一种蚯蚓多肽、其编码序列及其应用

一种蚯蚓多肽、其编码序列及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种蚯蚓多肽、其编码序列及其应用。揭示了一种来源于蚯蚓的新的多肽，编码该多肽的多核苷酸，该多肽具有抗肿瘤的功能。
【专利说明】
一种蚯蚓多肽、其编码序列及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和医学领域：更具体地，本发明涉及分离自蚯蚓的一种具有 抗肿瘤功能的多肽，编码该多肽的多核苷酸，以及该多肽的应用。
【背景技术】
[0002] 蚯蚓俗称曲蟮，中药称地龙，地龙性寒味咸，具有清热、平肝、止喘、降压、抑菌及活 血化瘀等功效，已广泛应用于中医中药中治疗多种疾病，如高热狂燥，惊风抽搐，风热头痛， 目赤、半身不遂等。到了上世纪80年代，又陆续报道蚯蚓抽提物对多种癌细胞具有抑制作 用，并在初步临床应用中取得了一定的抑癌效果（第四军医大学学报，1986,7(2) :85;中国 肿瘤临床，1991,18(2) :131 ;生物化学与生物物理学报，2002,34(5) :576;肿瘤医学杂志， 2007,12(1) :16;江苏医药，2008,34(4) :383)。
[0003] 在中国专利ZL200510112490. 5中，揭示了一种分离自威廉腔环蚓广谱抑制癌细 胞生长的蚯蚓蛋白，命名为"EFE6蛋白"。
[0004] 但是，蚯蚓中是否还有对于抑癌有效的成份及其作用机理目前仍然知之甚少，本 领域有必要进行进一步的研究探索，找到其它有效成分。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种蚯蚓多肽、其编码序列及其应用。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：
[0007] (a)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽；或
[0008] (b)将SEQ ID N0:2氨基酸序列经过一个或多个（如1-30个，更佳地1-20个，更 佳地1-10个，更佳地1-5个或1-3个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗 肿瘤功能的由（a)衍生的多肽；
[0009] (c)与SEQ ID N0:2氨基酸序列具有80 %以上（较佳地90 %以上；更佳地95 %以 上；更佳地98%以上或99%以上）的序列相同性的，且具有抗肿瘤功能的多肽；
[0010] (d)SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽的片段，其具有抗肿瘤功能；或
[0011] (e)在（a)多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列构成的 多肽。
[0012] 在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码所述的多肽。
[0013] 在一个优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
[0015] 在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。
[0016] 在一个优选例中，所述的宿主细胞不是可繁殖为动植物的细胞。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种制备所述多肽的方法，该方法包含：
[0018] (1)培养所述的宿主细胞；
[0019] ⑵从培养物中分离出所述的多肽。
[0020] 在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，所述的多肽用于制备抑制肿瘤的 药物。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种用于制备抑制肿瘤的药物组合物，它含有所述的 多肽（较佳地，该多肽在药物组合物中为安全有效量的）以及药学上可接受的载体。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种用于制备抑制肿瘤的药盒，所述药盒中包含所述 的药物组合物。
[0023] 在本发明的另一方面，提供一种能与所述的多肽特异性结合的抗体。
[0024] 在本发明的另一方面，提供一种抑制肿瘤的方法，所述方法包括：给予肿瘤患者有 效量的所述的多肽，或给予肿瘤患者所述的药物组合物。
[0025] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0026] 图1、蚯蚓抑癌蛋白质在HPLC中的层析图谱。其中，星号所示的峰为感兴趣的抗肿 瘤多肽组分的峰。
[0027] 图2、从蚯蚓中分离的抑制肿瘤细胞的蛋白质的SDS-PAGE图谱。其中，泳道1为标 准分子量蛋白Marker，泳道2、3为上样量不同的抗肿瘤多肽。
[0028] 图3、蚯蚓抗肿瘤多肽的质谱鉴定结果。
[0029] 图4、蚯蝴抗肿瘤多肽的N-端测序结果。
[0030] 图5、蚯蚓抗肿瘤多肽PCR扩增产物的电泳条带。其中，泳道1为DNA标准，泳道 2、3为PCR扩增产物的电泳结果。
[0031] 图6、蚯蚓抗肿瘤多肽的基因序列及其编码的蛋白质序列。
[0032] 图7、蚯蝴抗肿瘤多肽对多种癌细胞生长的抑制作用。
【具体实施方式】
[0033] 本发明人致力于抗肿瘤功能性多肽的研究，经过广泛而深入的研究，揭示了一种 来源于蚯蚓的新的多肽，该多肽具有抗肿瘤的功能以及水解纤维蛋白的功能。
[0034] 本发明人首先从赤子爱胜蝴（Eisenia foetida)抽提物中分离到一种分子量为 24663. 0道尔顿的抑制肿瘤细胞生长的多肽，测定了该多肽N端的一端氨基酸序列为见12-V-I-G-G-T-D-A-A-P-G-E-F-P-W-Q-L-(SEQ ID N0 :3)，并以此为依据合成了相应的简并引 物。然后，利用新鲜的活体赤子爱胜蚓分离抽提总RNA，以此RNA为模板经反转录获得cDNA， 用PCR法扩增和克隆了蚯蚓抗肿瘤多肽的基因，然后将蚯蚓抗肿瘤多肽的编码序列插入到 T载体并转入到合适的宿主细胞中进行扩增，进而测定了该多肽的基因的全序列，翻译得到 该抗肿瘤多肽完整的氨基酸序列。
