间皮细胞在组织生物工程和人造组织中的用图

间皮细胞在组织生物工程和人造组织中的用图
【专利摘要】间皮细胞和包含间皮细胞的人造组织在再生医学中的用途，其中所述间皮细胞在包含糖皮质激素的间皮保留表型培养基(MRPM)中培养。培养基、药物组合物及其用途。
【专利说明】
间皮细胞在组织生物工程和人造组织中的用途
技术领域
[0001] 本发明设及医疗、再生医学和组织工程的领域，更具体而言，设及用与生物材料组 合或不与生物材料组合的间皮细胞对患者进行治疗。
【背景技术】
[0002] 组织工程是跨学科领域，其使用材料科学和生命科学的概念、原理和方法来构造 能替代在疾病或外伤过程后损失的自然组织的生物替代物（Fuchs et al. ,2001.Ann Thorac Surg72:577-591;Shieh&Vacanti 2005.Surgery 137:1-7)。组织仿生物的成功构 建依赖于选择能够替代受损细胞，同时保有支架附着能力和重现组织的生物学性质和生物 物理性质的能力的功能的适当细胞表型。
[0003] 与皮肤组织工程的可用信息量(Pubmed数据库中与术语"皮肤组织工程"的相关论 文为3873)相比，没有关于将间皮细胞用于离体生物替代模仿浆膜的组织工程的信息。在成 体内，浆膜由附连到胶原组织薄层表面的多边形扁平间皮细胞单层组成。浆膜覆盖体腔(胸 腔、屯、包膜和腹膜)和内脏器官。成体包含与流体密切相互作用且与间皮具有相似形态和生 物化学的若干薄组织，例如角膜、骨关节、人造器官、膀脫尿道等的内表面。内脏脂肪组织间 皮因此可W成为一种自体间皮细胞的来源，其与适当支架组合后，能够通过生物工程构建 出结构和功能特征非常类似于与流体或复原中的体腔密切接触的其他薄层组织的浆膜替 代物。
[0004] 间皮最早由Bichat于1827年描述为一层具有单层扁平上皮特性的细小细胞。虽然 间皮细胞呈现出上皮细胞的形态和生化特征，但却具有不同的胚胎起源，因为间皮细胞来 源于中胚层。运尤其赋予了间皮细胞独特的表型，可W从其扁平上皮标记和特异间质标记 物的共表达中得到证实(Mutsaers&Wnkosz 2007.Cancer Treat Res. 134:1-19)。间皮细 胞表现出的主要生物学相关功能是分泌葡糖氨基葡聚糖和润滑剂，葡糖氨基葡聚糖和润滑 剂截留在其顶面上的高密度微绒毛之间，从而提供了保护性的光滑表面，有利于内脏器官 在体腔内部内运动时的优化滑动，如屯、脏跳动或肺膨胀(Odor 1954. Am J Anat.Nov; 95: 433-65 ;Mutsaers 2002.Respirology. S邱；7:171-91)。其他报告证实了间皮细胞在众多浆 膜内和间皮下过程中的中屯、地位，包括水和溶质的运输、炎症、宿主反应、血管生成、组织修 复和细胞外基质重塑（Mutsaers&Wilkosz.Cancer Treat Res 134: l-19;Mutsaers 2002.Respirology 7:171-191 ;Adam et al. ,2002.J Cell Sci 115:1383-1389)。对于本 发明特别重要的是，间皮细胞上存在的膜离子累及其性能(Park et al. ,1998.Perit Dial Int 18:402-409;Witowsky et al. ,1997.Perit Dial Intl7:186-193)和间皮细胞分泌大 量透明质酸（一种调节流体稳态、组织修复、炎症状态和感染应答的关键化合物）的能力 (Honda et al.,1993.Biochem J 292(Pt 2):497-502;0reopoulos 1998.Perit Dial Int 18:382-386;Sitter et al，.2003.Perit Dial Int 23:222-227)。透明质酸还在眼前房 (眼中位于虹膜和角膜最内表面之间的眼内的流体填充空间）的稳态中起关键作用。间皮细 胞分泌的透明质酸还可W显著改善骨关节的润滑。
[0005] 角膜是一种非常复杂的组织，是自然工程的完美范例，其中紧密胶原压实在一起 的蛋白片层的多层膜配置和血管的缺乏，形成了完全透明的晶状体（DelMonte&Kim 2011.Cataract Refract Su巧37:588-598)。此外，角膜内皮(紧密压实并牢固地附着在角 膜后弹力膜上的扁平六角形细胞单层)通过利用其强效的化+,K+-ATP酶累活性，在调节角 膜基质水合状态中起重要作用，运与其紧密连接部相组合，为该组织提供了允许营养物和 其他分子从房水渗透的半透层。角膜内皮细胞具有高度代谢活性;其怀有许多线粒体W提 供膜累最佳功能所需的足够能量。对于成体，绝大多数角膜内皮细胞处于有丝分裂间期(不 分裂），运一再生能力的缺乏，导致受损或患病的角膜内皮的角膜内皮细胞密度逐渐丧失 (Senoo&Joyce,2000.1 nvest Ophthalmol Vis Sci.Mar;" :66〇-7;Bou;rne 2003.Eye (Lond).Nov;17:912-8.;Senoo et al.,2000.Invest 0曲thalmol Vis Sci.Sep;41:293〇-5)。作为结果，角膜内皮的缺乏，导致从水状液到基质的流体流动屏障被破坏。随后，该功能 的丧失导致角膜水肿，角膜清晰度降低，并最终导致视力的丧失。鉴于运些情况，目前唯一 有效的治疗是通过角膜移植来恢复正常视力。近年来，后弹力层撕除自动内皮移植术 (DSAEK)允许选择性地更换疾病角膜内皮，取得了很好的效果(Mimura et al. ,2013.Prog Retin Eye Res. 35:1-17 ;Gorovoy 2006.Cornea S邱；25:886-9)。尽管实现了 良好的效果， 运种技术的使用至今仍因角膜供体少而极为受限。
[0006] 关于如何合并角膜内皮细胞W作为角膜移植的替代形式，已报道有许多尝试：已 有将内皮细胞种于基于壳聚糖的膜(Xiang et al.,2011.J Mater Sci Mater Med.Jan; 22:175-83)，后弹力膜（Insler&Lopezl986.Curr Eye Res 5:967-972;Insle；T(&Lopez 1991. Invest Ophthalmol Vis Sci 32:1828-1836 ;Insle；T(&Lopezl991. Cornea 10:136-148;Ab細LAQiamat et al.,1999.Exp Eye Res 69:547-553;Engelmann&F;riedl 1989.In Vitro Cell Dev Biol 25:1065-1072;E；ngelmann et al.,1999.Cornea 18:199-206; Bohnke et al.,1999.Cornea 18:207-213;Qien et al.,2001.Cornea 20:731-737;Amano 2002.Nihon Ganka Galckai Zasshil06:805-835;Amano 2003.Cornea 22:S66-74;Mimura et al.,2004.Exp Eye Res 79:231-237)，胶原基质（Mimura et al., 2004. Invest. Ophthalmo I .Vis.Sci.45,2992-2997)，人角膜基质盘化onda et al., 2009.Arch.Ophthalmol.127,1321-1326;畑oi et al.,2010.Biomaterials 31,6738-6745)，明胶水凝胶盘化ai et al.，2007.Transplantation 84,1222-1232;Watanabe et al. ,2011.Tissue Eng.Part A 17,2213-2219)，脱细胞猪角膜基质（Ju et al.， 2011.1ndian J Med ResJun;135:887-94)。然而，由于角膜内皮细胞来源的缺乏，且缺乏 满足临床要求的适当支架，例如生物相容性、透明度和机械强度，角膜组织工程仍存在重大 问题。
[0007] 滑膜的完整性对于充当优化软骨的滑动的润滑剂的滑液的正确生产和保留具有 关键作用。由于创伤、滑膜炎或退化性疾病，如类风湿性关节炎结果，关节囊可能不再维持 其正常完整性和功能，从而导致了滑液的生产或保留的缺陷（Trofimova 1970.Vopr Revm 10:55-61 ;0stergaard et al.,2001.Ann 化6皿 Dis 60:233-236)。
[000引另外，已有提议将数种不同的细胞类型用于气管导管仿生物生物工程（He et al. ,2012.Regen Med 7:851-863)。类似于气管，食道是大直径肌肉管道，其作用可W将食 物从口腔运输到胃肠道。其他类似的上皮是作为膀脫内腔和尿道内衬的尿路上皮。许多先 天病症(主要是尿道下裂和尿道上裂)或后天病症(创伤病，狭窄等)影响其功能的完整性， 并需要将其替代为较多或较少的程度来重新建立其正常功能（Baird et al.，2005. J Urol.174:1421-4;化rsichetti et al.,2006.Plast Reconstr Surg.117:708-10)。
[0009] 有必要开发新的药物组合物和人造组织，来恢复简单复层扁平上皮和浆膜。

【发明内容】

[0010] 本发明的第一方面设及使用间皮细胞用于制备部分或全部提高、复原或替代患病 或损伤的器官或组织的功能活性的药物。在一个优选实施例中，所述间皮细胞在包含糖皮 质激素的适当培养基中培养。在又一优选实施例中，所述糖皮质激素是氨化可的松。在又一 优选实施例中，所述患病或受损组织为内皮。在又一优选实施例中，所述患病或受损组织选 自作为血管和淋己管内表面内衬的内皮或角膜内皮。在又一优选实施例中，所述患病或受 损组织是浆膜。
[0011] 本发明的第二方面设及用于制备人造组织的体外方法（W下称为"本发明方法"）， 包括：
[0012] a.在支撑材料上接种分离的间皮细胞;和
[0013] b.在含糖皮质激素的适当培养基中培养如步骤a中所述支撑材料中的所述分离的 间皮细胞，其中所述适当培养基优选为间皮保留表型培养基（Mesothelial Retaining Phenotype Media，MRPM)。
[0014] 本发明所述第二方面的一个优选实施例中，所述可优选为间皮保留表型培养基 (MRPM)的适当培养基含有氨化可的松。在一个更优选的优选实施例中，所述氨化可的松浓 度范围为0.1至10化g/ml，在一个更优选的优选实施例中，所述氨化可的松的浓度为约化g/ ml O
[0015] 本发明所述第二方面的一个优选实施例中，所述间皮细胞源自脂肪组织。在又一 优选实施例中，所述间皮细胞是自体脂肪组织间皮细胞(ATMCs)。
[0016] 在又一优选实施例中，所述支撑材料源自天然或合成来源。在一个更优选的优选 实施例中，所述支撑材料是单丝或复丝结构的线。在一个更优选的优选实施例中，所述支撑 材料是丝纳米纤维层。在又一优选实施例中，所述支撑材料是连接到针的缝合线。在又一优 选实施例中，所述支撑材料是缝合钉。
[0017] 本发明的第=方面设及根据本发明方法得到的人造组织（W下称为"本发明的人 造组织"）。本发明的第四方面设及本发明的人造组织用于评估药理学产品和/或化学产品 中的用途。
