使用转糖苷酶的增强发酵工艺的制作方法

使用转糖苷酶的增强发酵工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于改善发酵工艺的方法，所述方法包括提高产品收率、降低粘度和/或减少发泡。
【专利说明】使用转糖昔酶的増强发酵工艺
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求提交于2013年10月24日的国际专利申请PCT/CN2013/085866的优 先权，该申请的内容全文W引用方式并入本文。 发明领域
[0003] 本发明设及使用转糖巧酶制剂改进发酵工艺。还提供了用于筛选合适的发酵宿主 和发酵产物W获得改进的方法。
[0004] 相关领域的描述
[0005] 工业生物技术代表着生物技术的第=波浪潮，如今越来越多的公司开始关注特种 化学品，并利用其作为切入点来构建生物经济。谷氨酸、赖氨酸、乳酸是工业生物技术中有 待进一步研究和开发的主要对象。生物炼制的目标是尽可能由生物质开发更多的产品和价 值流。现有生物炼制发酵技术的背景总结可见于Egge 1 ing，L.和M. Bott，（2010). Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC press ; Zahoor,A.、S.N丄indner等人，（2012). "Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum aimed at alternative carbon sources and new productsComputstionsl 曰nd Structur曰I Biotechnology Journal 3(4);Ikeda,M.和S.Takeno，（20 I 3). "Amino Acid Production by Corynebacterium glutamicum."23:107-147。
[0006] 当前的挑战和目标包括最大程度地提高原材料的产品收率。尽管在运一领域已进 行了许多研究，包括菌株改造、各类原材料的利用和工艺优化，但产量仍远不及理论最大 值。当前的另一问题是控制需氧发酵的发泡水平。在某些情况下，可将生物反应器中发泡阶 段的存在视为促进给定培养物的质量传递和生长的积极因素。在另一方面，泡沫的集中形 成在很多情况下减少了液体的实际体积。此外，可能出现泡沫喷出和发酵产物损失，运会对 工厂生产能力产生负面影响。并且，泡沫溢出会导致污染，因此通常需要使用消泡剂来控制 泡沫，运可能会增加成本并对用于回收最终产物的下游处理产生负面影响。在需氧发酵过 程中，通常通过发泡来控制每一反应器中发酵液的最大量，因此在工业实践中，填充程度 (测定为质量/反应器体积)在70%和85%之间变化。发泡受发酵液的密度、生产菌株的表面 组成、培养基组成、工艺条件、发酵培养基的粘度等影响。虽然有一些研究关注于泡沫的形 成（参见例如，Eggel ing , L.、K. Krumbach等人，（2001). '七-gl Utamate efflux with Corynebacterium glutamicum:why is penicillin treatment or Tween addition doing the s曰me?"Journ曰I of molecul曰r microbiology and biotechnology 3(1):67-68 ;Eggeling,L.和H. Sahm，（2001) . ('The cell wall barrier of Corynebacterium 邑Iutami州m and amino acid efflux."Journ曰I of bioscience 曰nd bioengineering 92 (3):201-213;Eggeling,L.和M.Bott，（2010).Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC press ; Yang, Y.、F. Shi等人，（2012). "Purif ication and structure analysis of mycolic acids in Corynebacterium glutamicum.The Journal of Microbiology 50(2): 235-240)，但仍未有关于通过使用额外的酶减少发泡的报道。本研究 的另一个领域设及提高生物炼制发酵的下游工艺效率。从发酵液中回收氨基酸和有机酸的 工艺可包括常规色谱方法、浓缩结晶方法、直接干燥方法、巧盐沉淀法等等。还经常使用离 屯、、过滤、超滤、结晶、喷雾干燥等来回收发酵产物。

【发明内容】

[0007] -种制备发酵产物的方法，该方法包括:在发酵液中用发酵微生物发酵原料W制 备发酵产物，其中所述发酵包含转糖巧酶，并且其中发酵产物的收率高于不含转糖巧酶的 对照发酵。在一些实施方案中，所述方法还包括回收发酵产物。在一些实施方案中，发酵产 物为赖氨酸、乳酸或谷氨酸。在一些实施方案中，发酵生物为黄色短杆菌(Brevibacterium f Iavum)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) 10178、谷氨酸棒状杆菌10238或 鼠李糖乳杆菌化actobacillus rhamnosus)。在一些实施方案中，转糖巧酶包含SEQ ID NO: 1或与沈Q ID N0:180%、85%、90%、95%、98%、99%相同的任何序列。在一些实施方案中， 转糖巧酶在木霉属中产生。在一些实施方案中，原料包含液化淀粉、颗粒状淀粉、纯葡萄糖、 纯薦糖或糖浆。在一些实施方案中，所述方法还包括减少发酵液中的泡沫和/或降低发酵液 的粘度。在一些实施方案中，转葡糖巧酶制剂(化TG) W发酵原料的化g/MT至服g/MT、2Kg/MT 至5Kg/MT或2Kg/MT至4Kg/MT干固形物的量存在。
[0008] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种筛选发酵益处W识别有益的转糖巧酶 的方法，该方法包括:在发酵液中用发酵微生物发酵原料W制备发酵产物，其中所述发酵包 含转糖巧酶，并且其中发酵产物的收率高于不含转糖巧酶的对照发酵；W及从运些发酵产 物中识别有益的转糖巧酶。在一些实施方案中，发酵产物为赖氨酸、乳酸或谷氨酸。
[0009] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种筛选发酵益处W识别有益的转糖巧酶 的方法，该方法包括:在发酵液中用发酵微生物发酵原料W制备发酵产物，其中所述发酵包 含转糖巧酶，并且其中与不含转糖巧酶的对照反应相比，所述发酵的发酵液中包括减少所 述发酵液中的泡沫和/或降低所述发酵液的粘度；W及从运些发酵产物中识别有益的转糖 巧酶。
[0010] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备赖氨酸的方法，该方法包括:在发 酵液中用黄色短杆菌发酵原料W制备赖氨酸，其中所述发酵包含化TG，其中赖氨酸的收率 比不含TrTG的对照发酵高，并且其中发酵液的粘度与不含TrTG的对照发酵相比降低。
[0011] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备赖氨酸的方法，该方法包括:在发 酵液中用黄色短杆菌发酵原料W制备赖氨酸，其中所述发酵包含黑曲霉(A.Niger)TG，其中 赖氨酸的收率比不含黑曲霉TG的对照发酵高。
[0012] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备赖氨酸的方法，该方法包括:在发 酵液中用黄色短杆菌发酵原料W制备赖氨酸，其中所述发酵包含转葡糖巧酶，其中赖氨酸 的收率比不含转葡糖巧酶的对照发酵高。在一些实施方案中，原料包含纯葡萄糖或糖浆。
[0013] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备赖氨酸的方法，该方法包括:在发 酵液中用黄色短杆菌发酵原料W制备赖氨酸，其中所述发酵包含e葡聚糖酶、木聚糖酶和纤 维素酶复合体，其中赖氨酸的收率比不含e葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发 酵高。
[0014] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备谷氨酸的方法，该方法包括:在发 酵液中用谷氨酸棒状杆菌SP 10238发酵原料W制备谷氨酸，其中所述发酵包含化TG，其中 发酵液的粘度与不含化TG的对照发酵相比降低，并且其中发酵液中的泡沫与不含化TG的对 照发酵相比有所减少。
