达。由5个随机选择的5周大的Tl转化体和对照野生型植 物制备叶提取物（图6A)。将对应来自每种品系的25iig和50iig蛋白质的提取物由SDS-PAGE解 析并免疫印迹CCP l_cMy C的存在。图6表明所有检验的CCP l_cMy C的T1品系（图6A)表达预测 的分子质量的免疫活性蛋白质。野生型对照没有展现出免疫活性。品系展现出相当大的蛋 白质表达的可变性，提供一系列的用于基因对光合参数的影响的表型分析的植物。收集来 自Tl转化体的T2种子。
[0174] 选择纯合的T3品系用于表达CCP l_cMy C的CCP1亚麻莽品系。如W下描述的对选择 的纯合品系分析转运体对光合作用(C〇2同化)的影响、水和氮的利用率和种子产量。
[0175] 表达来自衣藻的LCIA的亚麻莽核转化体的生成
[0176] 在祀G 100中生成与上文对于CCPl表达所描述的相似的表达来自衣藻的LCIA的构 建体(图3)。
[0177] 将运些构建体通过基于确立方法的，±壤杆菌介导的花器浸薩转化法转化至亚麻 莽中。对每种载体转化45-50株植物。收集来自TO植物的种子。
[0178] 使用BASTA选择筛选Tl转化体(作为实例见图5A-C)并通过PCR确认基因型（图5D)。 选择表达单独的来自衣藻的LCIA基因的LCIA亚麻莽品系的纯合T3品系并随后分析各种功 能。
[0179] 使用可商购的cMyc单克隆抗体通过Tl植物提取物的免疫印迹法测试转基因的表 达。由5个随机选择的5周大的Tl转化体和对照野生型植物制备叶提取物（图6B)。将来自每 种品系的对应25iig和50iig的蛋白质的提取物由SDS-PAGE解析并免疫印迹LCI A_cMy C的存 在。图6表明所有检验的LCIA_cMy C的T1品系（图6B)表达预测的分子质量的免疫活性蛋白 质。野生型对照没有展现出免疫活性。
[0180] 堆叠构建体和表达堆叠构建体的植物转化体的生成
[0181] 除单基因表达构建体外，生成其中表达多个碳酸氨盐转运体基因的多个"堆叠 (stacked)"表达构建体。构建与上文对于蓝藻细菌转运体或衣藻转运体描述的相似，对于 特定的基因适当的是"堆叠"在转化入植物中的表达载体中。
[0182] 具体地，制成表达来自蓝藻细菌的BicA和SbtA两者的堆叠基因构建体并随后转化 入亚麻莽中。
[0183] 另外，制成表达来自衣藻的CCPl和LCIA两者的堆叠基因构建体并随后转化入亚麻 莽中。
[0184] 分离并测试生成自每种堆叠构建体的T3植物。
[0185] 在下表中提供相关的亚麻莽转基因品系的状态的总结。
[0186] 表5.单独和共同表达的碳酸氨盐转运体转基因品系的总结
[0187]
[0188] 实施例2.植物转化体的功能测试
[0189] 在相同条件下生长的CCPl亚麻莽转基因品系和野生型植物的光合参数
[0190] 检验四种各自为单独的CCPl亚麻莽转化体的纯合T3品系W确定它们详细的光合 和碳酸氨盐转运性能。对每种品系在最少=个生物复制体(=株植物)上进行所有的测量。 我们在几种CCPl亚麻莽品系中确定了相比野生型植物的显著差异。
[0191] 使用具有3cmX2cm采样室的便携式光合作用系统化I-6400XT，Li-C0R Inc.， Lincoln,肥，USA)测量净光合作用、细胞间C〇2(Ci)、气孔导度（Stomatal conductance)和 蒸腾作用。在4-5周大的植物上在开花之前测量气体交换。
[0192] 在恒定的400皿ol/m2的C〇2浓度(213皿ol/m2的平均Ci)下，我们观察到植物中CCP 1亚麻莽的同化速率的最小差异（图8A)。然而，我们观察到单独的CCPl亚麻莽品系与野生型 相比Ci(图8B)、气孔导度（图8D)和蒸腾速率（图8E)的显著差异。在转基因品系中相比野生 型植物气孔导度降低27-32%之间，并且蒸腾作用降低30-31%。当对Ci校正同化速率时，品 系CCPl-20、CCPl-34和CCP1-48各自展现出19%、14%和17%的同化作用/(：1增加（图8〇。
[0193] 运些数据表示转基因植物通过降低蒸腾作用和气体交换（即关闭气孔)来响应较 高的C〇2转运能力。
[0194] 水利用率(WUE)和氮利用率(NUE)
[01M]基于对CCPl亚麻莽转基因植物观察到的显著的气孔导度和蒸腾作用降低（图8)， 我们设置了表型测试W就水利用率比较CCP1-20和野生型植物。基本原理是基于预期降低 的蒸腾作用会导致降低的水利用并增加对减少灌概的耐受性。
[0196] 将转基因和WT巧苗在Pro-mix生长培养基上萌发并将两周大的巧苗移植至5"的花 盆。作为第一次定性测量W肥，我们使CCP1-20和野生型植物生长至开花起始(37天)或种子 成熟起始(50天）的阶段并完全停止诱水7天，其中每天观察枯萎的症状。CCP1-20在两个阶 段均展现出干旱耐受性的显著增加（图9)。在缺水7天之后CCP1-20植物保持健康，然而野生 型植物枯萎并开始干枯。
[0197] 检验运些植物的水利用率(WUE)和氮利用率(NUE) W测试由于降低的C〇2需求增加 的C〇2同化将导致气体交换的变化和由于减少的rubisco合成导致氮需求减少的假说。