[0018] 本发明的第五方面设及本发明的人造组织，其用于医药或用作药物，或可选地，本 发明的人造组织用于医药的用途。
[0019] 本发明的第六方面设及本发明的人造组织，其用于制备用于部分或全部提高、复 原或替代患病或损伤的器官或组织的功能活性的药物，或可选地，设及本发明的人造组织 用于制备用于部分或全部提高、复原或替代患病或损伤的器官或组织的功能活性的药物的 用途。
[0020] 本发明的第屯方面设及一种包含间皮细胞和/或本发明的人造组织的药物组合物 (W下称为"本发明的药物组合物"）。在一个优选实施例中，本发明的药物组合物进一步包 括药学可接受载体。在又一优选实施例中，本发明的药物组合物进一步包括活性成分。
[0021] 本发明的第八方面设及类固醇激素或包含类固醇激素的组合物的用途，其用于避 免上皮-间质转化类化MT)。在一个优选实施例中，所述类固醇激素为糖皮质激素，更优选为 氨化可的松。本发明的第九方面设及类固醇激素或包含类固醇激素的组合物，用于预防和 治疗成纤维化，且更优选为用于预防和治疗腹膜的成纤维化。
[0022] 本发明的第十方面设及一种培养基（W下称为"本发明的培养基"），其包含类固 醇，优选为糖皮质激素，且更优选为氨化可的松。更优选地，其包含低浓度的血清，并添加培 养补充物B27和0-琉基乙醇(抗氧化剂）。
[0023] 本发明的第十一方面设及本发明的培养基用于避免上皮-间质转化类化MT)的用 途，且优选为用于令培养于塑料表面及生物支架上的间皮细胞形成卵石状铺面，例如在如 本发明实施例中所示的晶状体前囊(胶原薄层）中的情形。
【附图说明】
[0024] 图1. W膜蛋白酶消化分离鼠脂肪组织间皮细胞(ATMCs) D(A)左侧照片所示为小鼠 内脏脂肪垫手术分离后的典型形貌。右图显示了脂肪垫经膜蛋白酶消化后释放的脂肪组织 间皮细胞(ATMCs)的典型形貌。（B)MRPM(间皮保留表型培养基）中培养48小时后的ATMCs表 征。左侧图像所示为在MRPM中经过48小时后的ATMCs培养物的典型间皮卵石样形态。ATMCs 表现出密合性蛋白e-连环蛋白和ZO-U紧密连接蛋白-1)的典型上皮细胞间表达(箭头）。细 胞核用赫斯特33342化oechst 33342)复染。
[002引图2. MRPM中培养的脂肪组织间皮细胞表现出对上皮-间质转化巧MT)的抑制。左上 和左下照片所示为在对照培养基(无氨化可的松的培养基)和MRPM培养基制剂（间皮保留表 型培养基，即含liig/ml氨化可的松的对照培养基）中培养48小时后的脂肪组织间皮细胞 (ATMCs)的相衬图像。MRPM中培养的ATMCs表现出上皮细胞的卵石样形态。相比之下，对照培 养基中培养的ATMCs更接近梭形，该形态与其EMT起始相符。中上和中下图像所示为在对照 培养基和MRPM中培养的ATMCs的F-肌动蛋白免疫染色。在对照培养基中培养的ATMCs表现出 增加的F-肌动蛋白表达，与EMT相符，最重要的是，在其细胞质中表现出F-肌动蛋白阳性肌 原纤维，该数据与其向间质平滑肌样表型过渡相符。相比之下，培养于MRPM中的ATMCs表现 出F-肌动蛋白阳性环状染色，运是在上皮细胞中观察到的典型模式。右上和右下图像所示 为相应的a-SMA染色，表明对照培养基中培养的ATMCs表现出与其EMT起始相符的Q-SMA表 达，而在MRPM中培养的ATMCs仅表现出极低a-SMA表达，该数据证实其没有经历EMT。细胞核 用赫斯特33342化oechst 33342)复染为蓝色。
[0026] 图3.氨化可的松（化g/ml)抑制脂肪组织间皮细胞中血清诱导和EGF诱导的EMT。 (A)在基础培养基、基础培养基+liig/ml氨化可的松(MRPM)、MRPM+20ng/ml EGF和基础培养 基+20ng/naEGF中培养3天的ATMCs的a-SMA免疫巧光表达的比较。（B)同一实验的免疫印迹 分析表明了不同条件下相对于e-肌动蛋白表达的曰-SMA表达。每一蛋白泳道对应于20yg总 蛋白。
[0027] 图4.糖皮质激素受体括抗剂(抓-486)抵消氨化可的松对ATMCs的EMT的抑制。（A) 在MRPM和MRPM+10皿RU-486中培养5天的ATMCs的比较相衬图像。在MRPM中培养的ATMCs并 没有表现出卵石样单层，而在MRPM+10皿中培养的ATMCs表现出上皮和成纤维混合形态。比 较a-SMA免疫巧光染色表明了大成纤维a-SMA阳性细胞在MRPM+lOwii抓-486培养基中的存 在。（B)在MRPM和MRPM+lOym的RU-486中培养5天后的ATMCs的a-SMA免疫巧光表达的 MetaMor地分析。数据代表在相同的条件下的n = 3个不同培养物。
[0028] 图5.脂肪组织间皮细胞接种12小时后的晶状体前囊。左上图所示为W小鼠 ATMCs 接种并在MRPM中培养12小时后的晶状体前囊(HALC)的4X相衬图像。黑色箭头指向HALC的外 边界。图像左下区域所示为粘附ATMCs的塑料区。右上图所示为左上图的点区域的放大图。 黑色箭头指向HALC的外边界，该处有大量ATMCs聚集在其边界处。下图所示为HALC表面的高 倍放大，此处许多粘附ATMCs表现出间皮细胞(箭头）的典型多边形形态，蔓延到HALC表面。 与ATMCs共培养的HALC在此时只有少数细胞表现出W圆形形态(箭头)来鉴别的增殖特征。
[0029] 图6.脂肪组织间皮细胞接种24小时后的晶状体前囊。左上图所示为W小鼠 ATMCs 接种并在MRPM中培养24小时后的晶状体前囊(HALC)的4X相衬图像。白色箭头指向HALC的外 边界。图像下方区域所示为粘附ATMCs的塑料区。右上图所示为左上图的点区域的放大图。 白色箭头指向HALC的外边界，注意MRPM培养24小时后，许多ATMCs此时表现出更圆的形态且 有折射力(见箭头），该形态特征表明其增殖活跃。下图所示为HALC表面的高倍放大，此处许 多粘附ATMCs表现出间皮细胞(箭头）的典型多边形形态，蔓延到HALC表面。与ATMCs共培养 的HALC此时只有少数细胞表现出可通过圆形形态(箭头)来鉴别的增殖特征。
[0030] 图7.脂肪组织间皮细胞接种72小时后的晶状体前囊。左上图所示为W小鼠 ATMCs 接种并在MRPM中培养72小时后的晶状体前囊(HALC)的4X相衬图像。白色箭头指向HALC的外 边界。右上图所示为HALC LAC表面的放大图。白色箭头指向HALC LAC的外表面。注意MRPM培 养72小时后，完全汇合的ATMCs呈现出更圆的形态且具有折射力(见箭头），该形态特征表明 其增殖活跃。左下图所示为HALC表面的高倍放大，此处许多粘附ATMCs表现出间皮细胞的典 型多边形和卵石状形态。完全汇合的ATMCs彼此紧密接触(箭头）。右下图所示为HALC表面上 形成的ATMCs单层的Q-SMA和F-肌动蛋白共免疫染色巧光。注意ATMCs将F-肌动蛋白表达限 制在其内胞浆膜(箭头），运是未分化的间皮细胞的标记性特征。与其保留间皮表型相符地， 所述细胞在弥漫性细胞质颗粒染色检测下仅表现出有限的O-SMA表达，该特征表明在HALC 上MRPM中培养的ATMCs并没有经历EMT。
[0031] 图8.在LACs上培养72小时的ATMCs的TEM超微结构分析。（A)上图所示为间皮化72 小时的HALC的薄横截面的透射电子显微镜（TEM)图像。总共可W观察到3个ATMCs附着于 HALC基底膜上。右上图所示为左图中所绘点的放大图。ATMCs的顶端表面表现出典型的顶膜 突起或微绒毛(黑色箭头KATMCs还表现出众多线粒体。左下图所示为左上图中所绘点的放 大图。右下图所示为为左中图中所绘点的放大图。注意ATMCs如何在顶侧面胞间接触中呈现 出高电子密度的紧密连接复合物。（B)左图所示为与HALC ATMCs基底膜紧密接触的ATMCs基 底膜的代表性形貌，其通常沿其基底膜(黑色箭头)所有部分呈现众多规则分离的内陷。插 入运些内陷之间的是所观察到的与HALC表面接触的高电子密度斑块，运与粘附复合物相 符。右图所示为ATMCs基底膜的放大图。
[0032] 图9.ATMCs片的体外工程。（A)左图所示为在含有B2巧h充剂的无血清培养基中培 养3天并从塑料表面剥离的单层ATMCs的相衬图。剥离的ATMCs单层在细胞完全回缩后，形成 ATMCs圆形超层。右图所示为剥离和回缩后的ATMCs片的放大图。（B)ATMCs片的F-肌动蛋白 免疫染色。左图所示为F-肌动蛋白染色的间皮细胞片的低倍放大图。右图所示为较高倍率 放大图，能够观察到细胞回缩后达到的高细胞密度。F-肌动蛋白的表达非常少，大多位于细 胞间接触处。
[0033] 图10.丝纳米纤维层达到完全间皮化所需的步骤示意图。在丝纳米纤维层中接种 自体脂肪组织间皮细胞(ATMCs)并在MRPM中培养，使得ATMCs附着增殖到该层上，并达到全 覆盖，从而建立表现出接触抑制增长的紧凑间皮层。
[0034] 图11.自体脂肪组织间皮细胞结合至脱细胞ECM或丝纳米纤维层的示意图。间皮细 胞上存在的化+-化2+atp酶离子累允许流体传输。此外，间皮细胞能合成透明质酸并将其释 放在体腔液中。
[0035] 图12.使用间皮化的丝纳米纤维层替代滑膜的示意图。可W使用滑膜仿生物来修 复滑膜损伤的骨关节。
[0036] 图13.使用间皮化的丝纳米纤维层替代浆膜的示意图。缺乏间皮的浆膜间皮下组 织暴露在经历朝成纤维细胞转变的EMT的间皮下细胞下，从而导致腹腔粘连。浆膜仿生物 (即怀有自体脂肪组织间皮细胞的丝纳米纤维层）的并列，能够复原光滑的非粘附性表面， 避免了浆膜粘连。
[0037] 图14. W间皮化的丝纳米纤维层作为血管移植物管腔层内衬。生物或假体血管移 植物容易通过W间皮细胞单层替代受损内皮来恢复。
[0038] 图15.MCECs培养物的分离和建立。角膜内皮细胞剥离通常会释放后弹力膜大碎片 (A)，从该剥离过程中剥离出角膜内皮层的大碎片。（B)(C)MCECs群贴壁培养产生MCECs的紧 密单层，其呈现多边形形态(见放大点）。化)MCECs第一次传代培养结束后的形态，可观察到 紧密拥挤的MCECs大型团簇。化，F)所示分别为第二次和第S次传代培养步骤结束后的 MCECs形态的代表性形貌。注意MCECs在连续的传代培养步骤中保留原有的卵石形态。
[0039] 图16.角膜内皮细胞标志物的定量RT-PCR分析。在整个角膜、剥离的角膜内皮、第3 代传代MCECs (P3MCECS )、新鲜分离的ATMCs (do ATMCs)和在MRPM中培养2天的ATMCs (D2ATMCS)中分析C0L4A2，C0L8A2，化C4A4，CAR2，化+/K+-ATP酶和N-巧粘蛋白基因的表达 谱。从6只小鼠中分离的剥离的角膜内皮用作校准样品（黑色柱）。基因表达相对于YWHAZ(管 家基因）的表达水平进行归一化。结果表示为相对于校准样品(设置为1)的mRNA表达的平均 倍数变化±标准误差，W3次不同的角膜分离和3次独立的MCECs和ATMCs分离和培养来进行 计算。用学生t-检测来确定统计显著性(冲<0.05和*冲<0.03)。