[0015] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备谷氨酸的方法，该方法包括:在发 酵液中用谷氨酸棒状杆菌SP 10238发酵原料W制备谷氨酸，其中所述发酵包含外切葡聚糖 酶、内切葡聚糖酶、e-葡糖巧酶和木聚糖酶，其中发酵液的粘度与不含外切葡聚糖酶、内切 葡聚糖酶、e-葡糖巧酶和木聚糖酶的对照发酵相比降低，并且其中发酵液的粘度与不含外 切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、e-葡糖巧酶和木聚糖酶的对照发酵相比降低。
[0016] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备乳酸的方法，该方法包括:在发酵 液中用鼠李糖乳杆菌发酵原料W制备乳酸，其中所述发酵包含化TG，其中乳酸的收率比不 含化TG的对照发酵高，并且其中发酵液的粘度与不含化TG的对照发酵相比降低。在一些实 施方案中，原料包含纯葡萄糖或糖浆。
[0017] 在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备乳酸的方法，该方法包括:在发酵 液中用鼠李糖乳杆菌发酵原料W制备乳酸，其中所述发酵包含e葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维 素酶复合体，其中乳酸的收率比不含e葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵 高，并且其中发酵液的粘度与不含e葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵相比 降低。
[0018] 更一般地说，本发明设及在精细化工发酵过程中添加额外的酶。提高产品收率、减 少消泡剂的消耗量、提高下游效率。运些目标在很大程度上可通过添加额外的酶实现，尤其 是含转糖巧酶活性的酶制剂。不受理论的约束，本发明人发现，在生物炼制发酵过程中，借 助于额外的酶，可获得益处，运些益处包括但不限于菌株刺激、发酵速率加快、发酵产物收 率提高、最终残糖减少、消泡剂消耗量减少、发酵液粘度降低和/或沉淀/沉降速度增加。
[0019] 附图简述
[0020] 图1示出使用葡萄糖浆作为底物时，转葡糖巧酶对发酵液中不溶物沉降的影响。
[0021] 图2示出使用纯葡萄糖作为底物时，TrTGL2000对发酵液中不溶物沉降的影响。
[0022] 图3示出使用葡萄糖浆作为底物时，TrGA对发酵液中不溶物沉降的影响。
[0023] 图4A至4B示出使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌10178菌株时，化TG L2000对发酵液中不溶物沉降的影响。
[0024] 图5A至5C示出使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP10238菌株时， hTG L2000对发泡液的影响。
[0025] 图6示出使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株时， ACCELLERA沈D肥T对发泡液的影响。
[0026]
[0027] ^文所用，术语"转糖巧酶"是指能够将如下文所定义的单糖部分从一个分子转 移到另一个分子的任何酶或含酶制剂。术语"转葡糖巧酶"在单糖部分为葡萄糖部分时使 用。在一个实施方案中，转糖巧酶为转葡糖巧酶。在一个实施方案中，转糖巧酶被归入酶类 化.C. )3.2.1.24。在一个实施方案中，转糖巧酶被归入碳水化合物活性酶(CA幻)数据库的 糖巧水解酶家族31。该数据库在 ht1:p: //www. cazy. org/ W 及Cout inho, P. M. fcHenr i ssat, B. (1999)中有所描述。运种分类系统W结构和序列特征，而不是底物特异性为基础：由于序列 和折叠相似性之间存在直接关系，运种分类：（i)比单独的底物特异性更好地反映了运些酶 的结构特征，（ii)有助于反映运些酶之间的进化关系，W及(iii)提供了一种便利的工具来 获得机制信息。在运种分类中，糖巧水解酶化C 3.2.1.-)是一组分布广泛的酶，其水解两个 或更多个碳水化合物之间的糖巧键，或碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖巧键。对 糖巧水解酶(糖巧酶和转糖巧酶)分类的进一步描述可见于化nrissat B( 1991 KHenrissat B,Bairoch A(1993)、Hen;rissat B,Bairoch A(1996)、Davies G,Henrissat 6(1995)和 Henrissat B，化vies G J(1997)。在一个实施方案中，转糖巧酶可得自或得自活生物体。合 适的转糖巧酶来源于细菌或真菌。优选的是来源于真菌的转糖巧酶。在一个实施方案中，转 糖巧酶来源于真菌或与真菌来源的成熟转葡糖巧酶（即SEQ ID N0:1，在本文中称为 叮rT护，因为此转葡糖巧酶通过在木霉属中表达而制备，如WO 09/114380-般所述)具有至 少50%、优选至少55%，如至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
[002引 沈Q ID NO: 1
[0029] Asqsllsttapsqpqftipasadvgaqlianiddpqaadaqsvcpgykaskvqhnsrgftaslqlagrpcnvygtdv esltlsveyqdsdrlniqiIpthvdstnaswyflsenlvprpkasInasvsqsdlfvswsnepsfnfkvirkatgda Ifstegtvlvyenqfiefvtslpeeynlyglgehitqfrlqrnsnltiypsddgtpidqnlygqhpfyldtryykgd rqngsyipvksseadasqdyisishgvfIrnshgleillrsqkliwrtlgggidltfysgpapadvtrqyltstvgl pamqqyntIgfhqcrwgynnwsdladvvanfekfeipleyiwtdidymhgyrnfdndqhrfsysegdeflsklhesg ryyvpivdaalyipnpenasdayatydrgaaddvfIknpdgslyigavwpgytvfpdwhhpkavdfwanelviwskk V过fdgvwydmsevssfCVgSCgtgnltInpshpsfllpgepgdiiydypesfnitnstessssssgsssqssststt tstsvsylrttptpgvrnvehppyvinhdqeghdlsvhavspnathvdgveeydvhglyghqglnatyqglIevwsh krrpfiigrstfagsgkwaghwggdnyskwwsmyysisqalsfsIfdipmfgadtcgfngnsdeelcnrwmqlsaff pfyrnhnelStipqepyrwasvieatksamriryaiIpyfytlfdlahttgstvmralswefpndptlaavetqfmv gpaimvvpvleplvntvkgvfpgvghgevwydwytqaavdakpgvnttisaplghipvyvrggniIpmqepalttre arqtpwalIaalgsngtasgqlyIddgesiypnatIhvdftasrsslrssaqgrwkernplanvtvlgvnkepsavt Ingqavfpgsvtynstsqvlfvgglqnltkggawaenwvlew
[0030] 编码运种蛋白质的核酸序列示于SEQ ID N0:2中。
[0031] 沈Q ID NO :2
[0032] tccaccactgccccttcgcagccgcagtttaccattcctgcttccgcagatgtcggtgcgcagctgattgccaacat Cg过tg过tCCtC过ggCtgCCg过CgCgC过gtCggtttgtCCgggCt3C33ggCttC3333gtgC3gC3C33ttC3Cgtg gattcactgccagtcttcagctcgcgggcaggccatgtaacgtatacggcacagatgttgagtccttgacactgtct gtggagtaccaggattcggatcgactgaatattcagattctccccactcatgttgactccacaaacgcttcttggta ctttctttcggaaaacctggtccccagacccaaggcttccctcaatgcatctgtatcccagagcgacctttttgtgt C过tggtc过过过tg过gccgtcgttc过过tttc过过ggtg过tccg过过过ggct过C过ggcg过cgcgcttttc过gt过C过g过过ggc actgtgctCgtatatgagaatcagtteatGgaatttgtgaccgcgctCCCtgaagaatataacttgtatggccttgg ggagcatatcacgcaattCCgCCtccagagaaatgctaatCtgaccatatatCCttCggatgatggaacacctattg accagtgagtactgatatcccgcccgtatcttctggttctactcttgaaacttactcgtcctagaaacctctacggc