[019引通过确定在受限的水情下生长的野生型和CCP1-20植物的叶水含量来定量地测量 WUE。如Ba;rrs(Australian Jourmal of Biological Sciences, 1962,15:413-428)中描述 的，在相等尺寸的叶上测量相对叶水含量。在标准溫室条件下WT和CCPl-20之间的水含量没 有显著不同。在《250ml/天的水下水含量的差异是可检测的。图10示出了在250ml/天和 175ml/天的水下的叶水含量。选择运些值是因为它们分别对应生长季节过程中~15in和~ IOin的降雨量（Spring Camelina Production Guide 2009) oWT植物的田地试验表明当降 雨从 10增加至 15in/季时产量增加50% (Spring Camelina Production Guide 2009)。 CCPl-20植物在250ml/天和175ml/天的水下分别展现出相对WT 25%和71 %的水含量增加。 在175ml/天下的水含量仅比在标准溫室条件下观察到的低27%。运些数据表明CCP1-20植 物的WUE显著增加。
[0199] 在恒定的大气[C02]下在水受限条件下在更大的代表组的CCPl品系中测量C〇2同 化示出了相对于野生型植物2-14%之间的同化增加（图11A)。除了CCP1-34外，由每株植物 的种子重量测量的，CCPl亚麻莽植物的种子产量在运些条件下在所有品系中增加了 7-50% 之间（图11B)。在所有的CCPl转基因品系中相比野生型植物没有检测到种子的含油量的显 著差异(数据未示出）。
[0200] 使用两个参数测量氮利用率(NUE)(图12)。首先，作为叶含氮量的函数测量C〇2同 化速率（图12A)。将两周大的WT和转基因植物移植至充满赔石(vermiculite)的5'花盆中。 将植物用含有如标明的不同浓度的氮的霍格兰氏营养液（Hoagland ' S nutrient solution)处理。在4周大植物的成熟叶上测量净光合作用。然后收获叶片，干燥并通过催化 燃烧确定总含氮量。在12ppm的氮肥料施加下CCP1-20展现出相比野生型29%的NUE的增加。 在25ppm的氮下CCP1-20和野生型植物之间的NUE的差异降低至19%并且在更高的氮施加下 是不可辨别的。1化pm和25ppm的氮分别相当于±壤中24磅/英亩和50磅/英亩的田地施加。 在田地中推荐的施加率是30磅/英亩（Spring Camelina Production Guide 2009)。在 的氮下在CCPl-20和野生型之间观察到15%的碳/氮含量比差异（图12B)，符合CCPl-20 中 NUE 的增力日。我们的标准溫室施加为~ 20 化 pm 的氮。运些数据表明CCPl-20 相对于野生 型植物展现出显著增加的饥正。在试图模仿田地条件的条件下差异最为明显。
[0201] 我们还使用A/Ci曲线(净C〇2同化速率A对比计算的气孔下C〇2浓度Ci)分析了在不 同的氮肥施加下生长的野生型和CCP1-20植物的光合作用参数。测量是用LI-6400XT在植物 中进行的。在所有的氮浓度下C〇2同化速率对CCP1-20保持接近恒定，但是对处于SOppmW下 氮浓度下的野生型下降（图13A)。在25和12ppm的氮下，CCP1-20植物分别展现出相比野生型 植物21%和35%更高的同化速率（图134)。我们还对第二品系，0^1-48生成了在12口口111的氮 肥下的A/Ci曲线，W支持用CCP1 -20观察到的增加的氮利用率。两种品系（CCP1 -20和CCP1 -48)均示出类似的A/Ci曲线，其中在4(K)ppm的Ci下观察到C02同化速率相对于野生型植物增 加 30%(图 13B)。
[0202] 在较低的氮肥施加下增加的NUE转化为显著的种子产量增加。CCP1-20的种子产量 (种子重量/植物）在12ppm的氮下比野生型高56% (图14)。在标准溫室肥料条件下 I(K)PPm N)没有观察到野生型和CCP1-20之间种子产量的显著差异（图14)。
[0203] 西马萨诸塞的田地试验中CCPl转基因品系的生物质和种子产量
[0204] 在西马萨诸塞的田地试验中使用25平方英尺的区块测试代表性的CCPl亚麻莽品 系CCPll-18、CCPl-20和CCP1-48。在5月23日开始栽种。在7月29日开始CCPl亚麻莽品系的收 获并在8月11日完成。在8月4日开始野生型对照区的收获并在8月25日完成。
[0205] CCP1-20和CCP1-48品系一致地展现出较高的生物质产量，包括较高的种子数/植 物，种子数/总生物质，W及总种子和生物质重量/英亩（图15)。该增加符合对两种运些品系 在溫室和生长室中的观察。此？1-20和〇^1-48的种子重量/英亩分别增加38%和51.5%。 CCP1-18品系由于较低的出苗率(seedling establishment)在田地中显著地表现不佳，并 且示出39%的种子重量/英亩的减少。
[0206] CCP1-20和CCP1-48展现出略微减少的种子大小（种子重量/100种子）（图16)，表明 种子产量的总体增加很大程度上是由于每株植物产生的种子数目的增加。运些数据也与溫 室的研究一致。
[0207] 所有的转基因的种子的含油量与野生型对照不能区分，其中含量范围为32-34% (重量/重量）的油（图17)。在CCP1-20和CCP1-48中总体油产量(磅/英亩）分别增加43%和 76%。与其表现不佳一致，品系CCP1-48示出37%的油产量减少。
[020引如由田地试验的栽种和收获安排表明的，表达CCPl构建体的品系在对照品系前一 至两周成熟。运显示该特性也可能影响亚麻莽的寿命周期和/或诱导转基因植物的早期衰 老。
[0209] 在相同条件下生长的訊tA或BicA转基因品系和野生型植物的光合参数
