改进的dna聚合酶寡核苷酸抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明包括一种核酸聚合酶的可逆寡核苷酸抑制剂。还公开了设计所述抑制剂的方法以及在核酸的扩增和检测中使用所述抑制剂的方法，特别是通过RT?PCR检测RNA。
【专利说明】改进的DNA聚合酶真核昔酸抑制剂 发明领域
[0001] 本发明设及核酸扩增领域，并且具体地，设及通过使用聚合酶的可逆寡核巧酸抑 制剂降低由热稳定性DNA聚合酶引起的非特异性扩增。
[0002] 发明背景
[0003] 聚合酶链式反应(PCR)和实时PCR已经在研究和临床领域中被广泛接受为检测祀 标核酸的快速且特异性的方法。然而，非特异性扩增的问题，即，非祀标序列的扩增，常常是 实现临床应用所需的高灵敏度和特异性的限制因素。参见Mackay，I.M. (2004) ,Real-time PCR in the microbiology laboratory，Clin.Microbiol. Infect.10:190。
[0004] 认为非特异性扩增是与基因组中的次要的、部分互补位点退火或与交叉退火或自 退火的引物退火的引物的延伸引起的。非特异性延伸产物的存在已经归因于环境溫度下的 聚合酶活性，在运种情况下，此类部分互补的引物-模板双链体是稳定的（Chou等，（1992)， Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplification,Nucleic Acid Res.20:1717)。因此，已经设计了抑制环境溫度下 聚合酶的引物延伸活性的方法。运些被称为"热启动"的方法确保只有在溫度足够高使得非 特异性引物-模板复合物去稳定时，聚合酶才变得完全有活性，由此避免非特异性位点的引 物延伸。
[0005] -种热启动方法设及在低溫下结合并抑制聚合酶但在高溫下不结合和抑制聚合 酶的寡核巧酸，参见Dang和Jayasena(1996) ,Oligonucleotide inhibitors of !"aq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR, J.Mol.Biol. 264:268。运些寡核巧酸对祀标酶是极具特异性的并且对祀标酶具有高亲和 力。
[0006] 然而，热启动方法不适于逆转录PCR(RT-PCR)应用，其中逆转录酶需要低于50°C的 溫度。某些热稳定性DNA聚合酶具有逆转录活性，其允许在同一反应混合物中使用单一酶进 行cDNA的逆转录和扩增（RT-PCR)，参见Myers和Gelfand( 1991) ,Reverse hanscription and DNA amplification by a Thermus thermophiIus DNA polymerase， Biochemi stry30:7661。然而，RNA在聚合酶活性需要的二价离子存在下在高溫下是不稳定 的。为此，在传统PCR热循环开始之前，在较低溫度(50-6(TC)下进行逆转录。典型的寡核巧 酸适体具有接近60°C的解链溫度并且在较低溫度下没有充分释放聚合酶的抑制作用。因 此，期望获得可W在较低溫度下释放抑制作用的可逆聚合酶抑制剂。
[0007] 发明概述
[000引在一个实施方案中，本发明是包含具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA 寡核巧酸的核酸聚合酶的可逆抑制剂，其中至少一个所述区域包含至少一个尿喀晚碱基。 双链二级结构在PCR混合物中在环境溫度下可W是稳定的。在一些实施方案中，可逆抑制剂 具有SEQ ID NO: 1，其中一个或多个胸腺喀晚碱基被尿喀晚碱基替代，例如，SEQ ID N0:2- 4。
[0009]在另一个实施方案中，本发明是设计核酸聚合酶的可逆抑制剂的方法，其包括设 计具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核巧酸，其中至少一个所述区域包含至 少一个尿喀晚碱基。可W使用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)，从寡核巧酸混合物中 选择所述寡核巧酸。
[0010] 在还另一个实施方案中，本发明是可逆地抑制反应混合物中的核酸聚合酶的方 法，其包括将混合物接触具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核巧酸，其中至少 一个所述区域包含至少一个尿喀晚碱基。该方法可W进一步包括将混合物接触尿喀晚-N-糖基化酶，任选在40-65°C的溫度范围中。该方法可W进一步包括将样品接触聚胺，例如，聚 胺选自亚精胺、精胺和=亚甲基二胺。
[0011] 在还另一个实施方案中，本发明是扩增祀标核酸的方法，其包括在扩增之前，将含 有祀标核酸的反应混合物与具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核巧酸接触， 其中至少一个所述区域包含至少一个尿喀晚碱基。该方法可W进一步包括在扩增之前，将 样品与尿喀晚-N-糖基化酶接触，并且任选接触聚胺，如例如，亚精胺、精胺或S亚甲基二 胺。