C过过C过tcccttct过tctgg过t过C过过g过t过tt过C过过过gg过g过t过ggc过g过过tgggtctt过t过ttcccgtc过过过过gc过g Cgaggctgatgcctcgcaagattatatctccctctctcatggcgtgtttctgaggaactctcatggacttgagatac tcctccggtctcaaaaattgatctggcggaccctaggtggaggaatcgatctcaccttctactcaggccccgccccg gccgatgttaccaggcaatatcttaccagcactgtgggattaccggccatgcagcaatacaacactcttggattcca CC过过tgtcgttggggct过C过过C过过Ctggtcgg过tctggcgg过CgttgttgCg过过Ctttg过g过过gtttg过g过tcccgt tgg过过t过t过tctggtgcgt过ttgt过Ctggttt过tggt过tctc过过过过C过gtct过过C过ggc过Ctt过gg过CCg过t过ttg过 ctacatgcacggatatcgcaactttgacaacgatcaacatcgcttttcctacagtgagggcgatgaatttctcagca agctacatgagagtggacgctactatgtacccattgttgatgcggcgctctacattcctaatcccgaaaatgcctct g过tgcgt过过gtgtct过gtg过C过过过tt过t过tt过ctgcctgt过tgct过过tt过gcg过t过C过g过t过Cgct过Cgt过tg过C过g 过gg过gctgcgg过Cg过Ggtcttcctc过过g过过tcccg过tggt过gcctct过t过ttgg过gccgtttggcc过gg过t过t过C过g tcttccccgattggcatcatcccaaggcagttgacttctgggctaacgagcttgttatctggtcgaagaaagtggcg ttcgatggtgtgtggtacgacatgtctgaagtttcatccttctgtgtcgggagctgtggcacaggtaacctgactct gaacccggcacacccatcgtttcttctccccggtgagcctggtgatatcatatatgattacccagaggctttcaata tC过CC过过Cgct过C过g过ggCggCgtC过gCttCggCggg过gCttCC过gtC过ggCtgC过gc过过CCgCg过CC过CC过Cgtcg acttcggtatcatatctgcggacaacgcccacgcctggtgtccgcaatgttgagcacccaccctatgtgatcaacca tg过CC过过g过过ggcc过tg过tctc过gtgtcc过tgcggtgtcgccg过过tgc过过Cgcstgttgstggtgttgsggsgtstg 过tgtgc过Cggtctct过Cgg过C过tc过过gg过ttg过过Cgct过CCt过CC过过ggtctgcttg过ggtctggtctc过t过过gcgg cggccatttattattggccgctcaaccttcgctggctctggcaaatgggcaggccactggggcggcgacaactattc caaatggtggtccatgtactactccatctcgcaagccctctccttctcacttttcggcattccgatgtttggtgcgg acacctgtgggtttaacggaaactccgatgaggagctctgcaaccgatggatgcaactgtccgcattcttcccattc taccgaaaccacaatgagctctccacaatcccacaggagccttatcggtgggcttctgttattgaagcaaccaagtc cgccatgagaattcggtacgccatcctaccttacttttatacgttgtttgacctggcccacaccacgggctccactg taatgcgcgcactttcctgggaattccctaatgacccaacattggctgcggttgagactcaattcatggttgggccg gcc过tc过tggtggtcccggt过ttgg过gcctctggtc过过t过Cggtc过过gggcgt过ttccc过gg过gttgg过C过tggcg过 agtgtggtacgattggtacacccaggctgcagttgatgcgaagcccggggtcaacacgaccatttcggcaccattgg gcc过C过tccc过gttt过tgt过Cg过ggtgg过过过C过tcttgccg过tgc过过g过gccggc过ttg过CC过Ctcgtg过过gcccgg C过过过ccccgtgggctttgct过gctgc过Ct过gg过过gc过过tgg过过CCgCgtCggggC过gctct过tctcg过tg过tgg过g过 gagcatctaccccaatgccaccctccatgtggacttcacggcatcgcggtcaagcctgcgctcgtcggctcaaggaa g过tgg过过过g过g过gg过过CCCgCttgCt过过tgtg过Cggtgctcgg过gtg过过C过过gg过gCCCtctgCggtg过CCCtg过过t ggacaggccgtatttcccgggtctgtcacgtacaattctacgtcccaggttctctttgttggggggctgcaaaactt gacgaagggcggcgcatgggcggaaaactgggtattggaatgg
[0033]在一些实施方案中，转糖巧酶来源于曲霉属(Aspergillus)物种，尤其是选自黑曲 霉（AspergilIus niger)(本文中称为。黑曲霉TG")、泡盛曲霉（AspergilIus awamori)、± 曲霉（AspergiIlus terreus)、米曲霉（AspergiIlus oryzae)、构巢曲霉（AspergiIlus nidulans)、烟曲霉（Aspergullus fumigatus)和棒曲霉（AspergiIlus clava1:us)的曲霉属 物种，或与来源于曲霉属物种的转葡糖巧酶具有至少50%、优选至少55%，如至少60%，例 如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至 少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。在一个实施方案中，转糖巧酶为黑曲霉或与其 具有至少50 %、优选至少55 %，如至少60%，例如至少65%、至少70 %、至少75%、至少80 %、 至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性。 转糖巧酶可例如通过切割信号序列或通过糖基化进行翻译后修饰。
[0034] 如本文所用，术语"泡沫减少"是指根据实施例6所述的一般条件所评估，相对于空 白泡沫高度条件，12小时后泡沫至少降低1厘米。在一些实施方案中，相对于不含转糖巧酶 的对照发酵，所述泡沫减少包括降低至少1cm、2cm、3cm、4cm或5cm。
[0035] 如本文所用，术语"粘度降低"是指根据实施例8所述的一般条件所评估，相对于对 照组，在12小时之后测得的粘度(mpas)降低。在一些实施方案中，相对于不含转糖巧酶的对 照发酵，粘度降低包括降低至少1 %、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%或60%。
[0036] 如本文所用，术语"纯葡萄糖"是指至少95%的葡萄糖。
[0037] 如本文所用，术语"纯薦糖"是指至少95%的薦糖。
[0038] 如本文所用，术语"原料"是指可被发酵微生物利用W制备发酵产物的任何碳源。 示例性原料包括纯葡萄糖、纯薦糖、颗粒状淀粉、液化淀粉，W及多种纤维素材料中的任一 种。
[0039] 如本文所用，"发酵微生物"是指适用于所需发酵工艺中W制备发酵产物的任何微 生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物可为己糖和/或戊糖发酵生物，或它们的组合。己糖 和戊糖发酵生物均为本领域所熟知。合适的发酵微生物能够进行发酵，即，将糖(诸如葡萄 糖、木糖、木酬糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或低聚糖)直接或间接转化为所需 发酵产物。制备乙醇的细菌和真菌发酵生物的示例在L i n等人，2 0 0 6， Appl .Microbiol .Biotechnol .69:627-642中有所描述。