[0210] 我们还分析了表达BicA和SbtA微生物碳酸氨盐转运体的纯合亚麻莽BicA和SbtA T3纯合品系中的光合参数。一些品系展现出显著增加的C〇2同化（图18A)。当由Ci调节时（图 18B) ,SbtA-S和BicA-IO在275WH01 C〇2mol空气-1的恒定Ci下在统计上展现出相比野生型植 物15%的同化的显著增加（图18C)。
[0211] 实施例3.用载体转化各种农作物
[0212] 玉米的±壤杆菌介导的转化
[0213] 本发明中提供的载体可W遵循先前所描述的流程用于玉米的±壤杆菌介导的转 化（Frame et al.,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol.1,PP 185-199, Hum曰n曰 Press)O
[0214] 植物材料:将在溫室中生长的植物用作外植体来源。在授粉后9-13天收获穗(ear) 并用80%的乙醇表面杀菌。
[0215] 外植体分离、侵染和共培养:将未成熟的合子胚（1.2-2.Omm)由单独的核屯、无菌剖 开并在根瘤±壤杆菌菌株EHAlOl培养基（在转化之前在补充有IOOiiM的乙酷下香酬的5ml N6介质中生长用于刺激细菌Vir基因2-化）中在室溫下溫育5分钟。将传染的胚盾片侧向上 移至共培养基(N6琼脂凝固的培养基，含有300mg/l的半脫氨酸、5iiM的硝酸银和IOOiiM的乙 酷下香酬)并在20°C下在黑暗中溫育3天。将胚移至含有lOOmg/1的头抱嚷目亏、lOOmg/1的万 古霉素和如M的硝酸银的N6静息培养基(resting medi皿)并在28°C下在黑暗中溫育7天。
[0216] 愈合组织选择：将所有的胚移至第一选择性培养基（补充有1.5mg/l的除草肤 (bialaphos)的上述静息培养基)并在28°C下在黑暗中溫育2周，随后在含有3mg/l除草肤的 选择性培养基上继代培养。在相同的培养基上每2周通过继代培养增殖并维持愈合组织的 增生块。
[0217] 植物再生和选择:将耐除草肤的胚胎发生愈合组织品系移至再生培养基K补充有 60g/l薦糖、1.5mg/l除草肤和lOOmg/1头抱嚷目亏（cefotaxime)并用3g/l Gelrite固化的MS 基础培养基）并在25°C下在黑暗中溫育2至3周。将在运期间形成的成熟胚移至再生培养基 IK与再生培养基I相同，具有3mg/l的除草肤）用于在光下发芽（25°C ,SO-I(K)地/WVs光强 度，16/化光周期）。再生的植物准备好在10-14天内移至±壤。
[0218] 高梁的±壤杆菌介导的转化
[0219] 本发明中提供的载体可W遵循先前所描述的流程用于高梁的转化(Zhao ,2006， Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol. I,pp 233-244,Humana Press)。
[0220] 植物材料:将在溫室、生长室或田地条件下生长的植物用作外植体来源。在授粉后 9-12天收获未成熟的圆锥花序(panicle)并将单独的核屯、化ernel)用50%的漂白剂表面杀 菌30分钟随后用无菌蒸馈水洗涂=次。
[0221] 外植体分离、侵染和共培养:将未成熟的合子胚（1-1.5mm)由单独的核屯、无菌剖开 并在根瘤±壤杆菌菌株LBA4404悬浮液中（在PHI-I液体培养基(补充有的lg/1酪蛋白氨基 酸kasamino acid)、l .5mg/l的2,4-0、68.5旨/1薦糖、36旨/1葡萄糖和100測乙酷下香酬）中） 在室溫下溫育5分钟。将侵染胚W胚轴向下移至共培养PHI-T培养基（琼脂凝固的修改的 PHI-I 培养基，含有 2.0mg/l 的2,4-D、20g/l 薦糖、lOg/1 葡萄糖、0.5g/l 的 MES、0.7g/l 脯氨 酸、lOmg/1抗坏血酸和IOOiiM乙酷下香酬)并在25°C下在黑暗中溫育3天。为静息，将胚移至 补充有lOOmg/1簇节青霉素的相同的培养基(没有乙酷下香酬）中并在28°C下在黑暗中溫育 4天。
[0222] 愈合组织选择：将胚移至第一选择性培养基PHI-U(补充有1.5mg/l的2,4-D、 IOOmg^簇节青霉素和5mg/l的PPT而没有葡萄糖和乙酷下香酬的上述PHI-T培养基)并在28 °(：下在黑暗中溫育2周随后在含有1〇111肖八的??1'的选择性培养基上继代培养。在10周的选择 过程中对于剩余的愈合组织通过在相同的培养基上每2周继代培养来增殖和维持愈合组织 的增生块。
[0223] 植物再生和选择:将耐除草剂愈合组织移至再生培养基I (补充有0.5mg/l激动素 的PHI-U培养基)并在28°C下在黑暗中溫育2至3周用于愈合组织生长和胚发育。将培养物移 至再生培养基IK具有〇.5mg/l玉米素、700mg/l脯氨酸、60g/l薦糖和lOOmg/1簇节青霉素的 MS基础培养基）用于芽(shoot)的形成(28°C，黑暗中）。2-3周之后，将芽移至生根培养基(补 充有20g/l薦糖、0.5mg/l的NAA和0.5mg/l的IBA的再生II培养基)并在25°C，270地/WVs的 光强度下W16/她的光周期生长。当再生的植物为8-lOcm高时，可W将它们移至±壤并在溫 室条件下生长。
[0224] 水稻的±壤杆菌介导的转化
[0225] 本发明中提供的载体可W遵循先前所描述的流程用于水稻的±壤杆菌介导的转 化（Herve and Kayano,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol. I,pp 213-222,Humana Press)。