[0035] 如本文所用，"分离的"是指物质从原始环境中分离出来（如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其它物质分开，则为分离纯化的。
[0036] 如本文所用，"分离的多肽（或蛋白）"是指所述多肽基本上不含天然与其相关的 其它蛋白质、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该 蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。多肽的纯度能用于 氨基酸序列分析。
[0037] 如本文所用，所述的"抗肿瘤多肽"与"抑癌多肽"可互换使用；所述的"抗肿瘤功 能"与"抑癌功能"可互换使用。
[0038] 本发明还包括所述的抗肿瘤多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片 段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的来源于蚯蚓的天然抗肿瘤多肽相同的 生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个 保守或非保守行氨基酸残基（优先保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨 基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有 取代基团的多肽，或（iii)成熟多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，如聚 乙二醇）融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽 (如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白质原序列）。根据本文的教导，这 些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0039] 在本发明中，术语"抗肿瘤多肽"指具有抑癌活性的SEQ ID N0:2序列的多肽。该 术语还包括具有与所述的抗肿瘤多肽相同功能的、SEQ ID N0:2序列的变异形式。这些变 异形式包括（但并不限于）：一个或多个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个， 最佳地1-10个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失 一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如， 在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽的功能。又比如， 在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术 语还包括了所述的抗肿瘤多肽的活性片段和/或活性衍生物。
[0040] 该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导 突变体、在高或低的严紧度条件下能与所述抗肿瘤多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质、 以及利用抗所述抗肿瘤多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0041] 发明还提供了所述的抗肿瘤多肽的类似物。这些类似物与分离自蚯蚓的天然抗肿 瘤多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或 者兼而有之。这些多肽包括天然的遗传变异体。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸 的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ -氨 基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性多肽。
[0042] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工过程中或进一步加工步骤 中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺 乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷 酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸）的序列，还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能 或优化了溶解性能的多肽。
[0043] 在本发明中，"抗肿瘤多肽的保守性变异多肽"是指与SEQ ID Ν0:2的氨基酸序列 相比,有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似 或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换 而产生。
[0044] 表 1
[0045]
[0046]
[0047] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。其中DNA形式包括cDNA、基因组 DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的，可以是编码链或非编码链。编码成 熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO: 1所示的编码区序列相同或是简并的变异体。如 本文所用，"兼并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQ ID N0:2的蛋白质，但是与SEQ ID NO: 1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