[0040] 图17.角膜内皮细胞标志物在MCECs和ATMCs培养物中的表达模式的免疫巧光分析 比较。左图所示为F-肌动蛋白和角膜内皮标记物C0L8A2、N-巧粘蛋白、ZO-1、0连环蛋白、化 +/K+-ATP酶和化C4A4在小鼠角膜中的代表性免疫表达水平，W供参照。中图和右图所示为 传代培养的MCECs (第3代)和MRPM培养的ATMCs中分别所得的免疫表达方式。细胞核用赫斯 特33342化oechst 33342)复染为蓝色。
【具体实施方式】
[0041] 本发明展示了特定条件下的间皮细胞培养，在含低血清浓度的培养基中维持了其 原有的间皮表型并抑制了其上皮-间质转化化MT),还展示了间皮细胞能有效地附着到不同 的生物材料上，保持单层增殖直到覆盖整个区域的能力和表现增殖接触抑制的能力。
[0042] 从此意义而言，本发明的作者已经证实，间皮成熟内脏脂肪组织是一种用于分离 具有结构和功能替代能力的自体细胞的宝贵来源:i)许多器官和组织的浆膜壁;ii)损坏的 角膜内皮；iii)软骨和透明质酸的生产；iv)人造尿道、气管和其它组织和器官的间皮和内 皮细胞;V )人造血管的内皮细胞等。
[0043] 另外，本发明的作者已开发了一种使用从内脏脂肪组织中分离的间皮细胞实现不 同的生物材料(如晶状体前囊脱细胞基底膜、丝层、胶原蛋白，和其它器官组织)的完整间皮 化的方法。从图1-4所示的结果，可W清楚地得出结论:在适当的培养基如包含糖皮质激素 的MRPM(间皮保留表型培养基）中培养的脂肪组织间皮细胞，响应于专口设计的减少其上 皮-间质转化的培养基制剂，保留了其原始表型间皮。从图5-8中所示的结果，可W清楚地得 出结论:接种到晶状体前囊化ALC)的脂肪组织间皮细胞附着到其表面上，积极地增殖，并恢 复其表面至全覆盖，并产生呈现接触抑制生长的卵石样单层。图9所示为可W单层培养且可 W分离W形成薄间皮膜的ATMCs。
[0044] 因此，本发明提供了间皮细胞用于设计人造组织和器官和用于替代内皮、浆膜和 单层扁平上皮的新用途，其中W错定或不错定到支持材料的细胞作为基底膜。
[0045] 因此，本发明的第一方面设及间皮细胞用于制备药物的用途，或可选地，间皮细胞 在医药中的用途。本发明的另一方面设及间皮细胞用于制备药物，W部分或完全提高、恢复 或替代患病或受损组织或器官的功能活性的用途，或可选地，设及间皮细胞，W部分或完全 提高、恢复或替代患病或受损组织或器官的功能活性的用途。在一个优选实施例中，所述患 病或受损组织为内皮。在又一优选实施例中，所述患病或受损组织选自作为血管和淋己管 内表面内衬的内皮或角膜内皮。在又一优选实施例中，所述患病或受损组织是浆膜。在又一 优选实施例中，所述患病或受损组织是单层扁平上皮。在又一优选实施例中，所述患病或受 损组织选自角膜内皮、滑膜、内气管层，食道上皮和膀脫上皮。在又一优选实施例中，所述间 皮细胞是人间皮细胞。在又一优选实施例中，所述间皮细胞源自脂肪组织。在又一优选实施 例中，所述间皮细胞在适当的培养基中培养，优选为含类固醇激素的间皮保留表型培养基 (MRPM)，更优选为糖皮质激素，更优选为氨化可的松。在本发明的又一优选实施例中，所述 氨化可的松的浓度为0.1至10化g/ml，更优选为0.5-50μg/ml，更优选地，所述氨化可的松的 浓度约为化g/ml。
[0046] 本发明的另一方面设及在适当的培养基(优选为含类固醇激素的间皮保留表型培 养基(MRPM)，所述类固醇激素更优选为糖皮质激素，更优选为氨化可的松）中培养的人间皮 细胞(优选为脂肪组织人间皮细胞），用于制备药物，W部分或完全提高、恢复或替代患病或 受损组织或器官的功能活性的用途。优选地，该氨化可的松的浓度为0.1至10化g/ml，更优 选为0.5-50μg/ml，更优选的氨化可的松浓度约为化g/ml。
[0047] 在又一实施例中，可W将细胞与支撑材料成分一起植入或注射入患者。运可确保 细胞保持在病人体内的适当位置。在又一优选的实施例中，支撑材料是天然或合成来源。在 又一更优选的实施例中，所述天然来源的支撑材料选自丝、脱细胞的牛肠系膜浆膜、脱细胞 牛屯、包膜及其组合。在一个更优选的实施例中，所述支撑材料是单丝或复丝结构的线，且在 一个特定的实施例中，所述支持材料为丝纳米纤维层。
[0048] 支撑材料的其他实施例包括基于胶原蛋白的支撑材料、基于纤维蛋白的支撑材 料、基于层粘连蛋白的支撑材料、基于层粘连蛋白的支撑材料、基于纤连蛋白的支撑材料和 人造支持材料。上述列举仅供说明举例，并且不旨在进行限制。本领域技术人员可W理解， 可W使用一种或多种基质形成组分的任意组合。
[0049] 在又一实施例中，所述细胞可包含在微球内。在该实施例中，细胞可W封装在微球 中屯、内。在此实施例内，还可W将细胞嵌入微球的基质材料中。所述基质材料可W包括任何 适当的可生物降解聚合物，包括但不限于:藻酸盐、聚乙二醇(PLGA)、纤维蛋白及丝胶蛋白 和聚氨醋。上述列举仅供说明举例，并不意在具有限制性。
[0050] 在又一实施例中，细胞可W附着于供植入的医疗装置。上述医疗设备的例子包括 支架、销、缝针、裂口、起搏器，人造关节，人造皮肤，和棒条体。上述列举仅供说明举例，并不 意在具有限制性。本领域技术人员可W理解，运些细胞可W通过多种方法来附着到医疗器 械。例如，细胞可W用纤维蛋白、整合素家族中的一种或多种、巧粘蛋白家族中的一种或多 种、选择蛋白家族中的一种或多种、细胞粘附分子(CAMS)中的一种或多种、免疫球蛋白家族 中的一种或多种和一种或多种人造附着剂来附着到医疗设备。上述列举仅供说明举例，并 不意在具有限制性。本领域技术人员可W理解，可W使用一种或多种附着剂的任意组合。
[0051] 本发明的又一方面设及用于制备人造组织的体外方法（W下称为"本发明的方 法"），包括：
[0052] a.在支撑材料上接种分离的间皮细胞;和
[0053] b.在适当培养基中培养如步骤a中所述支撑材料中的所述分离的间皮细胞，其中 所述适当培养基优选为包含糖皮质激素的间皮保留表型培养基(MRPM)。
[0054] 间皮细胞是来自间皮的细胞。尽管如此，其呈现出单层扁平上皮细胞的特征，并由 此形成了包封体腔和内脏器官的壁的内衬单层扁平上皮。间皮细胞的主要功能是为内脏器 官的正确运动提供光滑的表面，也积极参与水和溶质的运输、炎症、宿主反应、血管生成、组 织修复W及细胞外基质重塑。
[0055] 本申请所称的"间皮"是指一种仅具有如维护浆膜完整性和炎症及分泌大量"润滑 剂"W有利于相对浆膜层的正确滑动的生理功能的组织。
[0056] 本申请所称的术语"间皮细胞"指的是从间皮分离并表达典型间皮细胞标记物的 细胞，所述标记物包括，但不限于，巧网膜蛋白，细胞角蛋白，结蛋白，N-巧粘蛋白，E-巧粘蛋 白，角蛋白，间皮素，波形蛋白，WTU肾母细胞瘤易感基因1)，紧密连接蛋白-I(ZO-I)，0连环 蛋白，细胞角蛋白IS(CKlS)，细胞角蛋白19(CK19)，CD44，CD29(整合素01)，CD54(CAM-1)和 Islet I(Isll)O
[0057] 本发明方法的步骤a中的间皮细胞在包含糖皮质激素的适当培养基中培养和保 持，优选为"间皮保留表型培养基"（MRPM)，W保持其原始表型，MRPM配制为:DMEM低葡萄糖 GlutaMax培养基(21885-05，Gibco公司），进一步补充2%热灭活FBS(Lonza公司）、1%B2巧h 充剂（17504 ,Gibco公司）中，1 %青霉素-链霉素(Gibco公司），IOOiiM的0-琉基乙醇(31350-010，G化CO公司）和用于抑制培养物中的间皮细胞的上皮-间质转化化MT)的化g/ml氨化可 的松(Sigma Aldrich公司）。
[0058] 其它类型的能够保留细胞原始表型的适当培养基，由DMEM低葡萄糖Glutamax培养 基、热灭活FBS、B2巧h充剂、青霉素-链霉素、e琉基乙醇和氨化可的松的独特组合组成。
[0059] 本发明方法的又一优选实施例中，所述适当培养基，优选为间皮保留表型培养基 (MRPM)，含有氨化可的松。在又一优选实施例中，氨化可的松的浓度范围为0.1至10化g/ml， 更优选0.5至50μg/ml，更优选的氨化可的松浓度约为化g/ml。
[0060] 在又一优选的实施例，本发明的体外方法，包括W下步骤：
[0061] i)获取包含分离的间皮细胞的组合物；
[0062] ii)在适当培养基中培养如步骤i中所述的分离间皮细胞，优选为间皮保留表型培 养基(MRPM)，含糖皮质激素；
[0063] iii)将从步骤ii中培养所得的分离间皮细胞接种到支撑材料上;和
[0064] iv)在适当培养基中培养如步骤iii中所述支撑材料中的所述分离的间皮细胞，优 选为含糖皮质激素的间皮保留表型培养基(MRPM)。
[0065] 在又一优选的实施例，本发明的体外方法，包括W下步骤：
[0066] i.向包含间皮细胞的样品添加包含膜蛋白酶的组合物；
[0067] ii.在含糖皮质激素的适当培养基中培养分离的如步骤i中所述间皮细胞组合物；
[0068] iii.将从步骤ii中培养所得的分离的间皮细胞接种到支撑材料上;和
[0069] iv.在适当培养基中培养如步骤iii中所述支撑材料中的所述分离的间皮细胞，优 选为含糖皮质激素的间皮保留表型培养基(MRPM)。
[0070] 在本发明的本实施例中，优选地，间皮保留表型培养基(MRPM)含有氨化可的松。在 又一优选实施例中，氨化可的松的浓度为0.1至10化g/ml，更优选0.5至50μg/ml，更优选的 氨化可的松的浓度约为化g/ml。在一个优选实施例中，所述间皮细胞是人间皮细胞。在又一 优选的实施例中，所述间皮细胞源自脂肪组织，更优选为内脏脂肪组织。"脂肪组织"是指任 何内脏脂肪组织。内脏脂肪组织可W从不同的解剖来源分离，如屯、脏或屯、包膜脂肪组织的 周围内脏脂肪，或肾周围的腹膜内脏脂肪库、肠系膜脂肪组织和网膜脂肪组织。如果需要将 间皮细胞自体移植到对象中，则可从该对象分离该脂肪组织。
[0071 ]"源自脂肪组织的间皮细胞"指的是源于内脏脂肪组织的间皮细胞。
[0072] 本发明的间皮细胞可W是自体、同种异体或异种来源的细胞。在一个特定实施例 中，所述细胞是自体来源的，分离自其投放对象的脂肪组织，因此减少了对所述细胞的抗原 性和/或免疫原性应答相关的潜在并发症。
[0073] 术语"培养(物rkul化re)指细胞、生物体、多细胞实体或组织在培养基中的任何 生长。"培养"（culturing)指的是实现运种生长的任何方法，并且可W包括多个步骤。术语 "进一步培养"（化dher culturing)是指将细胞、有机体、多细胞实体或组织培养至一定生 长阶段，然后使用另一种培养方法，使所述细胞、有机体、多细胞实体或组织达到另一生长 阶段。"细胞培养物"是指体外生长的细胞。在所述培养物中，细胞增殖，但本身并不构成组 织。"组织培养"是指维持组织(例如，原生器官或成熟器官的体外外植体）的生长W保持其 结构和功能。"单层培养(物r是指一种培养(物），其中在适当的培养基中进行细胞繁殖，且 主要彼此附着并附着在基底上。另外，"悬浮培养(物)"指的是细胞在其中繁殖且悬浮在适 当的培养基中的培养(物）。同样地，"连续流动培养(物r指在连续流动的新鲜培养基中培 养细胞或外植体W维持细胞的生长(如活性）。术语"条件培养基"是指，与培养的细胞接触 一段时间后发生改变从而包含了某些由细胞产生并分泌到培养基中的旁分泌和/或自分泌 因子的培养基的上清液(例如不含培养的细胞/组织）。"汇合培养(物r是一种细胞培养物， 其中所有的细胞均彼此接触并由此铺满培养容器的整个表面，并且意味着细胞也达到其最 大密度，但是汇合并不一定意味着分裂将停止或细胞群大小将不再增加。