[O。6]植物材料:将来自生长在溫室中的梗米（japonica rice)种类的成熟种子用作外 植体来源。
[0227]培养物转化和选择:将脱壳的种子用70%的乙醇表面杀菌1分钟并用3%的次氯酸 钢表面杀菌30分钟随后用无菌蒸馈水洗涂六次。将种子W胚侧向上铺板在诱导培养基 (Gelrite凝固的，补充有300mg/l酪蛋白氨基2.88g/l脯氨酸、30g/l薦糖和2mg/l的2,4-D的 N6基础培养基)并在32°C下在连续光照下溫育5天。用根瘤±壤杆菌菌株LBA4404(来自再悬 浮在补充有IOOiiM乙酷下香酬、68.5g^薦糖和36g/l葡萄糖的N6培养基中的3天铺板的培养 物)在室溫下侵染具有膨胀的盾片的发芽种子2分钟，随后移至共培养基(Gelrite凝固的N6 培养基，含有300mg/l酪蛋白氨基酸、30g/l薦糖、lOg/1葡萄糖、2mg/l的2,4-D和IOOiiM乙酷 下香酬)并在25°C下在黑暗中溫育3天。
[02%]对于转化的胚胎发生组织的选择，将用250mg/l头抱嚷目亏洗涂的整个巧苗移至含 有300mg/l酪蛋白氨基酸、2.88g/l脯氨酸、30g/l薦糖、2mg/l的2,4-D、100mg/l头抱嚷月亏、 IOOmg^万古霉素和35111旨八的酸式硫酸盐的N6琼脂凝固的培养基上。将培养物在32°C下在 连续光照下溫育2-3周。
[0229] 植物再生和选择:将抗性的增生愈合组织移至含有300mg/l酪蛋白氨基酸、500mg/ 1脯氨酸、30g/l薦糖、lmg/1的NAA、5mg/l的ABA、2mg/l激动素、lOOmg/1头抱嚷目亏、lOOmg/1万 古霉素和2〇111旨八的6418酸式硫酸盐的琼脂凝固的N6培养基上。在32°C下在连续光照下生长 一周之后，将成活的愈合组织移至补充有2g/l酪蛋白氨基酸、30g/l薦糖、30g/l山梨醇、 0.02mg/l的NAA、2mg/l激动素、lOOmg/1头抱嚷目亏、lOOmg/1万古霉素和20mg/l的G418酸式硫 酸盐的MS培养基（用lOg/1的琼脂糖凝固）并在相同的条件下另外溫育一周随后移至具有 7g^琼脂糖的相同的培养基上。2周之后，将出现的芽移至含有30g/l薦糖的Gelrite凝固的 不含激素的MS培养基上并在连续光照下生长1-2周W促进芽和根发育。当再生的植物为8-IOcm高时，可W将它们移至±壤并在溫室条件下生长。在10-16周之后收获转基因种子。
[0230] 用上壤杆菌遵循类似的流程转化釉稻（indica rice varieties) (Datta and Datta,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol. I,pp 201-212,Humana Press)。
[0231 ]甘薦的微粒轰击介导的转化
[0232] 可W将含有转录因子基因的表达盒与标记基因（例如npt)的盒子通过基因枪 (biolistics)遵循先前描述的流程共同引入甘薦之中（Taparia et al.,2012,In VUro Cell.Dev.Biol.48:15-22)。
[0233] 植物材料:将具有6-8个可见节的溫室生长的植物用作外植体来源。收集顶部并用 70%的乙醇表面杀菌。将最外的叶在无菌条件下移除并将未成熟的叶轮(leaf whorl)横截 面(约2mm)由顶端节之上I-IOcm的区域切除。
[0234]培养起始、转化和选择:将分离的叶部分在补充有20g/l薦糖、1.86mg/l对氯苯氧 基乙酸(CPA)、1.86mg/l的NAA和0.09mg/l的BA的MS基础培养基上在28°C，在30皿ol/m2/s的 光强度和16/她的光周期下培养7天。将胚发生培养物继代培养至新鲜的培养基并用于转 化。
[02：3日]为微粒轰击(microprojectile bombardment)，将叶盘在基因转移之前4小时铺板 在补充有0.4M山梨醇的培养起始培养基上。将含有TF的表达盒和标记基因的质粒DNA (200ng)遵循先前所描述的流程沉淀在1 .Smg的金微粒(0.6皿)上(Altpeter and San^u, 2010,Genetic transformation-bioIistics,Davey&Anthony eds.,pp 217-237,Wiley, Hoboken)。将DNAQOng每次注射)通过PDS-1000 基因枪微粒递送系统(Biorad)使用IlOOpsi 防爆片(rupture disk)、26.SmmHg的室真空和6cm.压力的架距离递送至外植体。将轰击的 外植体移至上述的培养起始培养基并溫育4天。
[0236] 为选择，将培养物移至补充有30mg/l遗传霉素的起始培养基上并溫育10天继W相 同条件下的另一选择周期。
[0237] 植物再生和选择:将培养物移至没有CPA的上述选择培养基上并在28°C，在10化 mol/mVs的光强度下用16/8h的光周期生长。将具有小芽（约0.5cm)的叶盘平铺在具有 30mg/l遗传霉素的不含激素的培养基上用于芽的生长和根的发育。在移至±壤之前，可W 将再生植物的根部浸入可商购的根部促进粉中。
[0238] 通过微粒轰击的小麦的转化
[0239] 本发明中提供的基因构建体可W用于通过遵循先前所描述的流程的微粒轰击的 小麦转化(Weeks et al.，1993,Plant I^ysiol. 102:1077-1084)。