[0040] 如本文所用，"发酵产物"是指由发酵产生的任何物质。发酵产物可为但不限于:醇 (例如阿拉伯糖醇、正下醇、异下醇、乙醇、丙S醇、甲醇、乙二醇、1，3-丙二醇[丙二醇]、下二 醇、甘油、山梨糖醇和木糖醇）；烧控(例如戊烧、己烧、庚烧、辛烧、壬烧、癸烧、十一烧和十二 烧）；环烧控(例如环戊烧、环己烧、环庚烧和环辛烧）；締控(例如戊締、己締、庚締和辛締）； 氨基酸（例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸）；气体(例如甲 烧、氨气化2)、二氧化碳(0)2)和一氧化碳(CO));异戊二締;酬(例如丙酬）；有机酸(例如乙 酸、醋酬酸、己二酸、抗坏血酸、巧樣酸、2,5-二酬-D葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄 糖酸、葡萄糖醒酸、戊二酸、3-径基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酷乙酸、丙 酸、班巧酸和木糖酸）；1,3-丙二醇和聚酬。发酵产物还可W是作为高价值产物的蛋白质。
[0041] 除了本文中运些明确举例示出的生物体，本领域的技术人员应理解，可使用下列 生物体来制备相应的发酵产物。例如，可使用选自棒状杆菌（coryneform)、肠杆菌 化ntobacteriaceae)和芽抱杆菌（Bacillus)，W及谷氨酸棒状杆菌、有效棒状杆菌 (Corynebacterium efficiens)、靑石南棒状杆菌（Corynebacterium callunae)、热产氨棒 状杆菌（Corynebacterium thermoamino邑enes )、产氨棒状杆菌（Corynebacter ium ammoniagenes)和大肠杆菌化.Coli)的细菌制备赖氨酸。可使用谷氨酸棒状杆菌或大肠杆 菌制备MSG。乳酸可通过基于细菌的工艺(包括史氏芽抱杆菌(Bacillus SmitMi)、凝结芽 抱杆菌（Bacillus Coagulans)、热隧淀粉芽抱杆菌（Bacillus Thermoamylovorans)、嗜热 脂肪地芽抱杆菌(Geobacilus Stearothemo地ilis)) W及基于酵母的工艺(包括假丝酵母 属（Candida)、酵母属（Saccharomyces)、裂殖酵母属（Shizosaccharomyes)、克鲁维酵母菌 属化Iuyveromyces )、毕赤酵母属（Pichia)、伊萨酵母属（Issachenkia)或汉逊酵母属 (化nsenula))来制备。
[00创 详细描述
[0043] 材料
[0044] 用于k赖氨酸发酵的微生物
[0045] 发酵生物的示例包括购自CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中屯、）的黄色短杆 菌20879和谷氨酸棒状杆菌10178。
[OOW 用于k谷氨酸发酵的微生物
[0047]发酵生物的示例包括购自CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中屯、）的谷氨酸棒 状杆菌物种10238。
[004引用于k乳酸发酵的微生物
[0049]发酵生物的示例包括购自CGMCC(中国普通微生物菌种保藏管理中屯、）的鼠李糖乳 杆困。
[00加]微生物培养条件 [005。琼脂种子制备
[0052] 用于本发明的赖氨酸发酵微生物琼脂板培养基包含：葡萄糖5g/L、化Cl 5g/L、牛 肉膏1 Og/L、蛋白腺1 Og/L、琼脂20g/L，抑7.0;
[0053] 用于本发明的谷氨酸微生物琼脂板培养基包含：葡萄糖5g/L、NaC15g/L、牛肉膏 1 Og/L、蛋白腺 1 Og/L、琼脂20g/L，抑 7.0;
[0054] 用于本发明的乳酸微生物琼脂板培养基包含:酪蛋白10.Og、牛肉膏10.Og、酵母提 取物5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钢5.0g、巧樣酸二锭2.0g、Tween 80 1.0g、K2HP〇4 2.0邑、 MgS〇4*7出0 0.2g、MnS〇4 ?出0 0.05g、琼脂20g、蒸馈水 1.0L，pH 6.8。
[0055] 将琼脂板培养基在121°C下灭菌20min(立式加热压力蒸汽灭菌器，LDZM-80KCS，上 海申安医疗器械厂），然后将其分配至平板上，待硬化后，在室溫下培养2地，用于污染试验。 将细菌转移至净化工作台（OptiMair" ,Ecso超净工作台化CSO Laminar Flow cabinet)) 上的琼脂板中，并在BINDER培养箱中培养24h。 障]发酵种子制备
[0057]用于本发明的赖氨酸发酵微生物种子培养基包含：葡萄糖25g/L、CSLP(玉米浆粉 末）24g/L、（NH4)2S〇4 5g/L、K此P〇4 lg、MgS〇4.7出00.5g/L、CaC〇3 15g/L，pH 7.0。根据上文 配方制备IL种子培养基，并调节pH，然后向每个500mLS角烧瓶中分配60mLW更好地溶解 氧，然后在12rC下灭菌保持20min，冷却至室溫后，将生物质从琼脂板转移至烧瓶中，然后 在13化pm、3(TC下于NBS旋转振荡器中培养8至lOh，保持OD高于0.8,通过显微镜检查菌株W 确保细菌形状呈"V形"且不受污染。
[005引用于本发明的谷氨酸发酵微生物种子培养基包含：葡萄糖25g/L、CSLP 24g/L、 1(2册04 1.5邑/1、1邑504.7出0 0.4邑/1、尿素5邑/1，口117.3。根据上文配方制备1巧中子培养基， 并调节抑，然后向每个SOOmLS角烧瓶中分配60mL W更好地溶解氧，然后在12rC下灭菌保 持20min，冷却至室溫后，将生物质从琼脂板转移至烧瓶中，然后在13化pm、32°C下于NBS旋 转振荡器中培养5至化，保持OD高于0.9，通过显微镜检查菌株W确保细菌形状呈"V形"且不 受污染。
[0059]用于本发明的乳酸发酵微生物种子培养基包含:酪蛋白10.Og、牛肉膏10.Og、酵母 提取物5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钢5.0g、巧樣酸二锭2.0g、Tween 80 1.0g、K2册〇4 2.0g、 MgS化? 7出O 0.2g、MnS〇4 ?此O 0.05g，p册.8。根据上文配方制备IL种子培养基，并调节抑， 然后向每个300mL烧瓶中分配100血，然后在12rC下灭菌保持20min，冷却至室溫后，将生物 质从琼脂板转移至烧瓶中，然后在15化pm、37 °C下于NBS旋转振荡器中培养14至18h，保持OD 高于0.5，通过显微镜检查菌株W确保无污染。
[00側发酵培养基制备
[0061] 化发酵罐中的赖氨酸发酵微生物发酵营养培养基包含：初始葡萄糖80g/L、CSLP 15g/L、（NH4)2S〇4 15g/L、K出P〇4 lg/L、MgS〇4 ? 7出00.5g/L、FeS〇4 ? 7此0 9.9mg/L、MnS〇4 ? 出0 6.15mg/L、维生素 BI (VBl) 100yg/L、生物素(VH) 100yg/L、消泡剂THIX-298 0.05g/L。对 于赖氨酸发酵，初始工作体积为3.化(营养液2.75L、初始葡萄糖0.化、种子液0.35L)，营养 液制备：称取粉末CSL(玉米浆）52.5g、（NH4)2S04 52.5g、KH2P04 3.5g、MgS04?7此0 1.75g、 FeS04?7H20 7mg、MnS04?H20 7mg、VBl 350i^g、VH 350i^g、消泡剂0.175g，溶于2.7化水中， 然后加入发酵罐。初始葡萄糖制备：称取240g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为400mL，然后 加入一个烧瓶中。高浓度葡萄糖制备（用于在发酵工艺中给料）：称取400g葡萄糖，溶于水 中，使得总体积为500mL，然后加入一个使用管子连接至发酵罐的烧瓶中。消泡剂制备:称取 20g消泡剂，溶于SOg水中，然后加入一个使用管子连接至发酵罐的烧瓶中。准备一个空烧瓶 (供N出?出0在发酵工艺中调节pH之用），并使用管子将烧瓶连接至发酵罐。校准pH电极 (161'化邸1'化抓0，11冲1..〇@3030)并将溶解氧电极(161'化61?1'01^600)极化化。固定发酵罐， 确保所有烧瓶与发酵罐放置在一起，所有培养基应在12rC下灭菌保持20min。重复上述所 有步骤，制备另一化发酵罐的发酵培养基。灭菌后，应向发酵罐中累入无菌空气W防止污 染;将初始葡萄糖累送至发酵罐，并将N曲?出0快速加入空烧瓶中，然后调节抑至6.5;打开 水龙头，并将溫度自动控制在3(TC。将揽拌速度设置为2(K)巧m，等待约半小时使所有参数适 中，将DO电极设置为100%;向发酵罐中加入350mL种子液，其中一个发酵罐含酶，另一发酵 罐不含酶，开始发酵，将种子加入发酵罐之后，DO显著降低，故应增加揽拌速度和曝气量W 使DO维持在15%至30%;在发酵过程中，每S或四小时取一次样品W测定葡萄糖和赖氨酸， 如果葡萄糖浓度低于30g/L，则开始添加高浓度的葡萄糖，W将葡萄糖浓度维持在约30g/L 至40g/L。