[0012] 在还另一个实施方案中，本发明是用于扩增祀标核酸的试剂盒，其含有核酸聚合 酶的可逆抑制剂，所述抑制剂包含具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核巧酸， 其中至少一个所述区域包含至少一个尿喀晚碱基。该试剂盒可W进一步包含尿喀晚-N-糖 基化酶和任选的聚胺，如例如，亚精胺、精胺或=亚甲基二胺。
[0013] 在还另一个实施方案中，本发明是用于扩增祀标核酸的反应混合物，其含有核酸 聚合酶的可逆抑制剂，所述抑制剂包含具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核 巧酸，其中至少一个所述区域包含至少一个尿喀晚碱基。反应混合物可W进一步包含尿喀 晚-N-糖基化酶和任选的聚胺，如例如，亚精胺、精胺或=亚甲基二胺。
[0014] 附图简述
[001引图1显示了预测的寡核巧酸SEQ ID NO: 1的二级结构和其中T被U替代形成SEQ ID NO: 2-4的位置。
[0016] 图2-5显示了在不同溫度下，在SEQ ID NO: 1-4存在下，引物延伸的结果。
[0017] 发明详述 [001引 定义
[0019] 术语"核酸"和"寡核巧酸"是指祀序列和探针。该术语不受限于长度并且通常是指 脱氧核糖核巧酸(单链或双链DNA)、核糖核巧酸(RNA)和嚷岭或喀晚碱基的任何其他N-糖巧 的线性聚合物，所述碱基包括腺巧、鸟巧、胞巧、胸巧和尿巧W及运些碱基的修饰。
[0020] 术语"常规的"或"天然的"设及核酸碱基、=憐酸核巧或核巧酸时，是指在描述的 多核巧酸中天然产生的那些（即，对于DNA，运些是腺嚷岭或dATP、鸟嚷岭或dGTP、胞喀晚或 dCTP和胸腺喀晚或dTTP，而对于RNA，运些是腺嚷岭或dATP、鸟嚷岭或dGTP、胞喀晚或dCTP和 尿喀晚或UTP )。
[0021] 术语"非常规的"、"非天然的"或"修饰的"设及核酸碱基、核巧或核巧酸时，包括不 是在自然界中发现的核酸中产生的的核酸碱基、核巧或核巧酸，而是常规碱基、核巧或核巧 酸的修饰、衍生或类似物。例如，(HTP和7-脱氮-dGTP不是在自然界中的核酸中产生的，但常 常用于替代dGTP，并且7-脱氮-dATP可W用于替代体外DNA合成反应中的dATP，如测序。某些 非常规核巧酸与常规的dNTP相比，在核糖的2'位置经修饰。核糖核巧酸是作为DNA聚合酶底 物的非常规核巧酸。如本文中使用的，非常规核巧酸包括，但不限于，用作用于核酸测序终 止子的化合物。示例性终止子化合物包括但不限于具有2'，3'双脱氧结构并称为=憐酸双 脱氧核巧的那些化合物，例如，ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP。终止子化合物的其他实例包括 核糖核巧酸的2'-P化类似物(参见，例如，美国专利No.7,947,817)。其他非常规核巧酸包括 硫逐憐酸醋dNTP ([ [ a ] -S ] dNTP)、5 ' -[ a ] -borano-dNTP、[ a ]-甲基-憐酸dNTP和S憐酸核糖 核巧(rNTP)。非常规的碱基可W用放射性同位素（如32P、 33P或35S);巧光标记;化学发光标 记;生物发光标记;半抗原标记，如生物素;或酶标记，如抗生物素蛋白链菌素或抗生物素蛋 白来标记。巧光标记可W包括负电荷染料，如巧光素家族的染料，或电荷中性染料，如若丹 明家族的染料，或正电荷染料，如花青家族的染料。巧光素家族的染料包括，例如，FAM、肥X、 TET、JOE、NAN和ZOE。若丹明家族的染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA。各种染料W 及用FAM、肥X、TET、J0E、NAN、Z0E、R0X、R110、R6G、TexasRed和TAMRA标记的核巧酸由 Perkin-Elmer(Boston,Mass.)、Applied Biosystems(Foster City，Cal. ^Invitrogen/ Molecular Probes化Ugene，0re.)销售。花青家族的染料包括切2、切3、切5和切7并且由GE He曰Ithc曰re Biosciences(Pittsburgh，Penn.)销售。
[0022] 术语"寡核巧酸"是指包括至少两个核酸单体单位(例如，核巧酸）的核酸聚合物。 寡核巧酸通常包括约六个至约175个核巧酸，更常见为约八个至约75个核巧酸，例如，约15、 约20、约25、约30、约35或更多个核巧酸。寡核巧酸的确切大小将取决于许多因素，包括最终 的功能或寡核巧酸的用途。存在许多用于制备寡核巧酸的方法，例如，现有或天然序列的分 离，合适序列的DNA复制或扩增、逆转录、克隆和限制酶消化，或通过如下方法的直接化学合 成：Narang等的憐酸S醋法（Meth . Enzyml. 68 : 90-99，1979);化〇龍等的憐酸二醋法 (Meth. Enzyml.68:109-151,1979); Beaucage等的二乙基亚憐酷胺法（Tetrahedron Lett. 22 :1859-1862,1981) ;Matteucci 等的 S 醋法（J. Am.畑 em. Soc. 103 :3185-3191, 1981)。