[0048] 编码SEQ ID N0:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成 熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列（和任选的附加编码序列） 以及非编码序列。
[0049] 术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括 附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0050] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非 天然发生的变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一 个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0051] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多 核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指：（1)在较低离子强度和较高温度 下杂交和洗脱，如〇. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或（2)杂交时加有变性剂，如50% (v/v)甲酰 胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或（3)仅在两条序列之间的相同性至少在90% 以上，更好使95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID N0:2 所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
[0052] 本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的长度至 少含15个核苷酸，较好的至少30个核苷酸，更好的至少50个核苷酸，最好是至少100个核 苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术（PCR)以确定和/或分离编码所述的抗肿瘤多 肽的多聚核苷酸。
[0053] 本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
[0054] 本发明的多核苷酸的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合 成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放读 码框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩 增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0055] -旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0056] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化 学合成来得到编码本发明的多肽（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然后可将该DNA 序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞中。此外，还可通过化 学合成将突变引入本发明的多肽序列中。
[0057] 应用 PCR 技术扩增 DNA/RNA 的方法（Saiki 等，Science 1985 ;230 :1350-1354)被 优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE 法（RACE-cDNA末端快速扩增法），用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息 适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/ RNA片段。
[0058] 利用本发明的抗肿瘤多肽，通过各种常规筛选方法，可筛选出与所述的抗肿瘤多 肽发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
[0059] 本发明的抗肿瘤多肽及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进 行施用（给药）时，可提供不同的效果。尤其是，本发明的抗肿瘤多肽可用于抑制肿瘤或肿 瘤细胞（体内或体外）的生长。
[0060] 所述的肿瘤可以为各种良性或恶性肿瘤，如黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺 癌、肺癌、脑肿瘤、卵巢癌、骨肿瘤、结肠、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、小肠肿瘤、肾肿瘤、肾上腺 肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤等。例如，肿瘤例子包 括但并不限于：各种实体肿瘤，如肺癌、肝癌、胃癌、肠癌。
[0061] 通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其 中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的 病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限 于）：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
[0062] 本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于抗肿瘤治疗。在使用本发明所述的 抗肿瘤多肽时，还可同时使用其他治疗剂，如紫杉醇等。