[0062] 化发酵罐中的谷氨酸发酵微生物发酵营养培养基包含:初始葡萄糖90至lOOg/L、 CSLP 4g/L、MgS〇4.7出0 0.8g/L、K2HP〇4 2g/L、FeS〇4.7H2〇22mg/L、MnS〇4 ?出0 22mg/L、维 生素扣(￥81)0.2111旨/1、消泡剂^^-2980.1旨/1。对于谷氨酸发酵，初始工作体积可为2.5至 2.7L，添加的葡萄糖可为200mL至500mL。例如，对于谷氨酸发酵，初始工作体积为2.化(营养 液1.化、初始葡萄糖0 .化、种子液0.30L)，营养液制备：称取粉末CSLlO . 0g、MgS化? 7出0 2.0邑、1(出口04 5邑、尸6504*7出0 55111邑、]\1记04*出055111邑、￥81 500蛇、消泡剂0.25邑，溶于1.81水 中，然后加入发酵罐。初始葡萄糖制备:称取250g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为400mL，然 后加入一个烧瓶中。770g/L高浓度葡萄糖制备（用于在发酵工艺中给料）：称取385g葡萄糖， 溶于水中，使得总体积为500mL，然后加入一个使用管子连接至发酵罐的烧瓶中。消泡剂制 备:称取40g消泡剂，溶于160g水中，然后加入一个使用管子连接至发酵罐的烧瓶中。准备一 个空烧瓶(供畑3 ?出0在发酵工艺中调节抑之用），并使用管子将烧瓶连接至发酵罐。校准抑 电极(METTLER TOL邸0, InPro"- 3030)并将溶解氧电极(METTLER TOLEDO)极化化。固定发酵 罐，确保所有烧瓶与发酵罐放置在一起，所有培养基应在12 rC下灭菌保持20min。重复上述 所有步骤，制备另一化发酵罐的发酵培养基。灭菌后，应向发酵罐中累入无菌空气W防止污 染;将初始葡萄糖累送至发酵罐，并将N出?此O快速加入空烧瓶中，然后调节抑至7.0-7.1; 打开水龙头，并将溫度自动控制在30°C。将揽拌速度设置为2(K)rpm，等待约半小时使所有参 数适中，将DO电极设置为100%;向发酵罐中加入300mL种子液，其中一个发酵罐含酶，另一 发酵罐不含酶，开始发酵，将种子加入发酵罐之后，DO显著降低，故应增加揽拌速度和曝气 量W使DO维持在30%至50%。在发酵过程中，每S或四小时使发酵溫度升高TC, 4至化后， 溫度达到38°C，每S或四小时取一次样品W测定葡萄糖和谷氨酸，如果葡萄糖浓度低于 20g/L，则开始添加高浓度的葡萄糖，W将葡萄糖浓度维持在约20g/L至30g/L。
[0063] IL发酵罐中的乳酸发酵微生物发酵营养培养基包含:初始糖80g/L、CSLP 40g/L、 酪蛋白 lOg/L、牛肉膏lOg/L、酵母提取物 10g/L、Tween 801.5g/L、MnS〇4 ?出0 0.3g/L、碳酸 巧20g/L，抑6.5。对于乳酸发酵，初始工作体积为0.化(营养液0.化，初始葡萄糖0.05L，种 子液0.05至0.1 OU，营养液制备:称取粉末玉米浆20g、酪蛋白5.Og、牛肉膏5.Og、酵母提取 物5.0旨、1^6611 80 0.75旨、111504.肥0 0.15旨、碳酸巧10旨，抑6.5;初始葡萄糖制备：称取 40g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为50mL，然后加入一个烧瓶中。高浓度葡萄糖制备（用于 在发酵工艺中给料）：称取100g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为150mL，然后加入一个使用 管子连接至发酵罐的烧瓶中。准备一个空烧瓶或装有50mL蒸馈水的烧瓶(供N出?出0在发酵 工艺中调节pH之用），并使用管子将烧瓶连接至发酵罐。校准pH电极(MET化ER TOL抓0， InPro'" 3030)并将溶解氧电极(METTLER TCL抓0)极化化。固定发酵罐，确保所有烧瓶与发 酵罐放置在一起，所有培养基应在12rC下灭菌保持20min。重复上述所有步骤，制备另一 IL 发酵罐的发酵培养基。灭菌后，应向发酵罐中累入无菌空气W防止污染;将初始葡萄糖累送 至发酵罐，并将N出?此0快速加入空烧瓶中，然后调节抑至6.5;打开水龙头，并将溫度自动 控制在40°C至45°C。将揽拌速度设置为20化pm，等待约半小时使所有参数适中，然后向发酵 罐中加入50mL种子液，其中一个发酵罐含酶，另一发酵罐不含酶，开始发酵。在发酵过程中， 通过添加额外的N出?此0或稀释的畑3 ?出0自动调节pH。每S或四小时取一次样品，通过 HPLC分析W测定糖和乳酸含量。
[0064] 如本文所用，CSLP是指广泛用于微生物发酵的喷雾干燥玉米浆粉末，购自 Roquette Co. ,Ltd。葡萄糖浆为购自西王集团有限公司的液体葡萄糖。HPA邸分析结果表明 葡萄糖超过85%，Wmg/L表示。消泡剂THIX-298购自山东省烟台恒蠢化工科技有限公司。7L 发酵罐购自K0BI0TECH CO. ,LTDJL发酵罐购自APHJTECH CO. ,LTD。除非另外指明，否则其 他化学品购自国药有限公司；牛肉膏、蛋白腺、酪蛋白、琼脂为BR级，其余均为AR级。
[00化]產
[0066] 转葡糖巧酶k2000(DuPont Industrial Biosciences的产品，2013年）：经纯化的 D-葡糖基转移酶(转葡糖巧酶，EC 2.4.1.24)，不含葡糖淀粉酶活性。通过受控的发酵过程， 使用经基因修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株制备转葡糖巧酶心2000。
[0067] 转葡糖巧酶L"Amano"(由Amano Pharmaceutical Co. ,Ltd生产）：黑曲霉葡糖基转 移酶。此酶为O-葡糖巧酶化C 3.2.1.20)，能够从分子的非还原端水解其底物W释放葡萄糖 分子。同样，在高底物浓度下，此酶能够进行糖基转移反应，而不是底物的水解。由于运种糖 基转移能力，此酶还被称为转葡糖巧酶。
[006引 0ptimashK'BG(Genencor International，Inc):用于快速降低粘度的降粘酶、高 活性e葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体，由经修饰的木霉属宿主制得，其中相对于野 生型，所述经修饰的木霉属宿主缺失CB化和CBH2(纤维二糖水解酶I和II)，并且EGII (内切 葡聚糖酶，一种e葡聚糖酶)被过度表达至少50%，如例如W02A118257中所提出。
[0069] lYGAWenencor International, Inc):由里氏木霉的非病原性、非产毒型菌株制 备的葡糖淀粉酶，所述里氏木霉经基因修饰W过度表达天然里氏木霉葡糖淀粉酶(参见例 如美国专利7,413,887)。
[0070] ACCELLERASEK'D肥T(Genencor International, Inc):由经基因修饰的里氏 木霉菌株制备，其不仅包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、0-葡糖巧酶，还包含木聚糖酶和 其他半纤维素酶，如在2013年可从Danisco US Inc、D证ont Industrial Biosciences商购 获得。
[0071] 遞
[007。通过HPA邸测定含糖量
[0073] 在Dionex ICS-5000离子色谱仪（Sunnyvale,CA,USA)上进行糖分析。此离子色谱 仪由GP50梯度累、ED 40电化学检测器(包括由金电极和抑-Ag/AgCl参考电极组成的脉冲安 培检测池)构成。在配备有保护柱(3mm X 50mm)的CarboPakTM PA200色谱柱(3mm X 250mm)上 进行分离。Carbo化kTM PA200色谱柱中的流速为0.5mL/min，柱溫为30 °C。进样量为25化。 Carbo化kTM PA200色谱柱所用的梯度为：O-Smin ,IOOmM NaOH, 0-40mM NaAc; 5-60min， IOOmM化0H，40-500mM化Ac;60-70min，100mM化OH。脉冲安培检测用作检测器，并使用W 下脉冲电位和持续时间：El = 0.1V，tl=400ms;E2 = -2V，t2 = 20ms;E3 = 0.6V，^ = 10ms;E4 =-0.1￥，14 = 701113。使用0虹〇111616〇]16.8工作站进行数据采集和积分。
[0074] 通过分光光度计测定发酵生物质
[00巧]在甜IMADZU UV-1700分光光度计上进行生物质分析。用Imol/L盐酸将发酵液稀释 25倍，然后在562nm处测定赖氨酸的OD(光密度)值或在620nm处测定谷氨酸的OD值。
[007引通过SBA40C生物传感器测定残余的葡萄糖和赖氨酸/谷氨酸含量
[0077]在SBA-40C生物传感器（山东省科学院生物研究所)上测定残余的葡萄糖和赖氨酸 的收率。用纯化水将发酵液稀释100倍，在分析样品之前需进行校准。注入数次25化标准样 品（lOOmg/化葡萄糖和IOOmg/化赖氨酸储备溶液），W完成校准。注入25化样品，并记录屏幕 上显示的数据。每次校准后，可分析10个样品。如果样品数超过10个，则执行重新校准步骤。 [007引通过HPLC(高压液相色谱)测定乳酸含量:
[00巧]HPLC方法采用Agilent 1100色谱柱，柱规格：BIO-RAD Aminex HPX-87H或Rezex ROA-有机酸。分析方法:ESTD。具体分析过程:流动相:0.005mo 1 /L此S化。取样品，稀释10倍， 并用0.45皿滤膜过滤。其他HPLC参数:进样体积:20化;累流量:0.6mL/min;柱溫箱溫度:60 °C ; RID，光学单元溫度:35 °C。