[0074] 术语"培养基"或"介质"是本领域周知的，一般指的是用于活体细胞培养的任何物 质或制剂。提及细胞培养时所称的术语"培养基"包括细胞周围环境的组分。培养基可W是 固体、液体、气体或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基W及不维持细胞生长的 液体培养基。培养基还包括凝胶状培养基，例如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性 气体培养基包括令培养皿或其它固体或半固体支持物上培养的细胞所处的气相。术语"培 养基"也指意在用于细胞培养物中的材料，即使其尚未与细胞接触。亦即，培养基是为细菌 培养而制备的营养丰富的液体。同样，与水或其他液体混合而适于细胞培养的粉末混合物 可称为"粉状培养基"。"确定成分培养基"指的是由化学上确定的(通常是纯化的）成分组成 的培养基。"确定成分培养基"不包含未充分表征的生物提取物，如酵母提取物和牛肉汤。 "丰富培养基"包括用于支持特定物种的大部分或全部活性形式的生长培养基。丰富培养基 通常包括复杂的生物提取物。"适合于高密度培养的生长培养基"是当其他生长条件(如溫 度和氧气输送速率)允许时，允许细胞培养物的0D600达到3或W上的任何培养基。术语"基 本培养基"是指能促进不需要任何特殊营养补充物的许多种类微生物生长的生长培养基。 大多数基础培养基通常由四种基本化学种类组成:氨基酸，碳水化合物，无机盐和维生素。 基础培养基通常用作更复杂的培养基的基础，向其中补充诸如血清，缓冲剂，生长因子，月旨 质等。基础培养基的例子包括，但不限于，伊格尔化agles)基础培养基，最低限度必需培养 基，杜氏（Dulbecco'S)改良伊格尔培养基，培养基199，营养混合物Ham'S F-IO和Ham'sF-12，Mc Coy's 5A，杜氏 MEM/FI 2，RPMI 1640,和 Iscove 氏改良杜氏培养基（IMDM)。
[0075] 对于源于脂肪组织的间皮细胞群，术语"基本纯净的"，是指相对于构成总细胞群 的源自脂肪组织的基质细胞，至少约75%、优选至少约85%、更优选至少约90%、最优选至 少约95%纯净的来自脂肪组织间皮细胞群。亦即，术语"基本纯净的"是指本发明的源自脂 肪组织的基质细胞中，其中在未经过后续培养和增殖的原始未增殖分离细胞群中包含少于 约20%、更优选少于约10%、最优选小于约5%的谱系定型细胞。
[0076] 本申请所称的"支撑"（Support)是指可作为用于间皮细胞生长(且更优选为脂肪 组织来源的间皮细胞的生长)的基础或基质的任何设备或材料。
[0077] 。间皮保留表型培养基(MRPM)"从DMM低葡萄糖GlutaMax培养基(21885-05 ,Gibco 公司）配制而来，其中补充有低浓度（2%)灭活小牛血清化onza公司），1%B27补充剂 (17504，G化CO公司），1 %青霉素-链霉素(G化CO公司）和IOOiiM抗氧化剂0琉基乙醇(31350-OlO ,Gibco公司）。此外，MRPM培养基可W进一步包含高浓度（liig/ml)糖皮质激素氨化可的 松化0888，Sigma Al化ich公司）W抑制EMT。通过氨化可的松浓度范围化g/nd到lOOng/ml， 优选约化g/ml，可实现对ATMCs的EMT的有效抑制。
[0078] 除非另有说明，否则无需依循上段中所述MRPM组分的组合顺序。
[0079] 本发明的体外方法的又一优选实施例中，所述支撑材料是从天然或合成来源。在 一个更优选的实施例中，所述天然来源的支撑材料选自W下各项:丝，从肠系膜中分离的脱 细胞牛浆膜，脱细胞牛屯、包膜及其组合。在一个更优选的实施例中，所述支撑材料是单丝或 复丝结构的线。在一个特定的实施例中，所述支撑材料是丝纳米纤维层。
[0080] 支撑材料的其他例子包括基于胶原支撑材料是一种基于纤维蛋白的支撑材料，基 于层粘连蛋白支撑的材料，基于纤连蛋白的支撑材料和人造支持材料。上述列举仅供说明 举例，并且不旨在进行限制。本领域技术人员可W理解，可W使用任何传统或先进生物材 料、矫形生物材料或生物材料的组合。
[0081] 在一个更优选的实施例中，所述支撑材料是单丝或复丝结构的线。
[0082] 图10所示为用于实现丝纳米纤维层的全间皮化所需的步骤的示意图。因此，在一 个更优选的实施例中，所述支撑材料是丝纳米纤维层。
[0083] 传统上，缝线是用于实现组织快速愈合的经典方法。通过初期缝合实现的愈合设 及使用连接到缝合线一端的金属针连续穿过伤口两侧之间，将缝合线引入组织，从而令伤 口的边缘重叠。此外，缝合线用于外科手术中W止住流血(止血）W及修复器官和人体其它 结构。在某些情况下，由于所述缝合线所处的组织的愈合困难，因此缝合线纤细。
[0084] 组织缝合的最大缺点，是针直径大于线，运使得针的插入点不会被后者完全占满， 从而产生可能损失流体的区域。所述不良伤口闭合经常会导致术后并发症，例如在癌或憩 室病患者中执行先切除患病肠后连接健康两端的肠吻合术时的情形。在所述患者中，由于 闭合不完全，其可能会漏出粪便侵入周围组织，导致腹膜炎，随之给病人生命带来风险。在 肠壁厚度减小的患者中所述风险提高，如在炎性肠病的情况中。间皮细胞可W应用在缝线 上，由此密封因线通过织物的通道产生的开口。然后，在又一优选实施例中，所述支撑材料 是连接到针上的缝合线。
[0085] 术语"缝合线"是指可用于缝合伤口的线或纤维或其它固定材料。
[0086] 作为缝合线经典方法的替代，可W使用缝合钉。其允许组织在更短的时间内完成 一期缝合，减少出血量，降低污染，保持血液流动。在一期愈合中使用缝合钉的限制因素在 于，需要接触该需接合的组织的顶部和底部。另外，插入缝合钉时的施力时将可能导致组织 撕裂。然后，在又一优选的实施例中，所述支撑材料为缝合钉。
[0087] 本申请的人造组织
[0088] 本发明的又一方面设及本发明的体外方法可获得的人造组织（下文中称为"本发 明的人造组织"）。
[0089] 在本发明的运一方面的一个优选实施例中，本发明的人造组织是一种内皮替代组 织或人造内皮。
[0090] 在本发明的运一方面的另一优选实施例中，本发明的人造组织是角膜替代组织或 人造角膜。
[0091] 在本发明的运一方面的另一优选实施例中，所述人造组织是浆膜替代组织或人造 浆膜。
[0092] 在本发明的运一方面的另一优选实施例中，所述人造组织是滑膜替代组织或人造 滑膜。
[0093] 在本发明的运一方面的另一优选实施例中，所述人造组织是气管替代组织或人造 气管。
[0094] 在本发明的运一方面的另一优选实施例中，所述人造组织是食道替代组织或人造 食道。
[00M]在本发明的运一方面的另一优选实施例中，所述人造组织是矫形生物材料。
[0096] 在本发明的该第二方面的又一优选实施例中，本发明的人造组织是尿道替代组织 或人造尿道。通过本发明的方法获得的人造组织在使用中可切成所需的尺寸和/或提供为 适当的形态。
[0097] 在使用前，可W评估本发明的人造组织用于执行其功能的适用性，例如，但不限 于，通过本说明书的实施例中所描述的任何方法。
[0098] 在药理学产品或化学产品评估中使用本发明的人造组织
[0099] 药品和化工产品向实验动物给药前，必须进行评估。就此方面，欧盟批准了若干报 告和指令，其目的是限制甚至禁止化妆品方面的动物试验(欧洲理事会关于成员国化妆品 法律法规的76/768/EEC号令），且完全禁令预期将在未来数年内完全生效。欧洲联盟支持所 有主要目的在于实验目的动物福利W及可将实验动物数量降低至最小的科学替代方法的 措施(决策理事会1998年3月23日的关于欧洲公约共同体关于保护用于实验和其他科学目 的脊椎动物的结论的1999/575/EEC号决定-官方记录心222，1999年8月24日）。
[0100] 因此，本发明的另一方面设及使用本发明的人造组织用于评估药理学和/或化学 品。
[0101] 本发明的人造组织的治疗用途
[0102] 传染性、炎性、遗传或退行性疾病，物理或化学损伤或血流中断，可导致组织或器 官损失细胞。所述细胞损失可能导致所述组织或器官的正常功能的改变，并因此引起降低 人的生活质量的疾病或身体伤害的发展。因此，尝试再生和/或重新建立所述组织或器官的 正常功能是重要的。受损组织或器官可通过W组织工程技术在实验室中生成的新的组织或 器官来替代。组织工程的目的是构建人造生物组织，并将它们用于医学目的，从而还原、替 代或提高患病组织和器官的功能性活动。另外，在组织工程中使用自体细胞或组织，具有许 多优点：包括(a)显著减少由传染性病原体造成的从供体到受体的感染数量;和(b)不存在 宿主的免疫移植物排斥，因此病人不需要进行与预防免疫抑制相关的免疫抑制治疗、副作 用和问题。
[0103] 因此，本发明的另一方面设及使用本发明的人造组织来治疗，特别是部分或完全 提高，还原或替代患病或受损组织或器官的功能活性的用途。本发明的人造组织可用于治 疗，特别是部分或完全提高、还原或替代活有机体中的任何病变或受损的组织或器官的功 能活性。所述组织或器官可W是，例如，但不限于，尿道，或角膜。在一个优选实施例中，所述 患病或受损组织是内皮。在又一优选的实施例中，所述患病的或受损的组织选自作为血管 和淋己管内表面内衬的间皮，或角膜内皮。在又一优选实施例中，所述患病或受损组织是浆 膜。在又一优选的实施例中，所述患病或受损组织是单层扁平上皮。在又一优选的实施例 中，所述患病或受损组织选自角膜内皮、滑膜、内气管层、食道上皮和膀脫上皮。在又一优选 实施例中，所述间皮细胞是人间皮细胞。在又一优选的实施例中，所述间皮细胞和/或源自 脂肪组织。在一个更优选的实施例中，所述间皮细胞培养于含有类固醇激素的间皮保留表 型培养基(MRPM)中，更优选为糖皮质激素，且更优选地，糖皮质激素是氨化可的松。在又一 优选实施例中，氨化可的松的浓度范围/在0.1和10化g/ml之间，氨化可的松的浓度更优选 为约化g/ml。
[0104] 所述组织或器官，可W是因功能障碍、损伤或疾病而患病或受损，例如，但不限于， 感染性疾病、炎性疾病、遗传病或退行性疾病;物理损伤如外伤或外科手术，化学损伤或血 流中断。本发明的又一方面设及使用本发明的人造组织用于制备药物的用途，或可选地，设 及用作药物的本发明的人造组织。
[0105] 所述药物是用于体细胞治疗的药物。"体细胞治疗"应理解为，使用通过处理而大 幅改变了生物特征的活体、自体、同种异体或异种的体细胞，通过代谢、药理学或免疫学方 法，得到治疗，诊断或预防效果。用于体细胞治疗的药物，例如，但不限于:经处理后定量和 定性改变其免疫、代谢或其他功能特性种类的细胞;经过分类、选择并处理随后用于获得最 终产品的生产过程的细胞；；经处理并与在最终产物中执行原理预期功能的非细胞成分(例 如，生物基质或惰性基质或医疗设备)组合的细胞;在特定培养条件下的自体细胞衍生物； 经遗传修饰或经过其它类型的处理W表达此前不表达的同源或非同源功能性质的细胞。