[0023] 术语"探针"是指在合适条件下与祀标核酸选择性地杂交的寡核巧酸。
[0024] 术语"祀标序狎'或"祀标"是指待分析的核酸序列的区域。
[0025] 术语"样品"是指含有或推测含有核酸的任何组合物。运包括从个体分离的组织或 流体样品，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋己液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官、骨髓和 肿瘤，包括新鲜或新鲜冷冻的组织和福尔马林固定石蜡包埋的组织(FFPET)，W及从获自个 体的细胞体外培养建立的样品，和从其分离的核酸。
[0026] 术语"适体"是指如美国专利No. 5，693，502中所述的，特异性地识别和结合DNA聚 合酶并有效抑制聚合酶活性的寡核巧酸。
[0027] 术语"突变体"，在本发明的DNA聚合酶的内容中，是指多肤，通常是重组的，其相对 于相应的天然产生的或未修饰的DNA聚合物，其包含一个或多个氨基酸置换。
[0028] 术语"热稳定性聚合酶"是指在升高的溫度下稳定的、抗热的并保持足够活性来实 现随后的多核巧酸延伸反应并且在接受升高的溫度持续实现双链核酸变性所需的时间时 没有变成不可逆变性(灭活）的酶。来自嗜热细菌的热稳定性DNA聚合酶包括，例如，来自海 栖热袍菌(Thermotoga maritima)、水生栖热菌(Thermus aquati州S)、嗜热栖热菌、黄栖热 菌(Thermus flavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、栖热菌种Spsl7、栖热菌种Z05、 Thermus caldophilus、热坚芽抱杆菌（Bacillus caldotenax)、那不勒斯栖热袍菌 (Thermotoga neopolitana)和非洲栖热腔菌（Thermosipho africanus)的DNA聚合酶。
[0029] 术语"热活性"是指在通常用于PCR反应中的退火和延伸步骤的溫度下（即，45-80 °C)维持其催化特性的酶。热活性酶可W是或可W不是热稳定性的。热活性DNA聚合酶可W 是依赖于嗜热物种，或来自嗜溫种的DNA或RNA，所述嗜溫种包括，但不限，大肠杆菌 化SCherichia COli .)、莫洛尼鼠白血病病毒和鸟类成骨髓瘤病毒。
[0030] 在DNA聚合酶的内容中，"对应"于另一个序列（例如，序列中的区域、片段、核巧酸 或氨基酸位置)是基于根据核巧酸或氨基酸位置编号的转化，然后W最大化序列同一性的 方式来比对序列。因为不需要给定的"相应区域"内的全部位置是相同的，相应区域内的非 匹配位置可W认为是"相应位置"。因此，如本文中使用的，设及特定DNA聚合酶的"对应于氨 基酸位置[X]的氨基酸位置"是指基于比对的其他DNA聚合酶和聚合酶家族中的相等位置。
[0031] 两个或更多个核酸或多肤序列内容中的术语"同一的"或"同一性"或百分比同一 性是指相同的两个或更多个序列或子序列。在比较窗口内针对最大对应进行比较和比对， 或将区域指定为按照使用W下序列比较算法之一测量的或通过人工比对和视觉观察时，如 果具有相同的核巧酸或氨基酸残基的特定百分比（例如，特定区域内至少60%、至少65%、 至少70%、至少75 %、至少80%、至少85 %、至少90%或至少95 %同一性），则序列是彼此"基 本上同一的"。运些定义也设及测试序列的补体。
[0032] 在两个或更多个多肤序列的内容中，术语"相似性"或巧分比相似性"是指在比较 窗口内针对最大对应进行比较和比对，或将区域指定为按照使用W下序列比较算法之一测 量的或通过人工比对和视觉观察时，具有特定百分比的相同或通过保守性氨基酸置换限定 的相似的氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列（例如，特定区域内60%相似性，任选 65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 %相似）。如果彼此为至少20 %、至少25 %、至少 30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%相似，则序列彼此是"基本上相 似的"。
[0033] 如本文中使用的，"比较窗口"包括参考选自20至600,通常约50至约200,更通常约 100至约150的任一个数目的连续位置的区段，其中在两个序列最佳比对后，可W将一个序 列与相同数目的连续位置的参照序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知 的。例如，可W通过Smith和Waterman (Adv. A卵1 .Math. 2:482,1970)的局部同源性算法，通 过化edleman和WunschQ.Mol. Biol. 48 :443，1970)的同源性比对算法，通过Pearson和 Lipman(Proc.化tl. Acad. Sci . USA 85:2444，1988)的相似性捜寻方法，或通过运些算法的 计算机实施，例如，BLAST、BLASTN、GAP、肥STFIT、FASTA和TFASTA，或通过人工比对和视觉观 察（参见，例如，Ausubel等，Qirrent Protocols in Molecular Biology(1995增补）），来进 行用于比较的序列的最优比对。