[0080] 通过HAAKE Y巧50测定发酵液粘度
[0081 ]在DC30-K10冷冻循环器水浴中，用配备有化-10轴的HAAKE FT550粘度计进行粘度 分析(所述装置均来自化ermo Scientific)。称取100克发酵液，置于HAAKE管中，然后使用 FklO轴，W固定剪切速率A10[ 1/s]、固定溫度30°C运行IOmin。当此过程停止时，将发酵液 倒出，并清洗HAAKE管，W便运行另一批分析。粘度数据由HAAKE工作站记录。
[00剧不溶性固体自然沉降观察
[0083] 将发酵液倒入烧杯中，用包裹物盖住，并置于4至8°C冷藏室中保持1她，然后拍照。
[0084] 实施例1:
[0085] 使用糖浆作为底物并采用黄色短杆菌时，含转葡糖巧酶活性的市售产品对赖氨酸 发酵影响的比较
[0086] 在SOOmL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于 130巧m、30°C及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用S角烧瓶 培养约lOh，并保持OD高于0.8。将发酵培养基在121°C下灭菌12min，待溫度冷却至30°C后， 向发酵罐中加入80g/L初始葡萄糖，并用氨氧化锭将培养基的P的周节至6.5。然后向此发酵 培养基中加入 〇.75g T;rTG l^-2000(Genencor International,Inc.的产品）和 Transglucosidase?L('Amano"（由 Amano Pharmaceutical Co. ,Ltd. ,Japan 生产似及 SOOmL 种子液（10%v/v)。将溫度保持在30°C，并通过加入氨氧化锭将pH控制在6.8至7.0，通过调 节曝气量和揽拌速度，将DO保持在10%至25%。在发酵过程中，每S或四小时取一次样品W 测定葡萄糖，通过添加高浓度的葡萄糖使其维持于合适的浓度(30g/L至40g/L)，并分别在 化和3化时加入0.75g TrTG和AMANO TG。
[0087] 表1:使用葡萄糖浆作为底物时，转葡糖巧酶对赖氨酸发酵收率、发酵结束时的残 余葡萄糖^及发酵液粘度的影响 [008引
[0089] 表1和图1的结果表明，与空白相比，额外的化TG L2000导致赖氨酸.HCl收率提 高、残余葡萄糖减少、发酵液粘度降低并且沉淀加快。此外，如TrTG L2000所示，与空白相 比，AMANO TG导致赖氨酸-HCl收率提高、残余葡萄糖减少并且沉淀加快，但AMANO TG导致 发酵液粘度高于空白。
[0090] 实施例2
[0091] 使用纯葡萄糖作为底物并采用黄色短杆菌时，TrTG L2000对赖氨酸发酵的影响
[0092] 在SOOmL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于 130rpm、30°C及工作体积为60血/SOOmL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用S角烧瓶 培养约IOh，并保持OD高于0.8。将发酵培养基在12rC下灭菌12min，待溫度冷却至30°C后， 向发酵罐中加入80g/L初始葡萄糖，并用氨氧化锭将培养基的P的周节至6.5。然后向此发酵 培养基中加入 〇.75g hTG k2000(Genencor International, Inc.的产品）W 及300血种子 液（10%v/v)。将溫度保持在30°C，并通过加入氨氧化锭将抑控制在6.8至7.0,通过调节曝 气量和揽拌速度，将DO保持在10%至25%。在发酵过程中，每S或四小时取一次样品W测定 葡萄糖，通过添加高浓度的葡萄糖使其维持于合适的浓度(30g/L至40g/L)，并分别在化和 3化时加入0.75g TrTG L2000。
[OOW] 表2:使用纯葡萄糖作为底物时，IYTG L2000对赖氨酸发酵收率、发酵结束时的残 余葡萄糖^及发酵液粘度的影响
[0094]
[0095] 表巧日图2表明，与空白相比，额外的化TG L2000导致赖氨酸? HCl收率提高、残余 葡萄糖减少、发酵液粘度降低并且沉淀加快。
[00%] 实施例3使用糖浆作为底物并采用黄色短杆菌时，TrGA对赖氨酸产量的影响 [0097]本实验评估TG或来自木霉属生产菌株的残余物是否可能引起改善。在SOOmL烧瓶 中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于13化pm、3(TC及工作体积 为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用S角烧瓶培养约lOh，并保持OD高 于0.8。将发酵培养基在12 rC下灭菌12min，待溫度冷却至30°C后，向发酵罐中加入80g/L初 始葡萄糖，并用氨氧化锭将培养基的抑调节至6.5。通过加入氨氧化锭将发酵pH控制在6.8 至7.0,通过调节曝气量和揽拌速度，将DO保持在10%至25%。在发酵过程中，每S或四小时 取一次样品W测定葡萄糖，并通过添加葡萄糖浆（500g/400mL)使其维持于合适的浓度 (30g/L至40g/L)。在发酵开始时，加入0.715g TrGA,并在发酵化时再添加0.715g，因此总 化GA为2.4Kg/MT葡萄糖干固形物。发酵结束后，测定赖氨酸产量、残糖、发酵液粘度和沉淀 (表3,图3)。
[00側表3:使用葡萄糖浆作为底物时，TrGA对赖氨酸发酵收率、发酵结束时的残余葡萄 糖^及发酵液粘度的影响 [00991
[0100] 结果表明，在赖氨酸发酵过程中，额外的化GA提高了发酵液粘度并使残余葡萄糖 增加，但降低了赖氨酸XHCl的产量。与空白相比，赖氨酸产量较低，因此表明赖氨酸产量降 低。不受理论的约束，此观察结果支持了 W下假设:TrTG起着改善赖氨酸发酵的作用，而来 自木霉属表达宿主的残余物可能没有运种作用。
[0101] 实施例4使用纯葡萄糖作为底物并采用黄色短杆菌时，0PTIMASH?BG对赖氨酸产量 的影响
[0102] 在SOOmL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于 130巧m、30°C及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用S角烧瓶 培养约lOh，并保持OD高于0.8。将发酵培养基在12TC下灭菌12min，然后使溫度冷却至30 °C，初始葡萄糖为80g/L，通过加入氨氧化锭将pH控制在6.8至7.0，并通过调节曝气量和揽 拌速度将DO保持在10%至25%。在发酵过程中，每S或四小时取一次样品W测定葡萄糖，并 通过添加葡萄糖溶液(500g/400mL)使其维持于合适的浓度(30g/L至40g/L)。在发酵开始、 发酵16h和发酵3化时分别添加1.12g、0.8g、0.8g0PTIMA甜BG，添加的0PTIMA甜BG总剂量 为4Kg/MT葡萄糖干固形物，发酵后，测定赖氨酸产量、残糖和发酵液粘度。
[。…引表4:使用纯葡萄糖作为底物时，OPTIMASH BG对赖氨酸发酵收率、发酵结束时的残 余葡萄糖^及发酵液粘度的影响 [0104]
[0
[0106]结果表明，在赖氨酸发酵过程中，额外的OPTIMA甜BG可能略微降低了发酵液粘度 并使残余葡萄糖减少，但显著提高了赖氨酸XHCl的产量。
[0…7] 实施例5使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌1017別寸，转葡糖巧酶对赖 氨酸产量的影响
[0108]在SOOmL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于 130rpm、30°C及工作体积为60血/SOOmL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用S角烧瓶 培养约lOh，并保持OD高于0.8。将发酵培养基在12rC下灭菌12min，然后使溫度冷却至30 °C，初始葡萄糖为lOOg/L，通过加入氨氧化锭将抑控制在6.8至7.0，并通过调节曝气量和揽 拌速度将DO保持在10%至25%。在发酵过程中，每S或四小时取一次样品W测定葡萄糖，并 通过添加葡萄糖溶液(SOOg/lOOOmL)使其维持于合适的浓度(30g/L至40g/L)。在发酵开始、 发酵15h、23h、3化和36h时分别添加1.4旨、0.8旨、0.8旨、0.8旨和0.8旨转葡糖巧酶1^-2000 (Genencor International, Inc.的产品）。转葡糖巧酶心2000的总剂量为4Kg/MT葡萄糖干 固形物，发酵后，测定赖氨酸产量、残糖、发酵液粘度和发酵液颜色。
[0…9] 表5:使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌10178菌株时，IYTG对赖氨酸 发酵收率、发酵结束时的残余葡萄糖W及发酵液粘度的影响
[0110]
[0111]结果表明，尽管颜色随额外转葡糖巧酶心2000的添加而改变，但是该酶并未影响 赖氨酸X肥1的产量。