[0240] 植物材料:来自春小麦栽培属BobwMte的植物，生长在18-20°C日间和14-16°C夜 间溫度，1化的光周期下。在播种之后10-12周(开花之后12-16天)收集麦穗。将处于早期-中 期乳熟期（early-medium milk stage)的单独的颖果用70%的乙醇杀菌5分钟并用20%次 氯酸钢杀菌15分钟随后用无菌水洗涂=次。
[0241] 培养起始、转化和选择:将未成熟的合子胚(0.5-1.5mm)在无菌条件下剖开，盾片 侧向上置于培养诱导培养基(含有20g/l薦糖和1.5mg/l的2,4-D的化ytagel凝固的MS培养 基)并在27°C在光下(43皿ol/WVs)溫育3-5天。
[0242] 为微粒轰击，将源自胚的愈合组织在基因转移之前4小时平铺在补充有0.4M山梨 醇的培养起始培养基上。将含有TF的表达盒和标记基因 bar的质粒DNA沉淀在0.6皿的金微 粒上并如对甘薦所描述的递送至外植体。
[0243] 将轰击的外植体移至愈合组织选择培养基(含有l-2mg/l除草肤的上述培养起始 培养基)并每2周继代培养。
[0244] 植物再生和选择：在1-2个选择周期之后，将培养物移至补充有0.5mg/l麦草畏 (dicamba)和2mg/l除草肤的MS再生培养基上。为根部形成，将得到的耐除草肤的芽移至不 含激素的半浓度MS培养基。将具有发育良好的根部的植物移至±壤并在移至溫室之前在21 °C下用16h的光周期(300皿ol/WVs)适应较低的湿度约2周。
[0245] 欧洲油菜的±壤杆菌介导的转化
[0246] 植物材料:将成熟种子在10%的商用漂白剂中随着溫和摇动表面杀菌30分钟并用 无菌蒸馈水洗涂=次。
[0247] 培养起始和转化:将种子平铺在萌芽培养基(补充有30g/l薦糖的MS基础培养基） 上并在24°C下用1化的光周期W60-8化E/mVs的光密度溫育4-5天。为转化，将基部具有~ 2mm的叶柄的子叶自得到的巧苗切除，浸没于根瘤±壤杆菌菌株EHAlOl悬浮液(在28°C下 4化生长自5ml的补充有适当的抗生素的最低培养基中的单个菌落）中Is并立即植入共培养 基巧有30g/l薦糖和20皿苄基腺嚷岭的MS基础培养基）中~2mm的深度。将接种的子叶在相 同的生长条件下溫育4她。
[024引植物再生和选择:在共同培养之后，将子叶移至包含补充有30g/l薦糖和苄基 腺嚷岭、300mg^特美汀(timentin)和20111旨八硫酸卡那霉素的MS培养基的再生培养基上。在 2-3周之后，将再生的芽切下并维持在含有30g/l薦糖、300111肖八特美汀和20mg^硫酸卡那霉 素的MS培养基上用于芽的伸长。将伸长的芽移至含有补充有30g/l薦糖、2mg/l吗I噪下酸 (IBA)和500mg/L簇节青霉素的MS基础培养基的生根培养基上。在根部形成之后，将植物移 至±壤并在生长室或溫室条件下生长至种子成熟。
[0249] 大豆的±壤杆菌介导的转化
[0250] 将在本发明中确定的柳枝泰转录因子基因的大豆直系同源物（图4)装配至二重运 载体中（表9)并遵循先前所描述的流程用于±壤杆菌介导的大豆的转化化O et al. ,2006， Agrobacterium Protocols Wang K.，ed.,Vol.1,PP 397-405,Humana Press)。
[0251] 植物材料:将来自生长在温室或田地条件下的大豆植物的未成熟种子用作外植体 来源。收获幼小的豆芙并用70%的2-丙醇表面杀菌30秒和25%次氯酸钢(Clorox)表面杀菌 20分钟随后用无菌蒸馈水洗涂=次。
[0252] 培养物转化和选择:在无菌条件下，将未成熟种子自豆芙移出并将子叶与种皮分 离随后在补充有30g/l薦糖、4〇111旨八的2,4-〇和40mg/l乙酷下香酬的共培养基(MS盐和B5维 生素）中的根瘤上壤杆菌培养物(在28°C下由单个菌落生长过夜）中溫育60分钟。将侵染的 外植体远轴侧向上铺板在琼脂凝固的共培养基上并在25°C下在黑暗中溫育4天。
[0253] 对于转化组织的选择，将用500mg/l头抱嚷目亏洗涂的子叶远轴侧向上置于用于体 细胞胚形成的诱导的培养基上(含有30g/l薦糖、40mg/l的2,4-D、500mg/l头抱嚷目亏和IOmg/ 1潮霉素的GelrUe凝固的MS培养基)并在25°C下W23h的光周期（10-20地/mVs)溫育2周。 在25mg/l潮霉素的存在下在相同的条件下生长另外的两周之后，将耐抗生素的体细胞胚移 至补充有60g/l麦芽糖、500mg/l头抱嚷目亏和1〇111旨八潮霉素的用于胚成熟的MS培养基上并W 2周的继代培养区间在相同的条件下生长8周。
[0254] 植物再生和选择:将得到的子叶阶段的胚在25°C下在23h的光周期（60-80地/m2/ S)下干胆(desiccate)5-7天随后在含有30g/l薦糖和500mg/l头抱嚷目亏的MS再生培养基上 培养4-6周用于芽和根的发育。当植物为5-lOcm高时，将它们移至±壤并在环境适应7天之 后在溫室中生长。
[0255] 实施方式1.一种转基因植物，包含异源碳酸氨盐转运体，其中，所述转基因植物具 有比不包含所述异源碳酸氨盐转运体的相同种类的植物至少5%、至少10%、至少15%、至 少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的C〇2同化速率。
[0256] 实施方式2. -种转基因植物，包含异源碳酸氨盐转运体，其中，所述转基因植物具 有比不包含所述异源碳酸氨盐转运体的相同种类的植物至少5%、至少10%、至少15%、至 少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更低的降低的蒸腾速率。
