Peg修饰的多粘菌素及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种如下式I所示的PEG修饰的多粘菌素或其药用盐及其制备方法和用途，所述PEG修饰的多粘菌素通过共价键将PEG分子连接到多粘菌素上，形成稳定的化合物，PEG修饰后的多粘菌素分子量成倍增加，半衰期延长，实现了增强疗效、降低毒性的目的。
【专利说明】
PEG修饰的多粘菌素及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于抗菌药物领域，具体涉及一种PEG修饰的多粘菌素及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 细菌感染曾经是人类健康的第一杀手，全球每年死于细菌感染的患者约两百万。 尤其是近年来随着广谱抗生素的滥用，许多革兰氏阴性菌（尤其是铜绿假单胞菌、鲍曼不 动杆菌、大肠杆菌和克雷伯杆菌等）表现出超强的耐药性，一般的抗生素很难将其杀灭。耐 药菌引发的感染已成为临床上亟待解决的难题，但目前临床上却缺乏能有效治疗耐药菌感 染的新型抗生素。最近发现的一种广泛传播的可以释放内酰胺酶的肠杆菌科菌株几乎 对所有的抗生素皆存在耐药性，后续研究发现多粘菌素类药物对该菌株具有较强的杀伤作 用。
[0003] 多粘菌素（polymyxin)是从多粘杆菌培养液中获得的一种多肽类抗生素，包括5 种不同的类型（多粘菌素 A、B、C、D和E)，目前仅多粘菌素 B(PMB)和多粘菌素 E(PME)用于 临床。多粘菌素具有表面活性，含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性杆菌细胞膜的磷 脂中的带阴电荷的磷酸根结合，使细菌细胞膜面积扩大，通透性增加，细胞内的磷酸盐、核 苷酸等成份外漏.导致细菌死亡。且多粘菌素对生长繁殖期和静止期的细菌都有效，与其 他类抗菌药物之间尚未发现交叉耐药性。20世纪60至70年代，多粘菌素曾广泛用于治疗 革兰氏阴性菌所致的全身多位点感染，然而，因为其较严重的肾毒性和神经毒性被弃用。近 年，由于多耐药性革兰氏阴性菌感染广泛流行，多粘菌素类药物作为治疗的最后选择又被 应用于临床。
[0004] 目前上市的多粘菌素类药物主要是多粘菌素 E甲磺酸钠（CMS)、多粘菌素 B注射剂 等。CMS既可用于雾化治疗囊性纤维化患者的肺部感染，也可用于肌注和静脉滴注。多粘菌 素 B注射剂目前仅在美国等少数几个国家继续使用，国内目前尚无此类药物上市。限制多 粘菌素类药物应用的主要原因有：多粘菌素类药物半衰期短（多在6小时以内），需要多次 给药才能达到稳定治疗的目的，患者的顺应性很低，增加了给药风险和治疗成本；同时，多 粘菌素类药物均具有比较严重的毒副作用（如肾毒性、血管刺激性、神经毒性等），曾经有2 组来源于I⑶病房的治疗报道显示，分别给予9. 0xl07IU/dCMS注射治疗后，肾毒性发生的 概率高达18. 6%和14. 3%。肾毒性作用主要表现为血肌酐水平上升、尿肌酐清除率下降、 血尿、蛋白尿、管型尿或者少尿的发生。肾毒性被认为呈剂量依赖性，严重限制了该类药物 的临床使用。
[0005] 因此，临床上迫切需求一种高效低毒的多粘菌素类药物。
【发明内容】
[0006] 针对上述技术问题，本发明人经过长期研究发现：通过共价键将大分子的PEG连 接到多粘菌素上，形成稳定的化合物，PEG化的多粘菌素分子量成倍增加，半衰期延长，稳定 性提高，最终达到增强疗效降低毒性的目的。
[0007] 本发明的一个目的是提供一种高效低毒的PEG修饰的多粘菌素。
[0008] 本发明的另一个目的是提供上述PEG修饰的多粘菌素的制备方法。
[0009] 本发明的还一个目的是提供上述PEG修饰的多粘菌素的用途。
[0010] 具体地说，本发明采用如下技术方案：
[0011] -方面，本发明提供一种PEG修饰的多粘菌素，所述PEG修饰的多粘菌素是通过共 价键将PEG分子连接到多粘菌素上的活泼氨基上形成，其中，所述PEG分子的重均分子量为 1000至10000 ;所述多粘菌素可以是多粘菌素 A、多粘菌素 B、多粘菌素 C、多粘菌素 D或多 粘菌素 E。
[0012] 具体地，本发明提供一种如下式I所示的PEG修饰的多粘菌素（polymyxin)或其 药用盐，PEG修饰的多粘菌素以下也称为PEG-多粘菌素或者PEG-polymyxin :
[0013]
[0014] 其中，
[0015] 各馬是!1或
且各馬不同时为H，其中，R是直链或 支链烷基，也就是说，与1-5号位氨基相连的馬中至少有一个是