[0034] 术语"或巧叉点'值，或"Ct值"或"阔值循坏'值可互换使用，是指允许输入祀 标核酸定量的值。例如，可W根据二阶导数最大值方法来确定Ct值，参见Van Luu-The等 (2005)，Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second deriv曰tive c曰Iculstion 曰nd double correction,BioTechniques,38： 287。
[0035] 术语"PCR效率"是指用于完全匹配的引物模板的循环至循环扩增效率的指示。使 用等式：％PCR效率=(l〇r^)-l) X 100，针对每个条件计算PCR效率，其中使用y-轴上绘制 的对数拷贝数和X-轴上绘制的Ct，通过线性回归来计算斜率。
[0036] 本发明包括具有寡核巧酸形式的DNA聚合酶的可逆抑制剂。具体地，所述寡核巧酸 是包括一个或多个脱氧尿巧(加)核巧酸的DNA寡核巧酸（即，由脱氧核糖核酸组成）（含加的 抑制剂寡核巧酸）。寡核巧酸的序列能够形成包括一个或多个双链二级结构区域的二级结 构。寡核巧酸在环境溫度条件下在常见的反应混合物(例如，PCR混合物）中形成稳定的二级 结构。根据本发明，在双链二级结构区域内放置一个或多个尿喀晚。本发明的寡核巧酸的抑 制特性不依赖于确切的核巧酸序列，而是依赖于由序列形成的二级结构的构象或形状和该 结构的解链溫度(Tm)。在低于Tm的溫度下，例如，在常见反应混合物的环境溫度下，寡核巧酸 采用的形状允许其形成寡核巧酸-酶复合物。寡核巧酸可逆地抑制聚合酶，同时与寡核巧 酸-酶复合物中的酶结合。
[0037] 已经显示出引入非天然核巧酸可W影响由寡核巧酸形成的二级结构的形成和Tm (并且因此影响其稳定性），并且因此影响其抑制特性。为此，已经修饰DNA寡核巧酸来含有 核糖核巧酸、核巧酸类似物、具有非常规碱基的核巧酸、非核巧酸接头或其组合。（对于抑制 剂寡核巧酸中的运种非天然核巧酸的描述，参见，例如，美国专利No. 6，183，679)。本领域技 术人员可W设计具有适用于特定酶的解链溫度和形状的抑制剂寡核巧酸(包括本发明的含 加-抑制剂寡核巧酸）。
[0038] 在一些实施方案中，通过在现有适体NTQ21-46A(也称为UOKSEQ ID N0:1)中用尿 喀晚替代一个或多个胸腺喀晚来设计含加-抑制剂寡核巧酸。
[0039] 日 '-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG-3 '。
[0040] 在运个实施方案的变化中，含加-抑制剂寡核巧酸是W下序列之一：
[0041 ] Ul(沈Q ID NO:2)
[0042] 日 '-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTAUGAUCG-3 '
[0043] 肥(沈Q ID N0:3)
[0044] 5 '-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTATGATCG-3 '
[0045] U3(沈Q ID N0:4)
[0046] 5 '-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTAUGAUCG-3 '
[0047] 适体NTQ21-64A化0) W及Ul、U2和U3的预测二级结构显示于图I中。
[0048] 本领域技术人员可W通过用尿喀晚替代胸腺喀晚或通过在寡核巧酸内（例如，在 SEQ ID N0:1中）的任何其他位置或在另一个已知或新的抑制剂寡核巧酸的序列中引入尿 喀晚，而容易地设计相似的含加抑制剂寡核巧酸。
[0049] W下实例描述了本发明的方法应用于可逆地抑制来自栖热菌种Z05的DNA聚合酶 (公开于国际公开NO.W01992/06200中）。然而，该方法同样适用于其他DNA聚合酶。X-射线晶 体结构的分析掲示了来自不同生物体的DNA聚合酶折叠成相似的S维结构。DNA聚合酶的整 体折叠模式表示人右手并且含有=个截然不同的亚结构域，称为"手掌"、"手指"和"拇指" (参见Beese等，（1993) ,Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound to duplex DNA,Science 260:352;Patel等，（1995)，Insights into DNA polymerization mechanisms from structure and function analysis of HIV-I reverse transcriptase，Biochemishy 34:5351)。