[0257] 实施方式3. -种转基因植物，用包含与编码异源碳酸氨盐转运体的多核巧酸可操 作地连接的可植物表达的转录调节序列的重组DNA构建体来转化。
[0258] 实施方式4.根据实施方式1-3中任一项所述的转基因植物，其中，不存在异源的碳 酸酢酶。
[0259] 实施方式5.根据实施方式1-4中任一项所述的转基因植物，其中，所述碳酸氨盐转 运体局部化于叶绿体被膜。
[0260] 实施方式6.根据实施方式1-5中任一项所述的转基因植物，其中，所述碳酸氨盐转 运体来自蓝藻细菌。
[0261] 实施方式7.根据实施方式6所述的转基因植物，其中，所述碳酸氨盐转运体是BicA 多肤或訊tA多肤。
[0262] 实施方式8.根据实施方式7所述的转基因植物，其中，所述BicA多肤包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列或与SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。
[0263] 实施方式9.根据实施方式7所述的转基因植物，其中，所述SbtA多肤包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列或与SEQ ID N0:2 95%同源的氨基酸序列。
[0264] 实施方式10.根据实施方式1-9中任一项所述的转基因植物，其中，编码所述碳酸 氨盐转运体的多核巧酸进一步包含与碳酸氨盐转运体编码序列可操作地连接的编码叶绿 体被膜祀向肤的序列。
[0265] 实施方式11.根据实施方式10所述的转基因植物，其中，所述叶绿体被膜祀向肤的 序列包含沈Q ID NO: 10的氨基酸1至110。
[0266] 实施方式12.根据实施方式11所述的转基因植物，其中，所述碳酸氨盐转运体来自 藻类。
[0267] 实施方式13.根据实施方式12所述的转基因植物，其中，所述藻类是衣藻属。
[0268] 实施方式14.根据实施方式13所述的转基因植物，其中，所述碳酸氨盐转运体是 CCPl多肤、CCP2多肤或LCIA多肤。
[0269] 实施方式15.根据权利要求14所述的转基因植物，其中，所述CCPl多肤包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列或与SEQ ID N0:6 95%同源的氨基酸序列。
[0270] 实施方式16.根据实施方式14所述的转基因植物，其中，所述LCIA多肤包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或与SEQ ID N0:8 95%同源的氨基酸序列。
[0271] 实施方式17.根据实施方式1-16中任一项所述的转基因植物，其是选自由W下所 组成的组的油类作物植物:玻璃宦、芸苔、欧洲油菜、宪菁、亚麻莽属、大麻、红花、挪子、海甘 蓝、專距花属、非洲油栋桐、美洲油栋桐、大豆、陆地棉、海岛棉、草本棉、向日葵、亚麻、月见 草、油橄揽、水稻、篇麻、芝麻、小麦属、玉米属、胡桃和扁桃。
[0272] 实施方式18.根据实施方式1-17中任一项所述的转基因植物，其中，所述植物是亚 麻莽。
[0273] 实施方式19.根据实施方式1-18中任一项所述的转基因植物，包含至少两种异源 碳酸氨盐转运体。
[0274] 实施方式20.-种重组体多核巧酸，包含与可植物表达的转录调节序列可操作地 连接的编码异源碳酸氨盐转运体的核酸序列，其中，所述编码碳酸氨盐转运体的核酸序列 可选地进一步可操作地连接至编码叶绿体被膜祀向肤的核酸序列。
[0275] 实施方式21.根据实施方式20所述的重组体多核巧酸，其中，所述叶绿体被膜祀向 肤是拟南芥Tic20(atTic20)前体的转运肤。
[0276] 实施方式22.根据实施方式21所述的重组体多核巧酸，其中，所述核酸序列包含 沈Q ID NO:9的残基 1-330。
[0277] 实施方式23.根据实施方式20-22中任一项所述的重组体多核巧酸，其中，所述碳 酸氨盐转运体来自蓝藻细菌。
[0278] 实施方式24.根据实施方式20-23中任一项所述的重组体多核巧酸，其中，所述碳 酸氨盐转运体是BicA多肤或訊tA多肤。
[0279] 实施方式25.根据实施方式24所述的重组体多核巧酸，其中，所述BicA多肤包含 SEQ ID N0:4的氨基酸序列或与SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。
[0280] 实施方式26.根据实施方式24所述的重组体多核巧酸，其中，所述SbtA多肤包含 SEQ ID N0:2的氨基酸序列或与SEQ ID N0:2 95%同源的氨基酸序列。
[0281 ]实施方式27.根据实施方式20所述的重组体多核巧酸，其中，所述碳酸氨盐转运体 来自藻类。
[0282] 实施方式28.根据实施方式27所述的重组体多核巧酸，其中，所述藻类是衣藻属。
[0283] 实施方式29.根据实施方式20、27或28中任一项所述的重组体多核巧酸，其中，所 述碳酸氨盐转运体是CCPl多肤、CCP2多肤或LCIA多肤。
[0284] 实施方式30.根据权利要求29所述的重组体多核巧酸，其中，所述CCPl多肤包含 SEQ ID N0:6的氨基酸序列或与SEQ ID N0:6 95%同源的氨基酸序列。