[0016] η < 160,1 < m < 5,且 n、m 均为正整数；
[0017] &是C。直链或支链烷基，优选地，R丨是
[0018] X是苯丙氨酸或亮氨酸。
[0019] 优选地，本发明中所述多粘菌素可以是多粘菌素 A、多粘菌素 B、多粘菌素 C、多粘 菌素 D或多粘菌素 E。
[0020] 更优选地，所述多粘菌素可以是多粘菌素 E或多粘菌素 B;当X =苯丙氨酸且
，式I所示结构为PEG-多粘菌素 B ;当X =亮氨酸时，式I所 示结构为PEG-多粘菌素 E，其中，因式I中&不同，多粘菌素 E又可分为E1和E2 :当
，式I所示结构为PEG-多粘菌素 E1 ;
式I所 示结构为PEG-多粘菌素 E2 ;
[0021] 本发明中，在所述PEG修饰的多粘菌素中，PEG修饰位点可以为式I中的1-5号 位的氨基中任意一个或多个，优选的位点为1和/或4号位上的活泼氨基。也就是说，在 所述PEG修饰的多粘菌素中，式I中与1-5号位的氨基中任意一个或多个相连接的私为
优选地，与式I中的1和/或4号位氨基连接的私为
[0022] 本发明中，如上所述，
η < 160,且η为正整数；优 选地，上式I所示的R2部分（即PEG部分）（mw)彡10k ;更优选地，PEG部分为PEG1000、 PEG2000、PEG3000、PEG5000 和 / 或 PEG6000 等，最优选地，PEG 为 PEG2000 和 / 或 PEG5000。
[0023] 更优选地，本发明的式I所示的PEG修饰的多粘菌素具有如下结构：
[0025]或
[0027] 其中，η的定义与上述式I中的定义相同。
[0028] 另一方面，本发明还提供所述PEG修饰的多粘菌素的制备方法。本发明所述的PEG 修饰的多粘菌素是通过置换反应，使用具有活性的PEG分子
（以下
也称为活性PEG分子） 连接到多粘菌素上实现的，具体反 应路线如下：
[0029]
[0030] 在以上反应路线中，R、Rp R2、m、η、X的定义与上述式I中的定义相同，优选地，m =1 ;M为置换反应活性基团，Μ的范围没有特别的限制，
后形成活性PEG分子，能够实现上述置换反应即可，优选地，Μ为
[0031] 本发明中，优选地，所述活性PEG分子中的PEG部分（丽）< 10k ;更优选地，所述 PEG 部分为 PEG1000、PEG2000、PEG3000、PEG5000 和 / 或 PEG6000 等，最优选地，所述 PEG 部 分为 PEG2000 和 / 或 PEG5000。
[0032] 所述具有活性的PEG分子
只要能够实现上述置换反 应即可，没有特殊的限定；优选地，可以为如下结构：
[0033]
[0036] 其中，在以上反应路线中，RpiuX的定义与上述式I中的定义相同。
[0037] 另一方面，本发明还提供所述PEG修饰的多粘菌素在制备用于治疗由革兰氏阴性 菌引发的感染的药物中的用途。
[0038] 本发明中，所述由革兰氏阴性菌引发的感染，包括，但不限于，败血症；尿路感染； 肺部感染；以及皮肤、眼、鼻旁窦、耳等局部感染；以及脑膜炎；心内膜炎；烧伤后感染等。
[0039] 本发明中，所述革兰氏阴性菌包括，但不限于，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)、绿胺杆菌（Bacterium pyocyaneum)、大肠杆菌（Escherichia coli)和克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae)等。
[0040] 本发明涉及的PEG修饰的多粘菌素尤其适用于由绿脓杆菌、大肠杆菌引起的感 染，以及选自以上所述的多种耐药菌株引起的感染。
[0041] 有益效果
[0042] 一方面，多粘菌素与大分子的PEG结合后形成PEG修饰的多粘菌素，由于PEG包裹 可延长药物在体内的循环半衰期和在血浆中的停留时间，提高药物的抗菌疗效；另一方面， PEG修饰的多粘菌素的分子量可减少单位时间内药物经肾脏的过滤，降低对肾脏的毒性作 用。
【附图说明】
[0043] 图1 :显示实施例1所得到的PEG2000-多粘菌素 E的核磁图谱；
[0044] 图2 :显示在实施例3的体外抗菌实验中，在相同浓度的多粘菌素 E或PEG2000-多 粘菌素 E条件下细菌（大肠杆菌）的生长曲线；
[0045] 图3 :显示在实施例4的体外抗菌实验中，在相同浓度的多粘菌素 B或PEG1000-多 粘菌素 B条件下细菌（大肠杆菌）的生长曲线；
[0046] 图4 :显示在实施例5中，多粘菌素 E或PEG2000-多粘菌素 E按15mg/kg给药后 大鼠的血药浓度曲线；