[01。]实施例6使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 1023別寸，转葡糖巧酶 对谷氨酸产量的影响
[0113]在SOOmL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于 130巧m、32°C及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用S角烧瓶 培养约5至化，并保持OD高于0.9。将发酵培养基在121°C下灭菌12min，然后使溫度冷却至30 °C。初始葡萄糖为lOOg/L，通过加入氨氧化锭将发酵pH控制在7.0至7.1，并通过调节曝气量 和揽拌速度，将DO保持在20 %至40 %。在发酵过程中，每S或四小时使发酵溫度升高rC，4 至化之后，溫度达到38°C，每=或四小时取一次样品W测定葡萄糖和谷氨酸，如果葡萄糖浓 度低于20g/L，则开始添加高浓度的葡萄糖W将葡萄糖浓度维持在约20g/L至30g/L。在发酵 开始(Oh)，发酵化、1化、2比时分别添加0.9525g、0.9525g、0.3175g和0.3175g转葡糖巧酶k 2000(Genencor International, Inc.的产品）。转葡糖巧酶k2000的总剂量为4Kg/MT葡萄 糖干固形物，在发酵过程中拍照记录发泡水平的变化，发酵之后，记录谷氨酸产量、残糖、消 泡剂消耗量、发酵液粘度和发酵液颜色。
[0114] 表6:使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株时，TrTG对谷氨 酸发酵收率、发酵结束时的残余葡萄糖W及发酵液粘度的影响
[0115]
[0116] 表7:使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株时，hTG对消泡 剂消耗量的影响
[0117]
[0118] 运些结果表明，在谷氨酸发酵过程中添加额外的化TG会降低发酵液粘度，减少残 余的葡萄糖，并显著提高谷氨酸的产量，同时减少泡沫形成并使消泡剂消耗量至少减少 50%。
[0119] 实施例7使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238时， ACCELLERASE?D肥T对谷氨酸产量的影响
[0120] 在SOOmL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于 130rpm、32°C及工作体积为60血/SOOmL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用S角烧瓶 培养约5至化，并保持OD高于0.9。将发酵培养基在12rC下灭菌12min，然后使溫度冷却至30 °C，初始葡萄糖为92.5g/L，通过加入氨氧化锭将pH控制在7.0至7.1，并通过调节曝气量和 揽拌速度将DO保持在30%至50%。在发酵过程中，每S或四小时使发酵溫度升高rC，4至化 之后，溫度达到38°C，每=或四小时取一次样品W测定葡萄糖和谷氨酸，如果葡萄糖浓度低 于20g/L，则开始添加高浓度的葡萄糖W将葡萄糖浓度维持在约20g/L至30g/L。在发酵开始 (Oh)、发酵8h、1化时分别添加0.808g、0.808g和0.202g ACC化LERASE DUET(DuPont Industrial Biosciences的产品，2013年）eACCELLERA沈 DUET的总剂量为4.5Kg/MT葡萄糖 干固形物，在发酵过程中拍照记录发泡水平的变化，发酵之后，记录谷氨酸产量、残糖、消泡 剂消耗量、发酵液粘度和发酵液颜色。
[0。1] 表8:使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株时， accellerase?duet对谷氨酸发酵收率、发酵结束时的残余葡萄糖W及发酵液粘度的影响
[01991
[0。引表9:使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株时， ACCELLERASE对消泡剂消耗量的影响
[0124]
[0125] 结果表明，在谷氨酸发酵过程中添加额外的ACCE化ERASE D肥T会显著降低发酵液 粘度，略微减少残余的葡萄糖，并略微提高谷氨酸的产量，同时减少泡沫形成并使消泡剂消 耗量减少30 %。
[01%] 实施例8:使用纯薦糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌时，转葡糖巧酶对乳酸产量的 影响
[0127]在300mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于 150巧m、37 °C及工作体积为100血/300mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，培养约14至 1她，并保持OD高于0.5。将发酵培养基在12rC下灭菌12min，然后使溫度冷却至40°C，初始 薦糖为80g/L(40g/500mL)，通过加入氨氧化锭将抑控制在6.5，每S或四小时取一次样品W 测定薦糖和乳酸，并在发酵20h至3化期间添加150mL高浓度薦糖（100g/150mL)。在发酵开始 (化）、发酵2011、2比时分别添加0.145旨、0.145旨和0.140旨1'巧6。1'巧6的总剂量为3.07蛇/^了 薦糖干固形物，发酵后分析乳酸产量、发酵液粘度。
[01巧]表10:使用纯薦糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌菌株时，TrTG对乳酸发酵收率、发 酵结束时的残余薦糖W及发酵液粘度的影响 [01291
[0130]结果表明，在乳酸发酵过程中添加额外的化TG会显著降低发酵液粘度，并提高乳 酸的产量。
[01引]实施例9:使用纯葡萄糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌时，转葡糖巧酶对乳酸产量 的影响
[0132]在300mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于 150巧m、37 °C及工作体积为100血/300mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，培养约14至 1她，并保持OD高于0.5。将发酵培养基在121°C下灭菌12min，然后使溫度冷却至40°C，初始 葡萄糖为80邑凡(40邑/5001111^，通过加入氨氧化锭将9巧空制在6.5，每^或四小时取一次样品 W测定薦糖和乳酸，并在发酵地至2化期间添加150mL高浓度葡萄糖（100g/150mL)。在发酵 开始（Oh)、发酵10h、22h时分别添加0.150g、0.150g和0.300g IYTGsTrTG的总剂量为 4.28Kg/MT葡萄糖干固形物，发酵后分析乳酸产量、残糖、发酵液粘度。 帅]表11:使用纯葡萄糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌菌株时，TrTG对乳酸发酵收率、 发酵结束时的残余葡萄糖W及发酵液粘度的影响 [01341
[0135]结果表明，在乳酸发酵过程中添加额
外的化TG会显著降低发酵液粘度，减少残余 的葡萄糖并提高乳酸的产量。
[0。引实施例10使用纯葡萄糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌时，0PTIMASH BG对乳酸产 量的影响
[0137]在300mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于 150巧m、37 °C及工作体积为100血/300mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，培养约14至 1她，并保持OD高于0.5。将发酵培养基在121°C下灭菌12min，然后使溫度冷却至45°C，初始 葡萄糖为80邑凡(40邑/5001111^，通过加入氨氧化锭将9巧空制在6.5，每^或四小时取一次样品 W测定薦糖和乳酸，并在发酵化至2化期间添加150mL高浓度葡萄糖（100g/150mL)。在发酵 开始（Oh)、发酵2化时分别添加0.150g、0.220g OPTIMA細BGeOPTIMA細BG的总剂量为 3.70Kg/MT葡萄糖干固形物，发酵后分析乳酸产量、残糖、发酵液粘度。
[013￡
[0139]结果表明，在乳酸发酵过程中添加额外的OPTIMA甜BG会显著降低发酵液粘度，减 少残余的葡萄糖并提高乳酸的产量。
【主权项】