[0285] 实施方式31.根据实施方式29所述的重组体多核巧酸，其中，所述LCIA多肤包含 SEQ ID N0:8的氨基酸序列或与SEQ ID N0:8 95%同源的氨基酸序列。
[0286] 实施方式32.根据实施方式20-31中任一项所述的重组体多核巧酸，进一步包含编 码选自FLAG、6X化S、谷脫甘肤-S-转移酶(GST)、HA、cMyc或AcV5的表位标记的核酸。
[0287] 实施方式33.-种植物可表达的表达载体，包含根据实施方式20-32中任一项所述 的重组体多核巧酸。
[0288] 实施方式34.根据实施方式33所述的植物可表达的表达载体，包含祀arleyGate载 体。
[0289] 实施方式35.-种生产具有增强的光合作用的转化植物的方法，所述方法包括用 根据实施方式20-32中任一项所述的重组体多核巧酸或根据实施方式33-34中任一项所述 的表达载体转化植物细胞；由所述植物细胞生长植物直至所述植物产生种子；W及由其中 相比未表达所述异源碳酸氨盐转运体的相应的植物相比光合作用增强的植物选择种子。
[0290] 实施方式36.根据实施方式35所述的方法，其中，所述植物是选自由W下所组成的 组的油类作物植物:玻璃宦、芸苔、欧洲油菜、宪菁、亚麻莽属、大麻、红花、挪子、海甘蓝、專 距花属、非洲油栋桐、美洲油栋桐、大豆、陆地棉、海岛棉、草本棉、向日葵、亚麻、月见草、油 橄揽、水稻、篇麻、芝麻、小麦属、玉米属、胡桃和扁桃。
[0291] 实施方式37.根据实施方式36所述的方法，其中，所述植物是亚麻莽。
[0292] 实施方式38.根据实施方式35-37中任一项所述的方法，其中，将光合作用的增强 测量为相对于野生型C〇2同化速率的增加或蒸腾速率的降低。
[0293] 实施方式39.根据实施方式35-38中任一项所述的方法，其中，光合作用增强至少 5%。
[0294] 实施方式40.-种嵌合蛋白，包含拟南芥atTic20转运肤和与叶绿体被膜异源的膜 蛋白。
[02M]除非上下文另外明确表示，如在本文中所使用的单数形式"一个"、"一种"、和"该" 包括复数指示物。
[0296] 数值范围包括限定该范围的数值。贯穿本说明书中给出的每个最大的数字限制旨 在包括每个较低的数字限制，如同该较低的数字限制明确地写入本文中。贯穿本说明书中 给出的每个最小的数字限制将包括每个较高的数字限制，如同该较高的数字限制明确地写 入本文中。贯穿本说明书中给出的每个数值范围将包括每个较窄的数字限制(落在较宽的 数字范围），如同该较窄的数字限制明确地写入本文中。与数量相关联使用的修饰语"约"包 括所述值，并具有上下文所表示的含义(例如，包括与特定数量的测量有关的误差程度）。
[0297] 本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。 当阅读前述描述时，那些优选实施方式的变化对本领域普通技术人员可W变得显而易见。 发明人期望技术人员视情况采用运种变化，并且发明人希望W与本文中具体地描述的不同 地实施本发明。因此，如由适用的法律允许的，本发明包括如在附加于此的权利要求中陈述 的主题的所有变化和等同物。此外，在所有可能的变化中W上描述的要素的任何组合是由 本发明所包括，除非在本文中另有指出或另外与上下文明显矛盾。
【主权项】
1. 一种转基因植物，包含异源碳酸氢盐转运体，其中，所述转基因植物具有比不包含所 述异源碳酸氢盐转运体的相同物种的植物至少5 %、至少10%、至少15%、至少20 %、至少 25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的C02同化速率。2. -种转基因植物，包含异源碳酸氢盐转运体，其中，所述转基因植物具有比不包含所 述异源碳酸氢盐转运体的相同物种的植物至少5 %、至少10%、至少15%、至少20 %、至少 25%、至少30%、至少35%或至少40%更低的降低的蒸腾速率。3. -种转基因植物，用包含与编码异源碳酸氢盐转运体的多核苷酸可操作地连接的植 物能够表达的转录调节序列的重组DNA构建体来转化。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的转基因植物，其中，不存在异源的碳酸酐酶。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的转基因植物，其中，所述碳酸氢盐转运体局部化于 叶绿体被膜。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的转基因植物，其中，所述碳酸氢盐转运体来自蓝藻 细囷。7. 根据权利要求6所述的转基因植物，其中，所述碳酸氢盐转运体是BicA多肽或SbtA多 肽。8. 根据权利要求7所述的转基因植物，其中，所述BicA多肽包含SEQ ID N0:4的氨基酸 序列或与SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。9. 根据权利要求7所述的转基因植物，其中，所述SbtA多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸 序列或与SEQ ID NO:2 95%同源的氨基酸序列。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的转基因植物，其中，编码所述碳酸氢盐转运体的 多核苷酸进一步包含与碳酸氢盐转运体编码序列可操作地连接的编码叶绿体被膜靶向肽 的序列。