尽管手指和拇指亚结构域的结构在大小和细胞 功能不同的聚合酶之间有很大不同，但催化性手掌亚结构全部是重叠的 (superimposable)。例如，基序A,其与引入的dNTP相互作用并在化学催化过程中稳定过渡 态，与哺乳动物POla和原核POl I家族DNA聚合酶中的约一 A的平均偏差重叠（Wang等， (1997)，Crystal structure of a pal alpha family replication DNA polymerase from bacteriophage RB69，Cell 89:1087) eDNA聚合酶活性位点的一级氨基酸序列特别保 守。例如，在基序A的情况中，序列DYSQIELR(SEQ ID N0:6)保留在通过数百万年进化分离的 生物体的聚合酶中，所述生物体包括，例如，水生栖热菌、沙眼衣原体（C h 1 a m y d i a trachomat i S)和大肠杆菌。
[0050] 在一些实施方案中，可W设计根据本发明的含U抑制剂寡核巧酸，并且可W使用本 文公开的寡核巧酸序列并进一步优化来相似地可逆地抑制其他热稳定性或热活性DNA聚合 酶，例如，来自海栖热袍菌、水生栖热菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种 SpslTJhermus caldophilus、热坚芽抱杆菌、那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚 合酶或与其至少95 %相同的DNA聚合酶。
[0051] -般地说，根据本发明的含U抑制剂寡核巧酸可W设计成相似地可逆地抑制其他 热稳定性或热活性酶，如连接酶、螺旋酶和核酸酶(包括DNA聚合酶的核酸酶活性）。用于运 些酶的可逆寡核巧酸抑制剂已经描述于，参见，例如，美国专利N〇.8,470,531。运些寡核巧 酸抑制剂可W变成本发明的含U寡核巧酸抑制剂，W得益于本文中所述的改善的特性。
[0052] 在一些实施方案中，本发明是一种设计核酸聚合酶的可逆抑制剂的方法，包括设 计具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核巧酸，其中至少一个所述区域包括至 少一个尿喀晚碱基。
[0053] 可W使用美国专利No.6,183,679中所述的指数富集的配体系统进化技术(SELEX) 的体外选择程序来设计和优化本发明的含U抑制剂寡核巧酸。简而言之，在SELEX方法中，将 具有不同序列的寡核巧酸的混合物接触祀标，例如，酶。将结合祀标的寡核巧酸的混合物分 级、扩增并接受另一轮的选择，直至鉴定出少量对祀标具有最大亲和力的寡核巧酸。
[0054] 可W通过任何合适的方法，例如，通过N a r a n g等（1 9 7 9 )的憐酸S醋法， Meth . Enzyml. 68 : 90-99 ; Brown(1979)等的憐酸二醋法，Meth . Enzyml. 68 :109-151; Beaucage(1981)等的二乙基亚憐酷胺法，Tetrahedron Lett. 22:1859-1862;Matteucci (1981)等的S醋法，J. Am. ^em. Soc. 103:3185-3191的直接化学合成;任一种自动化合成方 法;或美国专利齡.4,458,066的固态支持法，来制备本发明的含巧巧制剂寡核巧酸。
[0055] 在一些实施方案中，阻断含巧巧制剂寡核巧酸的3'-端，W防止通过DNA聚合酶的延 伸。在一些实施方案中，将阻断基团(化学部分)添加至寡核巧酸中的末端3'-OH或2'-OH。阻 断基团的一些非限制性实例包括烷基、非核巧酸接头、憐酸醋基团、PhosphotMoate基团、 链烧-二醇部分或氨基。在其他实例中，通过用氨替代氣或通过醋、酷胺、硫酸醋或糖巧的形 成，来修饰3 '-径基基团。在还另一个实例中，用氨替代3 '-OH基团（W形成二脱氧核巧酸）。
[0056] 在其他实施方案中，本发明是一种通过含加抑制剂寡核巧酸调节DNA聚合酶抑制 的方法。本发明的寡核巧酸含有尿喀晚。DNA序列中尿喀晚的存在使得寡核巧酸成为尿喀晚 DNA糖基化酶的祀标。运些酶识别单链或双链DNA中存在的尿喀晚，并裂解尿喀晚碱基和脱 氧核糖之间的N-糖巧键，留下无碱基位点，参见，例如，美国专利No. 6，713，294。尿喀晚-DNA 糖基化酶，缩写为"UD护或"UN护，包括UNG化C 3.2.2.3 )、线粒体UNG1、核UNG2、SMUG1 (单链-选择性尿喀晚-DNA糖基化酶）、TDG (TU错配DNA糖基化酶）、MBD4 (具有甲基结合结构域的尿 喀晚-DM糖基化酶）W及其他真核和原核酶(参见Krokan H.E.等（2002) ,Uracil in DM- occurrence,consequences and repair,Oncogene 21:8935-9232)。