[0106] 本发明的又一方面设及用于制备药物W部分或完全提高、复原或替代患病或受损 组织或器官的功能活性的本发明的人造组织，或可选地，设及本发明的人造组织用于制备 药物W部分或完全提高、恢复或替代患病或受损组织或器官的功能活性的用途。在一个优 选的实施例中，患病或受损组织是内皮。在又一优选的实施例中，所述患病或受损组织选自 作为血管和淋己管内表面内衬的内皮，或角膜内皮。在又一优选实施例中，所述患病或受损 组织是浆膜内皮。在又一优选的实施例中，所述患病或受损组织是单层扁平上皮。在又一优 选的实施例中，所述患病或受损组织是选自角膜内皮、滑膜、内气管层、食道上皮和膀脫上 皮。在一个优选实施例中，所述间皮细胞是人间皮细胞。在又一优选的实施例中，所述间皮 细胞和/或源自脂肪组织。
[0107] 使用自体间皮细胞构建角膜内皮仿生物
[0108] 本发明的实施例展示了间皮细胞用于恢复角膜内表面的用途。
[0109] 使用自体间皮细胞构建滑膜仿生物
[0110] 使用自体间皮细胞用于滑膜模拟物的生物工程，可W提供用于修复缺陷关节囊的 新方法。间皮细胞分泌透明质酸，可W应用于替代关节囊滑膜内衬的细胞，在滑液中分泌透 明质酸，该化合物具有有效的抗发炎作用并抑制基质金属蛋白酶-I(MMP-I)的产生 (Shimizu et al.,2003.J Mieumatol 30:1164-1172;Scott et al.,2000.Microvasc Res 59:345-353)O
[0111] 使用自体间皮细胞构建气管上皮仿生物
[0112]气管的内层覆盖层是纤毛衬里层的粘液膜(Smith et al. ,2008.Respir Physiol Neurobiol 163:178-188)。数种不同于间皮细胞的细胞类型已被提出用于气管导管仿生物 的生物工程化e et al. ,2012.Regen Med 7:851-863)。
[0113] 使用自体间皮细胞构建食道上皮仿生物
[0114] 类似于气管，食道是大径肌肉导管，该导管的主要功能是允许食物从口腔向胃传 输。该食道由四个主要层组成:外膜，固有肌层，粘膜下层和粘膜。腔粘膜层是一种内腔衬里 层的复层扁平上皮。所述食道包括上皮下方的许多腺体，所述腺体分泌大量润滑剂，用于令 述内腔表面恢复保护最外层的外皮层并改善食品朝胃道滑动的功能。
[0115] 使用自体间皮细胞构建膀脫尿路上皮仿生物
[0116] 其他易于替代为自体间皮细胞的上皮是作为膀脫内腔和尿道衬里层的尿路上皮。 尿路上皮是移行上皮，由3-5层组成，其复杂性从基膜向腔表面递增。在层状支架（即丝纳米 纤维层)上沉积多层的自体间皮细胞，能够产生用于膀脫上皮的生物模拟物。
[0117] 使用自体间皮细胞构建浆膜仿生物
[0118] 因腹膜手术或意外组织损伤造成的腹膜粘连，通常起因于间皮细胞层损失，导致 相对间皮下层之间的粘合。其带来显著的健康问题，对生活质量和医疗保健开支产生重大 影口向（Rizzo et al.,2010.Immunopharmacol Immunotoxicol 32:481-494;Schnuriger et al. ,2011.Am J Su巧201:111-121)。自体间皮细胞从内脏脂肪的分离、繁殖并与重现间皮 下基质的细层状支架联用，能够生成浆膜仿生物，其可应用于替代损坏间皮区域。替代损坏 的间皮区，可令其恢复光滑表面。植入生物工程所得的间皮膜，能够复原光滑的非粘合表 面。
[0119] 使用自体间皮细胞为人造脏器进行浆膜的生物工程构建
[0120] 目前正在研究人造器官（即屯、脏，膀脫和肝脏）的生物工程构建，主要是为了寻求 具有各种器官适用的不同细胞表型组件的接种、归巢和分化的理想形态、强度和生物相容 性的生物或人造支架。由于内脏器官始终由浆膜来复原，从内脏脂肪组织中分离的自体间 皮细胞代表着间皮细胞的重要来源，其与适当的层状支架（例如培养的丝纳米纤维层)组 合，可W得到覆盖整个表面的间皮仿生物。
[0121] 与间皮细胞结合使用W进行浆膜仿生物的生物工程构建的生物材料
[0122] 丝
[0123] 本发明展示了如何对丝片材进行生物工程构建，并将其用作支持性支架，结合自 体皮细胞来构建浆膜仿生物。桑蚕丝主要由两种蛋白即丝胶和丝素组成（Chen et al.， 2012.Acta Biomate巧:2620-2627.),其结构的核屯、由丝素构成。该纤维中嵌入紧密压实的 丝胶蛋白外粘层。丝纤维显示出非凡的机械强度和生物物理特性，使得运种材料成为层状 支架的理想成分。此外，丝是可相对缓慢地随时间在体内降解的生物材料。丝素蛋白溶液的 电纺丝能够产生纳米纤维，该纳米纤维的多层沉积能够产生厚度为几微米的层。纳米纤维 丝层最大程度地模仿间皮下结缔组织基质，其主要由厚胶原纤维，弹性纤维的无定形成分， 提供供间皮细胞错定的支持层的基质组成。
[0124] 脱细胞牛浆膜和屯、外膜间皮
[0125] 使用生物人造层状基质的替代方式，例如静电纺丝纳米纤维层，可W使用从肠系 膜分离的脱细胞牛浆膜。肠系膜包含透明浆膜的大表面，由附着于主要由胶原纤维构成的 基质的两层间皮细胞组成。所述浆膜通过使用去污剂(Triton-X 100)和酶促消化(膜蛋白 酶)进行脱细胞，可W实现间皮细胞层的有效释放，并产生胶原纤维的纤细网络，用于接种 自体间皮细胞，W重建浆膜仿生物。
[0126] 脱细胞牛屯、包膜
[0127] 提供用于间皮细胞粘附和生长的支持性支架的另一细胞外基质巧CM)来源是屯、包 膜，其比肠系膜浆膜ECM更厚。已经实现了使用洗涂剂和酶进行牛屯、包膜脱细胞和与所得 ECM的后交联（Oswal et al. ,2007.J Heart Valve Dis 16:165-174;化ethlinget al.， 2008.J Heai^t Valve Dis 17:456-463;化ng et al.,2009.J Biomed Mater Res B Appl Biomater 91:354-361),并用作屯、血管外科中的支持支架，主要用于重建屯、脏瓣膜(Yang et al.，2012.J Biomed Mater Res B Appl Biomater 100:1654-1661)。尽管如此，仍然没 有实现脱细胞屯、包膜与自体间皮细胞的联合使用。在此基础上，大面积脱细胞屯、包膜的生 成，允许构建导管支架，其中W自体间皮细胞恢复的管腔代表W生物工程构建气管和食道 生物替代物所需的一级结构。
[012引药物组合物
[0129]本发明的又一方面设及一种药物组合物，其包含本发明的间皮细胞和/或本发明 的人造组织。本发明的运一方面的优选实施例设及一种药物组合物，其包含本发明和/或本 发明的用于在体细胞治疗中使用的人造组织的间皮细胞。
[0130] 本发明的运一方面的更优选的实施例设及一种药物组合物，其包含本发明的间皮 细胞和/或本发明的人造组织，W部分或全部提高、还原或替代组织或器官的功能活性。
[0131] 本发明的运一方面的一个优选实施例设及一种药物组合物，其包含本发明的间皮 细胞和/或本发明的人造组织，W部分或全部提高、还原或替代因感染性疾病、炎性疾病、遗 传病或退行性疾病、物理或化学损坏或血流中断所造成的患病或受损组织或器官的功能活 性。在一个优选的实施例中，所述患病或受损组织是内皮。在又一优选的实施例中，所述患 病或受损组织选自形成血管和淋己管内表面的内皮或角膜内皮。在又一优选实施例中，所 述患病或受损组织是浆膜。在又一优选实施例中，所述患病或受损组织是单层扁平上皮。在 又一优选实施例中，所述患病或受损组织选自角膜内皮、滑膜、内气管层，食道上皮和膀脫 上皮。在又一优选实施例中，所述间皮细胞在适当的培养基中培养，优选为含类固醇激素的 间皮保留表型培养基(MRPM)，更优选为糖皮质激素，更优选为氨化可的松。在本发明的又一 优选实施例中，所述氨化可的松的浓度为0.1至10化g/ml，更优选为0.5-50μg/ml，更优选 地，所述氨化可的松的浓度约为化g/ml。
[0132] 在一个优选实施例中，所述间皮细胞是人间皮细胞。在又一优选的实施例中，所述 间皮细胞和/或源自脂肪组织。
[0133] 在本发明运一方面的一个优选实施例中，所述药物组合物包含本发明的间皮细胞 和/或本发明的人造组织，还包含药学上可接受的载体。在本发明的运一方面的另一优选实 施例中，所述药物组合物包含本发明的人造组织和另一种活性成分。在本发明运一方面的 一个优选实施例中，所述药物组合物包含本发明的间皮细胞和/或本发明的人造组织和另 一种活性成分W及药学可接受的载体。
[0134] 本申请所称的术语"活性成分"、"活性物质"、"药学活性物质"、"活性成分"或"药 学活性成分"是指任何可能提供药理活性，或提供在诊断、治愈、减轻、治疗或预防疾病中的 另一种不同效果，或影响人体或其他动物体的结构或功能的成分。生物来源的活性成分的 例子包括生长因子、激素和细胞因子。许多治疗剂是本领域已知的，并且可W鉴定其作用。 某些治疗剂能够调节细胞增殖和分化。例子包括化疗核巧酸、药物、激素、非特异性(非抗 体）蛋白质、寡核巧酸（例如，结合祀核酸序列（例如，mRNA序列）、肤和拟肤的反义寡核巧 酸）。在治疗方法中，本发明的药物组合物可W单独使用或与其他药物化合物联用。
[0135] 本申请所称的术语"药学可接受的赋形剂"是指，其必须由联邦政府或国家政府或 在美国药典或欧洲药典或其它普遍认可的药典中列出的管理机构批准用于动物和人类。术 语"媒介物"（vehicle)指的是:本发明的干细胞、祖细胞或分化细胞，本发明的永生化细胞， W及本发明的细胞群的细胞在给药时必须用到的稀释剂、赋形剂、载体或佐剂；显然，所述 媒介物必须与所述细胞相容。所述媒介物的说明性非限制示例包括:任何生理相容性媒介 物，例如等渗溶液（例如无菌盐水溶液（0.9 % NaCl )，憐酸盐缓冲盐溶液（PBS)，林格 (Ringer)乳酸盐溶液等），可选地，可W补充血清，优选为自体血清；培养基（例如DMEM， RPMI ,McCoy等）；或者，优选地，固体、半固体、凝胶状或粘性支持培养基，如胶原蛋白、胶原 蛋白-糖胺聚糖、纤维蛋白、聚氯乙締、聚氨基酸(如聚赖氨酸或聚鸟氨酸）、水凝胶、琼脂糖、 葡聚糖硫酸硅胶。此外，根据需要，在特殊实施例中，所述支持培养基可W含有生长因子或 其它药剂。如果所述支撑是固体、半固体或凝胶状，则所述细胞可W在液相媒介物中引入， 随后进行处理，W转化为更固相的相。在本发明的一些实施例中，所述媒介物具有固体结 构，所述媒介物能够根据病变的形式进行配置。
[0136] 根据需要，本发明的药物组合物还可W在需要时含有用于提高和/或控制细胞的 期望治疗效果的添加剂，如缓冲剂、表面活性剂、防腐剂等。药学上可接受的载体可W包括 能够支持细胞生存力的细胞培养基。该培养基通常无血清，W避免刺激受体的免疫应答。载 体通常被缓冲和/或无热原。另外，为了稳定细胞悬浮液，也可W添加金属馨合剂。细胞在本 发明的药物组合物的液体培养基中的稳定性，可W通过加入其他物质来提高，例如天冬氨 酸、谷氨酸等。可用于本发明的药物组合物中的所述药学可接受物质，通常为本领域技术人 员所公知，且通常用于细胞组合物的生产中。适当的药物载体的示例如E.W.Madin所著的" Remington'S陆armaceutical Sciences"中所述。所述载体的其他信息可W在任何制药技 术(即制剂学)手册中找到。