11. 根据权利要求10所述的转基因植物，其中，所述叶绿体被膜靶向肽的序列包含SEQ ID NO: 10的氨基酸1至110。12. 根据权利要求11所述的转基因植物，其中，所述碳酸氢盐转运体来自藻类。13. 根据权利要求12所述的转基因植物，其中，所述藻类是衣藻属物种。14. 根据权利要求13所述的转基因植物，其中，所述碳酸氢盐转运体是CCP1多肽、CCP2 多肽或LCIA多肽。15. 根据权利要求14所述的转基因植物，其中，所述CCP1多肽包含SEQ ID N0:6的氨基 酸序列或与SEQ ID N0:6 95%同源的氨基酸序列。16. 根据权利要求14所述的转基因植物，其中，所述LCIA多肽包含SEQ ID N0:8的氨基 酸序列或与SEQ ID N0:8 95%同源的氨基酸序列。17. 根据权利要求1-16中任一项所述的转基因植物，其是选自由以下所组成的组的油 类作物植物:玻璃苣、芸苔、欧洲油菜、芜菁、亚麻荠属物种、大麻、红花、椰子、海甘蓝、萼距 花属物种、非洲油棕榈、美洲油棕榈、大豆、陆地棉、海岛棉、草本棉、向日葵、亚麻、月见草、 油橄榄、水稻、篦麻、芝麻、小麦属物种、玉米属、胡桃和扁桃。18. 根据权利要求1-17中任一项所述的转基因植物，其中，所述植物是亚麻荠。19. 根据权利要求1-18中任一项所述的转基因植物，包含至少两种异源碳酸氢盐转运 体。20. -种重组体多核苷酸，包含 与植物能够表达的转录调节序列可操作地连接的编码异源碳酸氢盐转运体的核酸序 列，其中，编码所述碳酸氢盐转运体的所述核酸序列可选地进一步可操作地连接至编码叶 绿体被膜靶向肽的核酸序列。21. 根据权利要求20所述的重组体多核苷酸，其中，所述叶绿体被膜靶向肽是拟南芥 Tic20(atTic20)前体的转运肽。22. 根据权利要求21所述的重组体多核苷酸，其中，所述核酸序列包含SEQ ID NO:9的 残基1-330。23. 根据权利要求20-22中任一项所述的重组体多核苷酸，其中，所述碳酸氢盐转运体 来自蓝藻细菌。24. 根据权利要求20-23中任一项所述的重组体多核苷酸，其中，所述碳酸氢盐转运体 是BicA多肽或SbtA多肽。25. 根据权利要求24所述的重组体多核苷酸，其中，所述BicA多肽包含SEQ ID N0:4的 氨基酸序列或与SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。26. 根据权利要求24所述的重组体多核苷酸，其中，所述SbtA多肽包含SEQ ID NO:2的 氨基酸序列或与SEQ ID NO:2 95%同源的氨基酸序列。27. 根据权利要求20所述的重组体多核苷酸，其中，所述碳酸氢盐转运体来自藻类。28. 根据权利要求27所述的重组体多核苷酸，其中，所述藻类是衣藻属物种。29. 根据权利要求20、27或28中任一项所述的重组体多核苷酸，其中，所述碳酸氢盐转 运体是CCP1多肽、CCP2多肽或LCIA多肽。30. 根据权利要求29所述的重组体多核苷酸，其中，所述CCP1多肽包含SEQ ID NO:6的 氨基酸序列或与SEQ ID NO:6 95%同源的氨基酸序列。31. 根据权利要求29所述的重组体多核苷酸，其中，所述LCIA多肽包含SEQ ID NO:8的 氨基酸序列或与SEQ ID NO:8 95%同源的氨基酸序列。32. 根据权利要求20-31中任一项所述的重组体多核苷酸，进一步包含编码选自FLAG、6 XHis、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、HA、cMyc或AcV5的表位标记的核酸。33. -种植物能够表达的表达载体，包含根据权利要求20-32中任一项所述的重组体多 核苷酸。34. 根据权利要求33所述的植物能够表达的表达载体，包含pEarleyGate载体。35. -种生产具有增强的光合作用的转化植物的方法，所述方法包括 用权利要求20-32中任一项所述的重组体多核苷酸或权利要求33-34中任一项所述的 表达载体转化植物细胞； 由所述植物细胞生长植物直至所述植物产生种子；以及 选择与不表达所述异源碳酸氢盐转运体的相应植物相比光合作用增强的植物的种子。36. 根据权利要求35所述的方法，其中，所述植物是选自由以下所组成的组的油类作物 植物:玻璃苣、芸苔、欧洲油菜、芜菁、亚麻荠属物种、大麻、红花、椰子、海甘蓝、萼距花属物 种、非洲油棕榈、美洲油棕榈、大豆、陆地棉、海岛棉、草本棉、向日葵、亚麻、月见草、油橄榄、 水稻、篦麻、芝麻、小麦属物种、玉米属、胡桃和扁桃。37. 根据权利要求36所述的方法，其中，所述植物是亚麻荠属。38. 根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中，将光合作用的增强测量为相对于 野生型，C02同化速率的增加或蒸腾速率的降低。39. 根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中，光合作用增强至少5%。40. -种嵌合蛋白，包含拟南芥atTic20转运肽和与叶绿体被膜异源的膜蛋白。
【文档编号】C12N15/29GK105873940SQ201480071736
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年12月24日
【发明人】丹尼·J·施内尔, 迈恩·O·卡纳克吉, 比宾·保罗斯, 米歇尔·达科斯塔
【申请人】马萨诸塞大学