[0057] 因此，根据本发明的方法，反应混合物不再需要加热至超过抑制性寡核巧酸的Tm 的溫度，W便拆开其二级结构并在寡核巧酸-酶复合物中释放酶的抑制作用。替代地，含有 本发明的含U抑制剂寡核巧酸的反应混合物接触一种尿喀晚-N-糖基化酶，如例如，UNG。方 便地，UNG在标准PCR反应混合物中是有活性的。运能够将UNG添加至装配的PCR反应或甚至 添加至PCR预混液(mastermix)中。在热循环开始前，将反应混合物在PCR预混液范围内对 UNG活性最佳的溫度(约50°C )或UNG有活性的溫度范围内解育反应混合物。UNG将裂解含加 抑制剂寡核巧酸中的尿喀晚，留下无碱基位点。已知具有无碱基位点的DNA的主链是不稳定 的，尤其是在高pH条件下的高溫下。根据本发明，从UNG裂解得到的一个或多个尿喀晚并且 因此得到的一个或多个无碱基位点位于双链二级结构的区域中，所述结构将在裂解时W及 随后的主链裂解时拆开。
[0058] 在一些实施方案中，该方法进一步包括将反应混合物接触聚胺，如例如，亚精胺、 精胺和=亚甲基二胺，如美国申请2010/0093041中所述的。在一些实施方案中，聚胺是间插 胺。运组聚胺具有插入部分，能够插入核酸中的碱基对或碱基之间。聚胺上的插入部分的实 例包括芳控和聚芳控，如糞和蔥酿。在一些实施方案中，间插部分自身也可W被一个或多个 聚胺侧链取代。聚胺的添加已经显示出有助于从UNG裂解得到的无碱基DNA的降解。特别是 在50°C下，降解提高1000倍。
[0059] 根据本发明的方法，含U抑制剂寡核巧酸在低于之前所述的寡核巧酸抑制剂的溫 度下可W从稳定的二级结构转变成拆开的结构。运一特征对于设及在释放酶抑制作用需要 的溫度下在常见的反应混合物中不稳定的RNA模板的反应混合物和方法中尤为有益。在较 低溫度下的抑制作用的释放将通过提高可用模板的含量来提高RT-PCR的逆转录步骤的效 率。
[0060] 通常，本发明的含U抑制剂寡核巧酸可W用于其中需要DNA聚合酶的可逆抑制的任 何方法中。例如，寡核巧酸可W用于DNA测序、DNA或RNA扩增、逆转录、逆转录PCR( RT-PCR)或 引物衍生中，例如，用于通过单核巧酸引物延伸检测单核巧酸多态性中。
[0061] 在一些实施方案中，本发明是一种扩增和任选检测祀标核酸序列的方法，包括将 反应混合物(任选含有除了DNA聚合酶W外的PCR所有组分的PCR反应混合物）中的样品接触 DNA聚合酶和含U抑制剂寡核巧酸形式的可逆DNA聚合酶抑制剂。在运个实施方案的变化中， 该方法进一步包括用尿喀晚-N-糖基化酶接触并解育反应混合物。在运个实施方案的变化 中，该方法进一步包括随后同时用聚胺解育反应混合物，所述聚胺任选选自亚精胺、精胺或 =亚甲基二胺。解育可W在40-65°C下进行，或在40、45、55、60或65°(：中的任一个溫度或其 中的任一个溫度下进行，例如，在50°C下进行。该方法进一步包括通过PCR扩增和任选检测 祀标核酸。
[0062] 在还另一个实施方案中，本发明是用于扩增祀标核酸的反应混合物，其含有核酸 聚合酶的可逆抑制剂，所述可逆抑制剂包括本发明的含U抑制剂寡核巧酸，其是具有一个或 多个双链二级结构区域的单链DNA寡核巧酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿喀晚 碱基。反应混合物进一步含有尿喀晚-N-糖基化酶，如UNG。反应混合物优选进一步含有聚 胺，任选选自亚精胺、精胺或=亚甲基二胺。在运个实施方案的进一步变化中，试剂盒还包 括用于PCR或RT-PCR的试剂，包括不限于，核酸前体(dNTP或NTP)、聚合酶、寡核巧酸（引物和 任选，探针)和适用于支持酶活性的缓冲剂。在一些实施方案中，祀标核酸是RNA。在一些实 施方案中，聚合酶酶选自来自海栖热袍菌、水生栖热菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热 菌、栖热菌种59317、栖热菌种205、化61'111118〇31(1〇911；[1113、热坚芽抱杆菌、那不勒斯栖热袍 菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是来自栖热菌种Z05或嗜热栖 热菌的DNA聚合酶。
[0063] 在还另一个实施方案中，本发明是用于扩增祀标核酸的试剂盒，其含有核酸聚合 酶的可逆抑制剂，所述抑制剂包括本发明的含U抑制剂寡核巧酸，其是具有一个或多个双链 二级结构区域的单链DNA寡核巧酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿喀晚碱基。试剂 盒进一步含有尿喀晚-N-糖基化酶，如UNG。试剂盒优选进一步含有聚胺，任选选自亚精胺、 精胺或S亚甲基二胺。在运个实施方案的进一步变化中，试剂盒还可W包括用于PCR或RT-PCR的试剂，包括不限于，核酸前体(dNTP或NTP)、聚合酶、寡核巧酸（引物和任选，探针)和适 用于支持酶活性的缓冲剂。在一些实施方案中，聚合酶酶选自来自海栖热袍菌、水生栖热 菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种Sp S 1 7、栖热菌种Z05、Thermus caldophilus、热坚芽抱杆菌、那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。在一些实施 方案中，聚合酶是来自栖热菌种Z05或嗜热栖热菌的DNA聚合酶。 实施例