[0063] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的多肽以及药学上 可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙 醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式， 例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶 囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜 在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约 5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0064] 使用药物组合物时，是将安全有效量的所述的抗肿瘤多肽施用于哺乳动物，其中 该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/20千 克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还 应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0065] 所述的抗肿瘤多肽的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。多种表达载体，也包括 来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒 等，可用于将编码本发明的抗肿瘤多肽的多核苷酸转移至细胞内。构建携带该多核苷酸的 重组病毒载体的方法是本领域已知的。
[0066] 能与所述的抗肿瘤多肽结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结 合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对所述的抗肿瘤多肽分子进行标记。 [0067] 本发明的多肽可为治疗癌症相关疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前 旦 -5^0
[0068] 本发明的主要优点在于：
[0069] 从繁杂的蚯蚓抽提物中纯化到单一纯度的抗肿瘤多肽，此抗肿瘤多肽对培养的正 常细胞是无毒或低毒的。本发明不仅为开发研究蚯蚓抗肿瘤多肽的基因工程产品创造了良 好的条件，也为开发蚯蚓抗肿瘤多肽针剂应用于临床治疗肿瘤疾病提供了必要的化学结构 资料，因而具有巨大的应用前景。
[0070] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0071] 实施例1、从蚯蚓中分离纯化天然的抑癌蛋白质
[0072] 本发明人主要采用了赤子爱胜蚓进行抽提并分离纯化，以获得具有抑癌活性的组 份。
[0073] 首先制备粗的蚯蚓粉，取鲜活蚯蚓若干，洗净后经机械捣碎，加入冰冷的丙酮（或 乙醇）脱水，所得沉淀晾干，即为粗蚯蚓粉，储藏_20°C冰箱中备用。
[0074] 取粗蚯蚓粉若干，加两倍体积的水浸泡过夜，次日以5000rmp冷冻离心，收集上清 液并装入透析袋对水透析24小时，再以5000rmp冷冻离心，上清液经冷冻干燥成冻干粉，纯 化时取冻干粉少许以缓冲液溶解，然后经离子交换和凝胶过滤层析分离，得到了一组抑癌 蛋白质组份。
[0075] 本发明人对获得的抑癌蛋白质组分进行了 HPLC分析，得到单一的抗肿瘤多肽组 分见图1。具体地，依据下列两种鉴定方法确定为单一组份。
[0076] 本发明人对获得的抗肿瘤多肽组分进行了 SDS-PAGE分析为单一条带，见图2。
[0077] 本发明人对获得的抗肿瘤多肽组分进行了质谱鉴定，结果显示该样品为24663. 0 道尔顿的单一组分，见图3。
[0078] 实施例2、蚯蚓抗肿瘤多肽N-端20个氨基酸序列测定
[0079] 纯化的蚯蚓抗肿瘤多肽样品在PE491蛋白质测序仪上经过20个循环，测得的 N-端氨基酸序列为VIGGTDAAPGEFPWQL_T_(SEQIDN0:3)，见图4。
[0080] 实施例3、引物的设计和合成
[0081] 根据实施例2测得的蚯蚓抗肿瘤多肽的N-端序列，设计两条上游寡核苷酸兼并引 物为：
[0082] 5 ' -GT (T/C/A/G) AT (T/C/A) GG (T/C/A/G) GG (T/C/A/G) AC (T/C/A/G) GA (T/C) GC-3'（SEQ ID N0:4)和 5'-CC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GA(A/G)TT(T/C/)CC(T/C/A/G) TGGCA(A/G)-3'（SEQ ID N0:5)(括号内为兼并核苷酸），由于缺乏蚯蚓抗肿瘤多肽的C-端 氨基酸序列信息，下游引物选用TaKaRa3' -RACE试剂盒里的通用引物，引物合成委托上海 钼尚生物技术有限公司完成。
[0083] 实施例4、总RNA的提取
[0084] 取新鲜的活体蚯蚓1-2条，在液氮中研磨成粉，加 2ml Trizol试剂，将研磨成粉 状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 将匀浆转移至离心管内，室温静置5分钟，12000g 4°C离心5分钟，上清液吸入新的离心管 (切勿吸取沉淀）。向上清液中加入〇. 2ml氯仿，充分振荡至乳化溶液呈乳白状后，再室温 静置5分钟，然后12000g 4°C离心15分钟，将上清液转移至另一新的离心管中，向其中加入 等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10分钟，12000g 4°C离心10 分钟，小心弃去上清，收集沉淀。缓慢沿离心管壁加入lml 75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离 心管管壁，12000g 4°C离心5分钟后小心弃去乙醇，敞口于空气中干燥5-10分钟，使乙醇充 分挥发，加入50 μ 1 DEPC水溶解，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0085] 实施例5、巢式PCR扩增蚯蝴抗肿瘤多肽基因