[0137] 本发明的药物组合物可W用适当的药学给药形式来给药。对此，本发明的药物组 合物可根据所选择的给药形式来配制。所述制剂适合于给药方法。在一个特定的实施例中， 所述药物组合物制备成液体、固体或半固体剂型，例如悬浮液形式，W便通过植入、注射或 输注来向需要治疗的对象给药。本发明的药物组合物的说明性非限制实施例，包括本发明 的药物组合物的无菌悬浮液与药学上可接受的赋形剂(例如等渗溶液，如憐酸盐缓冲盐溶 液(PBS)，或其它任何适当的药学可接受媒介物）的制剂，W对对象进行非肠道给药，但是， 也可W使用其它给药途径。
[0138] 本发明的药物组合物对有需要的对象的给药，可使用常规手段进行。在一个具体 的实施例中，所述本发明药物组合物可W使用适当的设备对对象进行非肠道给药，例如注 射器、导管、套针、插管等。在所有情况下，本发明的药物组合物可W使用适合于细胞组合物 给药且为本领域技术人员公知的设备、装置和仪器来给要。在另一个实施例中，本发明的药 物组合物对期望受益部位的直接给药可能是有利的。在该方法中，可W通过插入适当的装 置(例如适当的插管），通过输注(包括逆流机制)或通过其他如本专利所述技术或本领域已 知技术，对受影响的器官或组织的外表面进行直接给药(例如，通过注射等），从而实现本发 明的药物组合物对期望器官或组织的直接给药。
[0139] 本发明的药物组合物可被保存直至由本领域技术人员W已知常规方法进行运用 的时刻。对于短期保存(少于6小时），本发明的药物组合物可W储存在室溫或低于室溫的密 封容器中，补充或不补充营养液。中期保存(少于48小时)优选在2-8°C下，且本发明的药物 组合物还包括W防止细胞粘附的材料制成或内衬的内有等渗缓冲溶液的容器。长期储存， 优选通过适当低溫保存和在有利于保留细胞功能的条件下储存。
[0140] 在一个具体的实施例中，本发明的药物组合物可W用于组合疗法中。.所述额外医 药产品可W构成同一药物组合物的一部分，或者可选地，可W提供为单独的组合物形式W 用于本发明的药物组合物给药的相关同时或相继(时间顺序)给药。
[0141] 包含类固醇激素的培养基及其用途
[0142] 本发明的又一方面设及类固醇激素用于避免上皮-间质转变的用途。在一个优选 的实施例中，所述类固醇激素是糖皮质激素，且更优选为氨化可的松。
[0143] 本发明的又一方面设及包含类固醇激素 W避免上皮-间质转变的组合物的用途。 在一个优选的实施例中，所述类固醇激素是糖皮质激素，且更优选为氨化可的松。
[0144] 本发明的又一方面设及一种类固醇激素或者含有该类固醇激素的组合物，其用于 纤维化的预防和治疗，且更优选为用于腹膜纤维化的预防和治疗，或可选地，设及一种类固 醇激素或者含有该类固醇激素的组合物用于纤维化的预防和治疗的用途，且更优选为用于 腹膜纤维化的预防和治疗的用途。在一个优选的实施例中，所述类固醇激素是糖皮质激素， 且更优选为氨化可的松。
[0145] 该组合物可W是培养基，则本发明的又一方面设及一种培养基，下文中称为本发 明的培养基，其包含类固醇激素(优选为糖皮质激素，且更优选为氨化可的松)和添加了培 养补充剂B27和0-琉基乙醇(抗氧化剂）的低浓度血清。本发明的又一方面设及本发明的培 养基用于避免上皮-间质转变的用途，且优选为在培养于塑料表面和生物支架的间皮细胞 中形成卵石样铺面，如在晶状体前囊(胶原层)的情形中，如本发明的实施例所述。在一个优 选的实施例中，所述类固醇激素是糖皮质激素，且更优选为氨化可的松。
[0146] 本说明书和权利要求中，术语"包括"及其变形并不旨在排除其它技术特征、添加 剂、组分或步骤。对于本领域技术人员，部分通过本说明书，部分通过对本发明的实践，可W 理解本发明的其它目的、优点和特征。下面的实施例和附图用于举例说明，且并不意在限制 本发明。
[0147] 发明实施例
[0148] 本专利文件中所提供的W下具体实施例，用于说明本发明的性质。包括运些实施 例仅是为了说明的目的，而不应解释为对本申请所要求保护的发明的限制。因此，如下所述 的实施例对本发明进行举例说明，而不限制其应用领域。
[0149] 实施例1
[0150] 材料和方法
[0151 ]脂肪组织间皮细胞酶分离
[0152] 从雌性成年小鼠（谱系CD1)的内脏脂肪组织中分离得到成熟间皮细胞。使用精细 手术剪和手术刀进行内脏子宫脂肪垫的手术分离（n = 7)。在无菌憐酸盐缓冲盐水或PBS (10010-015，G化CO公司）中洗涂从2只小鼠分离的脂肪组织垫，并转移到由含有0.25%膜蛋 白酶（15400-054，G化co公司）和2%牛血清白蛋白或BSA(A4503，SigmaAldrich公司，圣路 易斯，密苏里州，美国）的PBS组成的酶溶液（IOml)中。然后将试管转移到水浴37°C中20分 钟。在整个膜蛋白酶消化期间，对试管定期轻轻摇动，W提高膜蛋白酶与脂肪组织垫的接触 和间皮细胞的脱落。然后，将试管直立在在试管架上，W允许消化后的脂肪垫完整上浮。然 后轻轻地收集含有释放的间皮细胞的下层膜蛋白酶溶液并离屯、（7分钟，15(K)rpm)。将所得 的沉淀物再悬浮于2ml红细胞裂解缓冲液(R7757，Sigma-Al化ich公司）中，并在1分钟内轻 轻混合。红细胞裂解后，将细胞再次离屯、（7分钟，150化pm)，最后再悬浮于2ml含2 %BSA的 PBS中。使用化Ubaeur血球计和台吩蓝排除试验测定活性ATMCs的浓度。在MRPM中培养脂肪 组织间皮细胞
[0153] 将总数为3.5x1〇5的ATMCs总数接种到6孔培养皿（140685,NunclonTM A Sudace) 的每孔中的1.5ml发明人称为MRPM(间皮护表型培养基)的培养基中。据发现，MRPM的制剂能 够最佳抑制ATMCs在牛胎儿血清(FBS)组分中的促血管生成生长因子化GF，TGF-ei，FGF和 PDGF-BB)诱导下的上皮向间质转化化MT)(J Am Soc化地rol.2011S邱；22(9):1682-95; Dev Dyn 236: 2973-2979)。W补充有低浓度（2% )灭活小牛血清化onza公司），1 %82巧|'充 剂（17504，G化CO公司），1%青霉素-链霉素(G化CO公司）、100iiM抗氧化剂e琉基乙醇(31350-OlO，G化CO公司）和用于抑制EMT的高浓度（Uig/ml)糖皮质激素氨化可的松(Sigma AWrich 公司）的DMEM低葡萄糖GlutaMax培养基（21885-05 ,Gibco公司）制备MRPM化ab Invest. 2013Feb; 93(2): 194-206)。间皮细胞在培养箱巧％CO2，37°C )中培养持续2天，最后 用0.05 %膜蛋白酶（15400-054，G化CO公司）收获。用化ubaeur血球计，通过台吩蓝排斥试验 评估活性ATMCs浓度，并将其调节到1. SxlO6细胞/ml的终浓度。然后将ATMCs接种在晶状体 前囊化ALCs)的脱细胞基底膜上。新鲜分离的ATMCs等份也分别在类似条件下(MRPM，48小 时)培养于亲水y-Dish(45079,化idi Gm地，德国）中，W通过对0-连环蛋白和ZO-I的免疫巧 光(图1)来表征其免疫表型。
[0154] 晶状体前囊
[0155] 晶状体前囊的定位
[0156] 在正常的白内障手术程序中，共获得34个晶状体前囊化ALCs)。在6例中，用飞秒激 光系统进行撕囊术，所得大小为4.5mm。在其余情形下，进行目标直径为5mm的手动撕囊。所 有晶状体前囊都胆存在蒸馈水(MARCA)中，W便得到全脱细胞基底膜。注意，存储在蒸馈水 中的HALCs由于其自然凹凸结构而得W保持不变地卷起或折叠。对折叠 HALCs进行台吩蓝染 色(n = 7)，W确定其对应于脱细胞基底膜的一侧。所有受试的HALCs均在最外侧呈现出台吩 蓝染色，由此表明该侧对应于其脱细胞基底膜。
[0157] 利用无菌21号针轻轻地收集存储到无菌蒸馈水中的HALCs,并转移到直径为35mm 的4-内环开口细胞培养皿(627170，GreinerCELLSTAR?)中。将单个HALC沉积到每个环中 的10化1缩小体积蒸馈水(MARCA公司）中。然后，在放大镜下用精细綴子使HALCs正确定向。 使用无菌21号针和吸移管，逐步除去水，W实现HALCs在塑料表面上的完全扁平化。
[015引将ATMCs接种到HALCs基底膜上
[0159] 将含IO5ATMCs的60iil体积MRPM小屯、地滴到HALCs的脱细胞基底膜上。然后，将细胞 培养皿置于含有浸泡在蒸馈水中的无菌薄纸W保持最佳湿度的IOOmm培养皿（172958， NunclonTM A Sudace，Nunc)中，最后转移到培养箱（5%C02，37°C )。培养2小时后，大部分 ATMCs(80-90%)已附着到HALCs基底膜上。然后，小屯、在环边界处添加120iil额外体积的 MRPM，然后将培养物转移到培养箱中再培养4小时。在此时间后，小屯、地向所述环外然后向 所述环内添加1.2ml终体积的MRPM，从而W足够体积的培养基维持培养物至第二天。然后， 在培养24小时后（1.5ml)和培养48小时后（1.5ml)，置换MRPM。据发现，72小时培养时间能充 分且最优地得到完全细胞覆盖的HALCs基底膜。
[0160] 评估方法
[0161] 光学显微镜
[0162] HALCs在MRPM中培养72小时后，在含有4%多聚甲醒或PFA(P6148,Sigma AUrich 公司）的冷PBS中处理20分钟。然后，将HALCs在4°C下保存在无菌PBS中直至分析。用配备有 数字图像处理软件DPContro Iler和DPManager的显微镜Olympus 1X7 1 (Olympus .WWW. Olympus. CO.址)获取 HALCs 的相衬图像。
[0163] 免疫巧光
[0164] 通过免疫巧光分析在亲水y-Dish中的MRPM中培养48小时的ATMCs和间皮化的HALC 培养物的间皮表型。W含4 % PFA的PBS于4 °C下固定ATMCs 20分钟。ATMCs在由补充有0.5 % Triton X-100(T8787，Sigma Al化ich公司）和3%BSA的PBS组成的透化和封闭溶液中4°C培 养过夜。W透化和封闭溶液稀释抗体，并在4°C下培养1小时。本研究中使用的一级抗体和标 记抗体如表1 (见下文）所述。本研究中使用的二级抗体是山羊抗小鼠 IgG-Alexa Fluor 488nm(Al 1029, Invitrogen公司）和山羊抗兔Alexa Fluor 488nm(Al 1034，Invitrogen)。二 级抗体稀释1/300倍后，在室溫下培养30分钟。Wliig/ml双苯甲亚肢ri33342S盐酸化物 化oechst 33342)进行细胞核复染。如上所述地，使用倒置巧光显微镜Olympus 1X71捕获巧 光图像。
[0165] 表1.本研究中所用的一级抗体和标记抗体列表
[0166]
[0167] 缩写：ZO-I:紧密连接蛋白-l;a-SMA:a-平滑肌肌动蛋白；AF633:Alexa Fluor 633nm;PFA:多聚甲醒。
[0168] 透射电子显微镜
[0169] WATMCs接种并W含在MRPM中培养72小时的HALCs在含1.6%戊二醒的0.15M二甲 肿酸钢缓冲液(pH7.3)中4°C固定1小时。然后，HALCs在含1 % Os〇4的相同缓冲液中固定，在 乙醇中脱水，并包埋在环氧树脂中。用钻石刀切割薄切片，并用乙酸双氧轴和巧樣酸铅染 色，W工作电压为SOkV的PHILIPS CM-IO透射电子显微镜进行检查。鉴别到间皮化HALCs复 合体的横向切口后，W5000倍的基本放大倍数采集电子显微镜数据，并在20000放大倍数下 拍照。