[0064] 实施例1.含巧巧制剂寡核巧酸化-适体)的设计 [00化]现有的适体NTQ21-46A(U0)(沈Q ID N0:1)
[0066] 5 ' -CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG-3 '，通过用加替代肌， 生成W下适体：
[0067] Ul(沈Q ID NO:2)
[006引 5 '-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTAUGAUCG-3 '
[0069] 肥(沈Q ID N0:3)
[0070] 5 '-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTATGATCG-3 '
[0071] U3(沈Q ID N0:4)
[0072] 5 '-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTAUGAUCG-3 '
[0073] 适体的预测二级结构显示于图I中。
[0074] 实施例2. U-适体的解链溫度的确定
[0075] 在含有50mm TrisHCl,P册.0, IOOmM KCiamM dNTP，2.5mM MgCb, 0.5XSYBR? Green KMolecular P;robes(Life Technologies，Inc. )&;rlsbad，Cal.)，20nM DNA聚合酶 Z05-D(在所示的情况中）和0.适体之一的反应混合物中确定了UO、Ul、U2和U3适体(SEQ ID NO: 1、2、3和4)的解链溫度。根据制造商的说明，在LightCycler?480(Roche Molecular Diagnostics,Indianapolis，Ind.)中进行解链曲线分析。结果显示于表1中。该结果证明用 U替代T降低了寡核巧酸二级结构的解链溫度。
[0076] 表1.适体的解链溫度
[0077]
[007引实施例3.在UNG存在下的U-适体的解链溫度的确定
[00巧]在实施例1中所述的反应混合物中确定了U0、U1、U2和U3适体(SEQ ID N0:l、2、3和 4)的解链溫度，除了在所示的情况中，添加了 0.抓/化UNG。为了允许UNG裂解，在解链曲线 分析前，将所有反应混合物在37°C下解育。结果显示于表2中。结果证明了用U替代T并且随 后用UNG裂解显著降低了寡核巧酸二级结构的解链溫度。
[0080] 表2.用UNG裂解后适体的解链溫度
[0081]
[0082] 实施例4.不同溫度下在U-适体和UNG存在下的引物延伸
[0083] 通过在不同浓度的U0、U1、U2或U3适体(SEQ ID N0:l、2、3和4)存在下的引物延伸 来确定寡核巧酸抑制剂存在下的DNA聚合酶活性。使用M13mpl8单链DNA(M13;GenBank登录 号X02513)进行试验，用具有W下序列（SEQ ID N0:5)的寡核巧酸作为引物：
[0084] 5 '-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC-3 '
[0085] 通过将12.5化的MgCh添加至96-孔PCR平板中的12.5此含有InM引物延伸的M13模 板的反应预混液中来启动反应。针对所示溫度下LightCyclei@480热循环仪上的99个循 环，每6秒监控引物延伸的模板的延伸。预混液含有2.5mM MgCh，50mM Tris P册.OaOOmM KC1，所有四种 dNTP 的混合物，20nM Z05-D DNA 聚合酶和 0.5xSYBR?Green I(Life Technologies,化rlsbad，化I.)，其允许引物链延伸的巧光检测。测试的适体的浓度范围为 0、50、200、2000碰，^确保适体^相对于205-0 0魁聚合酶0、2.5、10或100《摩尔超量存在 (参见图2-5上的图例）。通过确定随着线性范围中的时间增加的巧光的斜率来定量DNA聚合 酶活性。通过标准化至每个溫度下不存在适体进行的所有反应的平均斜率来计算相对活 性。结果显示于图2-5中。结果证明了添加 UNG显著降低了DNA聚合酶的适体抑制，特别是对 于U3d
[0086] 实施例5. U-适体和UNG存在下KRAS密码子12祀标的实时PCR扩增
[0087] 在运个实施例中，在各种浓度的U0、U1、U2或U3适体(SEQ ID N0:l、2、3和4)的存在 下进行人DNA中的KRAS祀标的扩增。KRAS祀标的性质使其对引物二聚化和非特异性扩增尤 为敏感。在热启动不存在的情况下，非特异性扩增遮掩了祀标浓度中的差异并且妨碍了定 量分析。在运个实施例中，添加连续十倍稀释的KRAS祀标，W评价该方法的定量范围和特异 性。扩增在含有3mM MgCl2,50mM Tricine P服.0,55mM醋酸钟，200yM每种dATP，dCTP和 dGTP，300yM dUTP，30yM dTTP，20nM Z05DNA聚合酶和0.2xSYBR?Green ULife Technologies，Ca;rlsbad，Cal.)，W及在所指示的UNG的反应混合物中进行。Light切cle仪 器中的溫度概况为95°C，15秒，50个循环，50、55或60°C，40秒。通过测量不同浓度的UO、U1、 U2或U3适体(SEQ ID NO: 1、2、3和4)存在下的Ct值，来检测扩增。测试适体的浓度范围为0、 200、1000和2000碰，^确保适体^相对于205-0 0臟聚合酶0、10、100或200义摩尔超量存在。 结果显示于表3-6中。