1. 一种制备发酵产物的方法，所述方法包括： 在发酵液中用发酵微生物发酵原料以制备发酵产物，其中所述发酵包含转糖苷酶，并 且其中所述发酵产物的收率比不含所述转糖苷酶的对照发酵高。2. 根据权利要求1所述的方法，还包括回收所述发酵产物。3. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵产物为赖氨酸、乳酸或谷氨 酸。4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵生物为黄色短杆菌 (Brevibacterium f lavum)、谷氨酉爱棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)10178、谷氨 酉爱棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)10238或鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)〇5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转糖苷酶包含SEQ ID NO: 1或与 SEQ ID N0:180%、85%、90%、95%、98%、99%相同的任何序列。6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转糖苷酶在木霉属中产生。7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原料包含液化淀粉、颗粒状淀粉、 纯葡萄糖、纯蔗糖或糖浆。8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括减少所述发酵液中的泡沫和/或降 低所述发酵液的粘度。9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TrTG以lKg/MT至6Kg/MT、2Kg/MT 至 5Kg/MT 或 2Kg/MT 至 4Kg/MT 存在。10. -种筛选发酵益处以识别有益的转糖苷酶的方法，所述方法包括： 在发酵液中用发酵微生物发酵原料以制备发酵产物，其中所述发酵包含转糖苷酶，并 且其中所述发酵产物的收率比不含所述转糖苷酶的对照发酵高； 以及由此识别所述有益的转糖苷酶。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述发酵产物为赖氨酸、乳酸或谷氨酸。12. -种筛选发酵益处以识别有益的转糖苷酶的方法，所述方法包括： 在发酵液中用发酵微生物发酵原料以制备发酵产物，其中所述发酵包含转糖苷酶，并 且其中与不含所述转糖苷酶的对照反应相比，所述发酵的所述发酵液中包括减少所述发酵 液中的泡沫和/或降低所述发酵液的粘度； 以及由此识别所述有益的转糖苷酶。13. -种制备赖氨酸的方法，所述方法包括： 在发酵液中用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵原料以制备赖氨酸，其中所 述发酵包含TrTG，其中所述赖氨酸的收率比不含所述TrTG的对照发酵高，并且其中所述发 酵液的粘度与不含所述TrTG的对照发酵相比降低。14. 一种制备赖氨酸的方法，所述方法包括： 在发酵液中用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵原料以制备赖氨酸，其中所 述发酵包含黑曲霉(A.Niger)TG，其中所述赖氨酸的收率比不含所述黑曲霉(A.Niger)TG的 对照发酵高。15. -种制备赖氨酸的方法，所述方法包括： 在发酵液中用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵原料以制备赖氨酸，其中所 述发酵包含转葡糖苷酶，其中所述赖氨酸的收率比不含所述转葡糖苷酶的对照发酵高。16. 根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述原料包含纯葡萄糖或糖浆。17. -种制备赖氨酸的方法，所述方法包括： 在发酵液中用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵原料以制备赖氨酸，其中所 述发酵包含β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体，其中所述赖氨酸的收率比不含所述β 葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵高。18. 根据权利要求13至17中任一项所述的方法，还包括减少泡沫和/或降低粘度。19. 一种制备谷氨酸的方法，所述方法包括： 在发酵液中用谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)SP 10238发酵原料以 制备谷氨酸，其中所述发酵包含TrTG，其中所述发酵液的粘度与不含所述TrTG的对照发酵 相比降低，并且其中所述发酵液中的泡沫与不含所述TrTG的对照发酵相比减少。20. -种制备谷氨酸的方法，所述方法包括： 在发酵液中用谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)SP 10238发酵原料以 制备谷氨酸，其中所述发酵包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和木聚糖酶，其 中所述发酵液的粘度与不含所述外切葡聚糖酶、所述内切葡聚糖酶、所述葡糖苷酶和所 述木聚糖酶的对照发酵相比降低，并且其中所述发酵液的粘度与不含所述外切葡聚糖酶、 所述内切葡聚糖酶、所述葡糖苷酶和所述木聚糖酶的对照发酵相比降低。21. -种制备乳酸的方法，所述方法包括： 在发酵液中用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)发酵原料以制备乳酸，其中 所述发酵包含TrTG，其中所述乳酸的收率比不含所述TrTG的对照发酵高，并且其中所述发 酵液的粘度与不含所述TrTG的对照发酵相比降低。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述原料包含纯葡萄糖或糖浆。23. -种制备乳酸的方法，所述方法包括： 在发酵液中用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)发酵原料以制备乳酸，其中 所述发酵包含β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体，其中所述乳酸的收率比不含所述β 葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵高，并且其中所述发酵液的粘度与不含 所述β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵相比降低。24. 转糖苷酶在发酵中用于提高发酵微生物所产生的发酵产物的收率的用途。25. 根据权利要求24所述的用途，其中所述转糖苷酶为TrTG或与TrTG98 %相同的酶。26. 根据权利要求24或25所述的用途，其中所述发酵制备选自赖氨酸、柠檬酸或谷氨酸 的发酵产物。27. 根据权利要求24至26中任一项所述的用途，其中所述发酵微生物选自谷氨酸棒状 杆菌（Corynebacterium glutamicum)SP 10238、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)、黄色短杆菌(Brevibacterium f lavum)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)10178。28. 转糖苷酶在发酵中用于降低由于发酵微生物的发酵液的粘度的用途。29. 根据权利要求28所述的用途，其中所述转糖苷酶为TrTG或与TrTG98 %相同的酶。30. 根据权利要求28或29所述的用途，其中所述发酵制备选自赖氨酸、柠檬酸或谷氨酸 的发酵产物。31. 根据权利要求28至30中任一项所述的用途，其中所述发酵微生物选自谷氨酸棒状 杆菌（Corynebacterium glut amicum)SP 10238、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)10178〇32. 转糖苷酶在发酵中用于减少由于发酵微生物的发酵液的发泡的用途。33. 根据权利要求32所述的用途，其中所述转糖苷酶为TrTG或与TrTG98%相同的酶。34. 根据权利要求32或33所述的用途，其中所述发酵制备选自赖氨酸、柠檬酸或谷氨酸 的发酵产物。35. 根据权利要求32至34中任一项所述的用途，其中所述发酵微生物选自谷氨酸棒状 杆菌（Corynebacterium glutamicum )SP 10238、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)10178〇
【文档编号】C12P13/14GK105874076SQ201480070110
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年10月21日
【发明人】段钢, J·K·谢提, 王欣, 许宏贤, 张晓萍, 周鹏
【申请人】丹尼斯科美国公司