[0170] WMetaMo巧h进行巧光量化
[0171 ]使用Meta Imaging Sof tware Me taMorph Of f 1 ine 7.5 . 1 . 0版本（MDS Anal^ical technologies公司，美国）进行a-SMA免疫巧光表达的量化。对于每个免疫巧光 图像，分别计算由细胞发出的特异化echst 33342和Alexa 488皿巧光的平均值。通过排除 无细胞的3个区域发出的背景巧光平均值后，得到特异巧光。在化echst 33342和Alexa 488nm的巧光之间进一步相互划分，得到标记表达(任意单位）的相对指数。结果表示为从3 个独立培养中的免疫巧光标记推导所得的标记表达中值±SEM。
[0172] 免疫印迹
[0173] 用10%SDS-PAGE进行蛋白质裂解物（2化g))的电泳分离，并将其转移至聚偏二氣 乙締膜化ybond-P膜，Amersham公司，白金汉，英国）。封阻膜W 2 % BSA和0.2 % Tween 20的 化is缓冲盐水封闭膜。W针对a-SMA的一级抗体（1/1000)和朗几动蛋白（1/500)培养印迹过 夜，并使用辣根过氧化物酶标记的二级抗体和Plus检测系统(Amersham公司）检测免疫反应 条带。
[0174] 天然生物材料的获得
[0175] 天然生物材料，如来自蠕虫和昆虫的丝，是由丝屯、蛋白（丝蛋白）和胶样球状蛋白 (丝胶)组成的。由于生物相容性、降解缓慢和显着的机械性能，W及分子结构和形态的可塑 料，丝蛋白是优良的生物医学应用候选对象，特别是在组织工程应用中。可W利用各种形式 的丝素蛋白（膜层(film),纤维，网，网格，膜(membrane),纱线和海绵)来支持间皮细胞的体 外粘附、增殖和分化并促进体内组织修复。使用=维丝素蛋白支架的基于细胞的组织工程， 扩大了丝基生物材料作为骨、初带、软骨和结缔组织如皮肤的替代物的支架的前景广阔的 用途。
[0176] 要从丝素蛋白溶液生成=维多孔支架，可W使用全含水工艺或者有机溶剂处理。 进一步的盐浸出、气体发泡和冷冻干燥可作为生成3D矩阵互连孔结构的方法。盐浸出能够 形成高度多孔支架。结合高压缩强度的结果是得到具有可控孔隙尺寸和尺寸分布的孔隙。 丝素蛋白通常会经历从无规卷曲向e-折叠片结构的结构转变。可W对具有可控形态和符合 功能需求和降解速率的结构特征的支架进行工程设计。
[0177] 胶原蛋白是体内的主要结构蛋白，尤其耐受蛋白酶。除了自体胶原外，富含纤维化 胶原的组织(如皮肤和肌腫)也通常用作制备用于给药系统、植入物和伤口敷料中的胶原蛋 白的起始原料。存在不同的来源，例如，人胎盘、异种来源(猪和羊胶原蛋白品种），海洋来 源，甚至来自转基因动物的重组人胶原蛋白。分子之间的共价交联的存在，是第I型胶原从 组织离解的主要障碍。然而，在幼小动物和胎盘中，交联足够低，能够在适当条件下提取几 个百分点。
[0178] 可用中性盐溶液(0.15-2M化Cl)或稀醋酸提取组织中新合成且交联极少的胶原 分子。所提取的材料通过透析、沉淀、离屯、进行纯化。稀酸溶剂，例如0.5M醋酸、巧樣酸盐缓 冲液或盐酸(pH 2-3)，比中性盐溶液更有效。但是，稀酸无法离解不稳定性较低的交联，例 如酬-亚胺键。额外的胶原材料可用包含碱金属氨氧化物和碱硫酸盐的水溶液（例如大约 10 %的氨氧化钢和10 %的硫酸钢)溶解约48小时。
[0179] 实验结果
[0180] 对RMPM中培养的ATMCs的表征
[0181] 通过膜蛋白酶消化从鼠子宫脂肪组织的间皮覆盖上分离ATMCs(图lAKATMCs主要 分离为扁平细胞不规则小片的形式(未示出）。几分钟后，运些片通过完全收缩形成了葡萄 状形态。ATMCs在MRPM制剂中培养48小时后，产生呈现扁平上皮细胞典型卵石形态的单层。 大多数ATMCs呈现出扁平圆形和多角形上皮样的形态。有些细胞是小折射力细胞，对应于增 殖中的ATMCs,也表现为Ki-67核表达染色。根据其间皮表型，ATMCs呈现出上皮细胞连接蛋 白0-连环蛋白和ZO-I的典型胞间表达。E-巧黏蛋白在细胞之间的胞间接触少量表达。此外， ATMCs也呈现对肾母细胞瘤蛋白(WT1，一种在含培养基49的血清中体外培养的胚胎间皮细胞 和成熟间皮细胞中强烈表达的转录因子）的强烈核表达。MRPM培养的ATMCs也表现出间皮蛋 白间皮素的膜表面表达，运符合其间皮表型。相应地，MRPM表现出仅限于其细胞膜内的F-肌 动蛋白环形染色，且缺乏在ATMCs经历上皮-间质转化时形成的F-肌动蛋白和a-平滑肌肌动 蛋白阳性肌原纤维。据证实，MRPM培养的ATMCs不表达泛内皮细胞标志物CD31。根据Ki-67的 核免疫巧光指示，大约30-40%ATMCs被判定为正在增殖中。
[0182] 晶状体前囊描述
[0183] 通过撕囊术获得的晶状体前囊(HALCs)是约5mm直径且20WI1厚的透明片。对所述脱 细胞HALCs的透射电子显微镜(TEM)分析能够确认其基底膜表面没有上皮细胞，表明在无菌 水中充分实现了脱细胞。只在少数区域可W观察到少数小圆形细胞碎片(数据未显示）。相 应地，W台吩蓝复染的HALCs中，所述细胞碎片检测为小蓝点（数据未显示）。在凸面HALCs外 侧恒定地观察到所述蓝点，所述外侧对应于其脱细胞基底膜(数据未显示）。
[0184] 形态
[01化]ATMCs对HALCs基底膜表面的接种成功。1 -2小时的时间足W供ATMCs附着到HALCs 基底膜侧上(数据未显示）。
[0186] 对在MRPM培养12小时后的接种HALCs的测试表明，ATMCs能够成功附着到HALCs上 (图5)。在HALCs上培养了 24小时的ATMCs呈现出多相形态，部分细胞表现出增殖（图6)。大约 半数接受测试的细胞是小圆形的折射力细胞，其为正在进行体外增殖的ATMCs池的典型形 态(数据未显示）。细胞的其它子类表现出成熟扁平间皮细胞的典型扁平和多边形形态。
[0187] 有趣的是，在HALCs基底膜上培养了72小时的ATMCs表现出高于仅培养了24小时的 HALCs的表面覆盖（图7A)(数据未显示）。事实上，培养72小时后接受测试的大部分HALCs的 整个区域均完全覆盖ATMCs。运一发现非常关键，因为运表明ATMCs可W积极地增殖并形成 细胞紧密单层。有趣的是，覆盖培养了 72小时的HALCs的单层，表现出极少的小圆形或多角 形折射力细胞，表明ATMCs保持了接触抑制生长。
[018引免疫巧光
[0189] 还进行了F-肌动蛋白和a-SMA的共免疫巧光染色，W评估一些细胞是否经历EMT (图7B)。有趣的是，ATMCs内胞浆膜内呈现出F-肌动蛋白表达(环状染色，一种通常在培养的 上皮细胞或扁平上皮中观察到的染色模式）。特别重要的是，ATMCs缺少Wa-SMA和F-肌动蛋 白标记的应力纤维，表明其没有经历EMT。因此，在HALCs上培养的ATMCs所显示出的形态和 标记特征，清楚表明了 ATMCs仍保留着上皮样特性。
[0190] 透射电子显微镜(TEM)
[0191] 间皮化HALCs的超微结构特点
[0192] 用透射电子显微镜（TEM)分析覆盖HALCs的ATMCs的薄横向剖面(接种后72小时） (图8A)。对间皮化HALCs的薄横向剖面进行放大。据发现，在HALCs上培养了 24小时的ATMCs 的顶膜上呈现许多对应于微绒毛的长突起，运与其保留原本间皮表型相符。此外，接受测试 的大多数ATMCs表现出大量线粒体和丰富的粗面内质网（RER)，运两个细胞器在间皮细胞中 尤为丰富。
[0193] 附着:细胞-细胞和细胞-基底薄膜
[0194] ATMCs在顶侧细胞-细胞间接触中表现出高电子密度的紧密连接复合物（图8B )，运 与其保留原本间皮表型相符。据发现，ATMCs的基底膜与HALCs表面密切接触。有趣的是， ATMCs的基底膜呈现出众多内陷（图8B)。插入所述内陷之间的基底膜其他片段较厚，且具有 强烈的高电子密度，正是紧密连接附着复合物的特征。
[0195] 实施例2
[0196] 材料与方法
[0197] 小鼠 ATMCs分离
[0198] 从CDl成年雌性小鼠中分离ATMCs。动物研究方案指南由CABIM邸动物实验与伦理 委员会(Animal Expe;rimen1:ation and Ethics Committee of CABIMER)制定并批准。简单 地说，手术分离子宫索和脂肪组织。ATMCs从脂肪垫的酶解脱离是根据此前的小鼠子宫 MCS51 分离报告并加 W小改进而进行的。[Lachaud CC,Pezzolla D,Domhguez-RohIguez A,Smani T,Soria B,Hmadcha A.Functional vascular smooth muscle-like cells derived from adult mouse uterine mesothelial cells.PLoS One.2013:8(2):e55181]
[0199] ATMCs 培养
[0200] 将ATMCs接种（35000细胞/cm2巧ljT-25烧瓶（136196，Nunc公司）中的5ml间皮保留 表型培养基(MRPM)中，MRPM由补充有2%FBSaonza公司）、l%B2巧h充剂（17504，Gibco公 司）、1 %青霉素-链霉素(Gibco公司）、IOOiiM的0琉基乙醇（31350-010，G化CO公司）和化g/ml 氨化可的松(Sigma Al化ich公司）的DMEM低葡萄糖GlutaMax培养基(21885-05,Gibco公司） 组成。ATMCs在MRPM(5%C02,21%02和37°C)中培养2天，并用膜蛋白酶（15400-054，G化CO公 司）收获。
[0201] 鼠角膜内皮细胞培养
[0202] 从巧Ij3只成年CDl小鼠（2-6个月大)收集角膜，分离原代鼠角膜内皮细胞(MCECs)。 用手术刀轻轻剥下角膜内皮细胞层。通过剥离释放的MCECs团簇在培养箱(5%C02,21 %化， 37°C)中W由含有5%FBS(Lonza)、1 %青霉素-链霉素(Gibco)、1 %非必需氨基酸(Gibco)、 IOOiiM的0琉基乙醇（31350-010 ,Gibco)、IX ITS(41400045 ,Gibco)、10ng/ml重组鼠 bFGF (450-33 ,PeproTech 公司）、10ng/ml 重组鼠 EGF(315-09，P 巧roTech 公司）和化g/ml 氨化可的 松(Sigma Al化ich公司）的DMEM低葡萄糖GlutaMax培养基(21885-05,Gibco)组成的培养基 中进行7天的原代外植体培养。原代扩增的MCECs进一步在4-5天内W5000个细胞/cm 2继代 培养S次到T-75烧瓶（156499，Nunc)中。本研究中使用了第S次传代培养的MCECs,称为 P3MCECS。
[0203] 免疫巧光