[008引表3. KRAS祀标(Ct)的扩增，不含UNG，60 °C 10 X超量适体 [0089]
[i
[i 「mw
[0093] 表3-4中的结果证明了需要适体来基于Ct值确定浓度，并且在60°C下在UNG不存在 下，含U适体(SEQ ID N0:2、3和4)行为与亲本适体(SEQ ID N0:1)相似。
[0094] 表5. KRAS 祀标(Ct)的扩增，55 °C
[0095]
[0099]
[0100] 表5-6中的结果证明了在较低退火溫度和提高的适体浓度下，添加 UNG显著降低了 DNA聚合酶的含加适体抑制，特别是对于U3，如通过较低的Ct值证明。
[0101] 实施例6.在U-适体和UNG存在下的RNA的RTPCR扩增
[0102] 在运个实施例中，在标准PCR条件下，按照实施例5中所述的，在含有UNG的反应混 合物中，在不同浓度的U0、U1、U2或U3适体(SEQ ID N0:l、2、3和4)的存在下，进行RNA祀标 化CV JP2-5,1000个拷贝/反应）的扩增。测试适体的浓度范围为相对于ZO加 NA聚合酶无、 100倍和200倍摩尔超量。结果显示于表7中。
[0103] 表7. 55°C下HCVRNA祀标(Ct)的扩增
[0104]
[0105]
[0106] 表7中的结果证明在较低退火溫度(
例如，55°C)下，在UNG存在下的含加适体具有 降低的DNA聚合酶抑制，如通过较低的Ct值证明的。
【主权项】
1. 一种核酸聚合酶的可逆抑制剂，其包括具有一个或多个双链二级结构区域的单链 DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基。2. 权利要求1的可逆抑制剂，其中所述双链二级结构在PCR混合物中在环境温度下是稳 定的。3. 权利要求1或2的可逆抑制剂，其包括SEQ ID NO: 1，其中一个或多个胸腺嘧啶被尿嘧 啶碱基替代。4. 权利要求1-3中任一项的可逆抑制剂，选自SEQ ID N0:2-4。5. -种设计核酸聚合酶的可逆抑制剂的方法，其包括设计具有一个或多个双链二级结 构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一个尿嘧啶碱基。6. 权利要求5的方法，其中使用指数富集的配体系统进化技术(SELEX )，从寡核苷酸的 混合物选择DNA寡核苷酸。7. -种可逆地抑制反应混合物中的核酸聚合酶的方法，包括将混合物与具有一个或多 个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸的混合物接触，其中至少一个所述区域包括至少 一个尿嘧啶碱基。8. 权利要求7的方法，其进一步包括将混合物与尿嘧啶-N-糖基化酶接触。9. 权利要求7或8的方法，其中所述接触在40-65 °C的温度范围中发生。10. 权利要求7-9任一项的方法，进一步包括将样品与聚胺接触。11. 权利要求10的方法，其中所述聚胺选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。12. -种扩增靶标核酸的方法，其包括在扩增前，将含有所述靶标核酸的混合物与具有 一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸接触，其中至少一个所述区域包括至少 一个尿嘧啶碱基。13. 权利要求12的方法，进一步包括在扩增前，将样品与尿嘧啶-N-糖基化酶接触。14. 权利要求12或13的方法，进一步包括将样品与聚胺接触。15. 权利要求14的方法，其中所述聚胺选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。16. -种用于扩增靶标核酸的试剂盒，其含有（1)核酸聚合酶的可逆抑制剂，其包括具 有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至少一 个尿嘧啶碱基；（2)尿嘧啶-N-糖基化酶和(3)聚胺，任选选自亚精胺、精胺或三亚甲基二胺。17. -种用于扩增靶标核酸的反应混合物，其含有（1)核酸聚合酶的可逆抑制剂，其包 括具有一个或多个双链二级结构区域的单链DNA寡核苷酸，其中至少一个所述区域包括至 少一个尿嘧啶碱基；（2)尿嘧啶-N-糖基化酶和(3)聚胺，任选选自亚精胺、精胺或三亚甲基 二胺。
【文档编号】C12N15/115GK105874069SQ201480069584
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年12月18日
【发明人】E·H·菲斯, J·桑菲里普波
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司