[0086] 以实施例4中制得的蚯蚓总RNA为模板，利用TaKaRa公司的3'_RACE试剂盒进行 反转录，按试剂盒中的操作说明书进行。
[0087] 使用实施例3中的合成引物，以上述所得cDNA为模板，进行外围PCR扩增，总反应 体系 20μ 1，其中模板 1μ 1，上游引物（SEQ ID N0 :4)1μ 1(10μΜ/μ l)，TaKaRa3'-RACE 试 剂盒提供的下游引物（1〇μΜ/μ 1)1μ 1，高保真酶 0. 25μ 1(5ιι/μ 1)，dNTP(2. 5ιηΜ)1μ 1，反 应条件是先94°C变性3分钟，然后进入循环，94°C 30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分钟， 进行25个循环，最后72°C保温lOmin，得到的PCR产物作为下轮PCR的模板。
[0088] 取外围PCR产物1μ 1作为模板进行内围PCR扩增，总反应体系5〇μ 1，上游引 物（SEQ ID NO :5) 2 μ 1 (10 μ Μ/ μ 1)，TaKaRa3' -RACE 试剂盒提供的下游引物（10 μ Μ/ μ 1) 2 μ 1，高保真酶0. 5 μ 1 (5u/ μ 1)，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，反应条件与前者完全相同，取PCR 产物进行1%琼脂糖电泳检查，扩增出一条约l〇〇〇bp的DNA片段，见图5。
[0089] PCR扩增产物电泳后用天根公司胶回收试剂盒回收，溶于50μ 1的灭菌水 中，-20°C保存备用。
[0090] 实施例6、蚯蝴抗肿瘤多肽的基因克隆
[0091] 取PCR产物电泳条带的回收产物3μ 1与T-载体1 μ 1连接，转化，经蓝白斑筛选， 酶切和PCR鉴定，获得阳性克隆。
[0092] 实施例7、蚯蝴抗肿瘤多肽的基因的鉴定
[0093] 实施例6中获得的阳性克隆上海钼尚生物技术有限公司测定，基因全序列和编码 的蛋白质序列见SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:2,或见图6。该成熟蛋白的cDNA具有714个 核苷酸（SEQ ID NO: 1中第1-714位（不含起始密码子和终止密码子）），即238个氨基酸。 经电脑软件分析该蛋白质的分子量为24663道尔顿，等电点为4. 19。
[0094] 实施例8、蚯蝴抗肿瘤多肽对多种培养的肿瘤细胞的抑制作用
[0095] 在本实施例中，分别选用了下列几种常规的肿瘤细胞进行抑制试验：95_D (人肺 癌细胞），PLC/PRF/5 (人肝癌细胞），HCT-8 (人肠癌细胞），N-87 (人胃癌细胞）。上述肿瘤 细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
[0096] 各种细胞分为对照组和测试组，测试组中给予上述蚯蚓抗肿瘤多肽（SEQ ID N0:2)处理，终浓度为50μ g/ml。给药24小时，48小时和72小时后，与对照组细胞相比。
[0097] 结果如图7,发现加入蚯蚓抗肿瘤多肽的测试组中肿瘤细胞生长均发生明显抑制， 可见蚯蚓抗肿瘤多肽有明显的抗肿瘤效果。
[0098] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组： (a) 具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或 (b) 将SEQ ID N0:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的，且具有抗肿瘤功能的由（a)衍生的多肽； (c) 与SEQ ID N0:2氨基酸序列具有80%以上的序列相同性的，且具有抗肿瘤功能的 多肽； (d) SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽的片段，其具有抗肿瘤功能；或 (e) 在（a)多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列构成的多 肽。2. -种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码权利要求1所述多肽。3. 如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQ ID NO: 1所示的核 苷酸序列。4. 一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。5. -种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体。6. -种制备权利要求1所述多肽的方法，其特征在于，该方法包含： (1) 培养权利要求5所述的宿主细胞； (2) 从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。7. 权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，所述的多肽用于制备抑制肿瘤的药物。8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括：肺癌，肝癌，肠癌，胃癌。9. 一种用于制备抑制肿瘤的药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的多肽 以及药学上可接受的载体。10. -种用于制备抑制肿瘤的药盒，其特征在于，所述药盒中包含权利要求8所述的药 物组合物。
【文档编号】C07K14/435GK105884876SQ201510039295
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月26日
【发明人】季军捷, 徐少琼, 李振, 朱洪, 张勇, 郑翠玲, 单辉, 刘小龙, 周海洋, 周元聪, 戚正武
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院, 济宁华能制药厂有限公司