[0204] 对于免疫巧光，在细胞定位格子培养皿(y-Dish)中培养细胞(45079 Jbidi GmbH, 德国）。对于细胞表面抗原的检测，将细胞用4%PFA(P6148，Sigma Al化ich公司）固定，并W 含有3%BSA的PBS(PBS-BSA)封闭。对于细胞内抗原的检测，将细胞用0.5%化iton X-IOO (Sigma公司，T8787)或冷甲醇(-20°C)包被，然后WPBS-BSA封闭。在运项研究中所用的抗体 如辅助信息表Sl中所述。细胞核用化g/ml化echst 33342(Sigma公司，14533)复染。W倒置 巧光显微镜 Olympus 1X71 (Olympus. WWW. Olympus, co.uk)捕获巧光图像。
[0205] 定量逆转录聚合酶链反应
[0206] WRNeasy Mini试剂盒(74104，QIAGEN公司）提取总RNA量，并通过使用MMLV逆转录 酶(Promega公司，麦迪逊，威斯康星州，美国）逆转录成cDNA。使用SYBR-Green执行定量实时 PCR，并且使用ABI Prism 7500系统(Applied Biosystems公司，福斯特城，加利福尼亚州， 美国）检测。基因表达对HYWAZ的mRNA(TATAA Reference Gene Panel,ref.D101-D136, TATAA Biocenter AB，哥德堡，瑞典)进行归一化。剥离的角膜内皮用作校准样品。引物序列 在辅助信息表S2中列出。
[0207] 表S2用于定量RT-PCR的引物列表 [020引
[0209]人晶状体前囊 [0^0] HALCs 调节
[0211] 在患者知情同意后，于正常白内障手术程序中获得总共34个人5mm直径的晶状体 前囊化ALCs) dHALCs直接存储在蒸馈水中，W得到全脱细胞基底膜。注意，由于其自然凹凸 结构，HALCs保持不变地卷起或折叠，其内侧对应于脱细胞的上皮侧。HALCs进一步分配到4 内环开口（627170,GreinerCELLSTAR⑥）的35mm细胞培养皿的100山蒸馈水中。HALCs正确 定向，其外侧朝向塑料表面。通过使用移液管和针逐渐除去水来实现HALCs的完全扁平化。
[0212] 对 HALCs 接种 ATMCs
[0213] 将含105ATMCS的起始体积为60iil的MRPM滴到HALCs上。然后，将含有已接种的 HALCs置于含有浸泡在水中的薄纸片的140mm培养皿中，W保持最佳湿度，最后转移到培养 箱(5 % C〇2，21 %〇2，37 °C)中。约80-90 %的ATMCs在培养2小时后牢固地附着。再取1额外 体积的MRPM，小屯、地加入到环中。6小时后，小屯、地在环外添力日1.2ml终体积的MRPM。24小时 后和48小时后，替换MRPM( 1.5ml)。72小时后，HALCs通常呈现出完全细胞覆盖，称为ATMCs-HALCs复合体。
[0214] 透射电子显微镜
[0215] ATMCs-HALCs复合体(n = 8)在含1.6 %戊二醒的0.15M二甲肿酸钢缓冲液(pH7.3) 中4 °C固定1小时。然后，HALCs在含1 % Os〇4的相同缓冲液中固定，在乙醇中脱水，并包埋在 环氧树脂中。切割薄切片，并用乙酸双氧轴和巧樣酸铅染色，W工作电压为80kV的PHILIPS CM-IO透射电子显微镜进行检查。鉴别到ATMCs-HALCs复合体的横向切口后，W5000倍的基 本放大倍数采集电子显微镜数据，并在20,000放大倍数下拍照。
[0216] 免疫组化
[0217] 来自CDl成年小鼠的小鼠角膜用4%PFA固定、WPBS-TX-BSA渗透和封闭，最后包埋 在OCT恒冷箱切片培养基中。可选地，为进行化+/K+-ATP酶和0连环蛋白的检测，在冷的甲醇 中进行角膜固定和透化。将薄切片（15WI1)装载到聚左旋赖氨酸涂覆的玻璃载片上，并W - 级抗体和二级抗体(辅助信息表SI)进行培养。
[021 引
[0219] 缩写：BD;Becton Dickinson公司；SCBT;Santa Cruz Biotechnology公司；PE;藻 红蛋白；AF;Alexa Fluor染料，PFA;多聚甲醒;MeOH:甲醇，；G:羊;Rbt:兔;Hst:仓鼠；Ms:小 鼠;Rt;大鼠。
[0220] 统计分析
[0221] 数值W平均值±标准差表示。统计显著性的计算采用非配对学生t检验(S化dent'
【主权项】
1. 包含间皮细胞的组合物，用于治疗患病或受损的组织或器官。2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述间皮细胞是自体脂肪组织间皮细胞 (ATMCs)。3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述间皮细胞在进一步包含糖皮质 激素的适当培养基中培养。4. 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述间皮细胞在包含糖皮质激素的 间皮保留表型培养基(MRPM)中培养，其中所述间皮保留表型培养基(MRPM)由补充有低浓度 (2%)灭活牛胎血清、1%B27补充剂、1%青霉素-链霉素和100μΜ抗氧化剂β-硫基乙醇的 DMEM低葡萄糖培养基组成。5. 根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于，所述糖皮质激素是浓度为0.1至100μ g/ml的氢化可的松。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述患病或受损的组织为内 皮。7. 根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述患病或受损的组织选自：作为血管 和淋巴管内表面内衬的内皮，或角膜内皮。8. 根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述患病或受损的组织是浆 膜。9. 用于制备人造组织的体外方法，包括： a. 在支撑材料上接种分离的间皮细胞;和 b. 在含有糖皮质激素的适当培养基中培养步骤a中所述的支撑材料中的所述分离的间 皮细胞。10. 用于制备人造组织的体外方法，包括以下步骤： a. 获取包含分离的间皮细胞的组合物； b. 在含有糖皮质激素的适当培养基中培养如步骤a中所述的分离的间皮细胞； c. 将从步骤b中培养所得的所述分离的间皮细胞接种到支撑材料上;和 d. 在含有糖皮质激素的适当培养基中培养如步骤c中所述的支撑材料中的所述分离的 间皮细胞。11. 用于制备人造组织的体外方法，包括以下步骤： a. 向包含间皮细胞的组织样品中添加包含胰蛋白酶的组合物； b. 将步骤a中的分离的间皮细胞组合物在含有糖皮质激素的适当培养基中培养； c. 将从步骤b中培养所得的分离的间皮细胞接种到支撑材料上;和 d. 在含有糖皮质激素的适当培养基中培养如步骤c中所述的支撑材料中的所述分离的 间皮细胞。12. 根据权利要求9-11中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述适当培养基是包含 糖皮质激素的间皮保留表型培养基(MRPM)，其中所述间皮保留表型培养基(MRPM)由补充有 低浓度(2%)灭活牛胎血清、1%B27补充剂、1%青霉素-链霉素和100μΜ抗氧化剂β-硫基乙 醇的DMEM低葡萄糖培养基组成。13. 根据权利要求9-12中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述糖皮质激素是氢化 可的松。14. 根据权利要求14所述的体外方法，其特征在于，所述氢化可的松的浓度为0.1至100 μg/ml〇15. 根据权利要求13所述的体外方法，其特征在于，所述氢化可的松的浓度为lμg/ml。16. 根据权利要求9-15中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述间皮细胞源自脂肪 组织。17. 根据权利要求16所述的体外方法，其特征在于，所述间皮细胞是自体脂肪组织间皮 细胞(ATMCs)。18. 根据权利要求9-17中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述支撑材料源自天然 或合成来源。19. 根据权利要求18所述的体外方法，其特征在于，源自天然来源的所述支撑材料选自 丝，从肠系膜中分离的脱细胞牛浆膜，脱细胞牛心包膜及其组合。20. 根据权利要求9-17中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述支撑材料是单丝或 复丝结构的线。21. 根据权利要求9-17中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述支撑材料是丝纳米 纤维层。22. 根据权利要求9-17中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述支撑材料是连接到 针的缝合线。23. 根据权利要求9-17中任一项所述的体外方法，其特征在于，所述支撑材料是缝合 钉。24. 根据权利要求9-23中任一项所述方法获得的人造组织。25. 根据权利要求24所述的人造组织用于评估药理学产品和/或化学产品的用途。26. 根据权利要求24所述的人造组织用于医药或用作药物的用途。27. 根据权利要求24所述的人造组织用于治疗患病或受损的组织或器官的用途。28. 根据权利要求27所述的人造组织，其特征在于，所述患病或受损的组织或器官是内 皮。29. 根据权利要求28所述的人造组织，其特征在于，所述患病或受损的组织或器官选 自：作为血管和淋巴管内表面内衬的内皮，或角膜内皮。30. 根据权利要求27所述的人造组织，其特征在于，所述患病或受损的组织或器官是角 膜内皮。31. 根据权利要求27所述的人造组织，其特征在于，所述患病或受损的组织是浆膜。32. 根据权利要求27所述的人造组织，其特征在于，所述患病或受损的组织是所有细胞 都锚定在基膜上的单层扁平上皮。33. 根据权利要求27所述的人造组织，其特征在于，所述患病或受损的组织是滑膜。34. 根据权利要求27所述的人造组织，其特征在于，所述患病或受损的组织是是气管内 层。35. 根据权利要求27所述的人造组织，其特征在于，所述患病或受损的组织是食管上 皮。36. 根据权利要求27所述的人造组织，其特征在于，所述患病或受损的组织是膀胱尿路 上皮。37. -种药物组合物，包含间皮细胞或根据权利要求24所述的人造组织。38. 根据权利要求37所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括药学可接受载体。39. 根据权利要求37或38所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括其他活性成分。
【文档编号】C12N5/077GK105874060SQ201480044410
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年6月5日
【发明人】乔治-路易斯·阿里奥-桑斯, 伯纳特·索里亚-依斯康斯, 克里斯蒂安·克劳德-拉绍, 阿卜杜勒卡里姆·马德查-阿菲夫, 纳塔莉亚·埃斯卡塞纳-阿科斯塔, 埃琳娜·克萨达-费尔南德斯, 费莉佩·索里亚
【申请人】安达卢西亚进步与健康公共基金会, 新生物技术公司, 维萨姆公司, 卡洛斯三世保健中心