[0047] 图5 :显示在实施例6中感染细菌的昆明小鼠给药治疗后，白细胞波动情况；
[0048] 图6 :显示在实施例7中小鼠肾组织切片结果。
【具体实施方式】
[0049] 下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规 条件或者按照各制造商所建议的条件。
[0050] 多粘菌素 E原料药（polymyxin E，上海新亚药业有限公司）；甲氧基聚乙二 醇2000 (江苏海安石油化工厂）；Ν, Ν' -二琥?自酰亚胺碳酸酯（N, Ν' -Disuccinimidyl 〇31"13〇1^七6,03〇、4-二甲氨基吡啶（0麻?)、异丙醇、甲醇、乙醚、氯化钠（国药集团化学试剂 有限公司），均为分析纯；胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉（美国sigma);大肠杆菌（ATCC); 电子天平（德国Sartorius公司）；真空干燥箱（上海益恒实验仪器有限公司）；磁力搅拌 器、旋转蒸发仪、超净台、恒温摇床（德国IKA);紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限 责任公司）；全自动血样分析仪（德国Siemens);焚光倒置显微镜（德国Leica)
[0051] 实施例1 :甲氧基聚乙二醇2000修饰的多粘菌素 E
[0052] 将0. 9mM甲氧基聚乙二醇2000置于圆底烧瓶中，加入适量乙腈开启搅拌使其 溶解。圆底烧瓶中加入1.8mM N，N'_二琥珀酰亚胺基碳酸酯和适量催化剂4-二甲氨 基吡啶，体系搅拌过夜。反应完成后，加入适量乙醚使琥珀酰亚胺碳酸酯基聚乙二醇 2000 (PEG2000-SC)沉淀析出，抽滤得粗产物。将粗产物溶于适量异丙醇中，重结晶3次，抽 滤，真空干燥箱中干燥即得中间产物PEG2000-SC。按物质的量之比多粘菌素：PEG2000-SC =3:1称取制备的多粘菌素 E溶于4mL pH 9. 5的PBS中，将制得的PEG2000-SC投入体系 中，搅拌过夜。反应结束后，加入适量二氯甲烷萃取，静置分层收集有机层，吹干即得产物甲 氧基聚乙二醇2000修饰的多粘菌素 E(PEG2000-多粘菌素 E)，对上述终产物的结构进行核 磁验证，所得PEG2000-多粘菌素 E的核磁图谱见图1。
[0053] 实施例2 :甲氧基聚乙二醇1000修饰的多粘菌素 B
[0054] 将0.9mM甲氧基聚乙二醇1000置于圆底烧瓶中，加入适量乙腈开启搅拌使其 溶解。圆底烧瓶中加入1.8mM N，N'_二琥珀酰亚胺基碳酸酯和适量催化剂4-二甲氨 基吡啶，体系搅拌过夜。反应完成后，加入适量乙醚使琥珀酰亚胺碳酸酯基聚乙二醇 1000 (PEG1000-SC)沉淀析出，抽滤得粗产物。将粗产物溶于适量异丙醇中，重结晶3次，抽 滤，真空干燥箱中干燥即得中间产物PEG1000-SC。按物质的量之比多粘菌素：PEG1000-SC =3:1称取制备的多粘菌素 B溶于4mL pH 9. 5的PBS中，将制得的PEG1000-SC投入体系 中，搅拌过夜。反应结束后，加入适量二氯甲烷萃取，静置分层收集有机层，吹干即得产物甲 氧基聚乙二醇1000修饰的多粘菌素 B (PEG1000-多粘菌素 B)。
[0055] 实施例3 :实施例1获得的PEG2000-多粘菌素 E的体外抗菌实验
[0056] 取冻存的大肠杆菌复苏后，置于摇床上增殖培养，取处于对数期的菌液进行体 外抗菌实验。分别用生理盐水配制浓度为20 μ g/mL的多粘菌素 E和PEG2000-多粘菌 素 E制剂，对照组给予等体积的生理盐水，以等量的菌液共孵育，分别于0h、2h、4h、6h、8h、 10h、22h、24h时，600nm波长下测定光密度（0D)值。实验测量结果如图2所示，结果表明： PEG2000修饰的多粘菌素 E具有良好的体外抗菌活性。
[0057] 实施例4 :实施例2获得的PEG1000-多粘菌素 B的体外抗菌实验
[0058] 按实施例3所用方法进行体外抗菌试验。实验测量结果如图3所示，结果表明： PEG1000修饰的多粘菌素 B具有良好的体外抗菌活性。
[0059] 实施例5 :实施例1获得的PEG2000-多粘菌素 E的药动学研究
[0060] 雄性SD大鼠12只随机分为2组，分别为多粘菌素 E组和PEG2000-多粘菌素 E组。 按15mg/kg给药后，分别于给药后5min、15min、30min、lh、2h、4h、6h、8h、12h分别眼眶取血 150 μ 1，离心后取上清，LC-MS/MS进行血药浓度的测定（测量结果见图4)。结果表明：PEG 修饰的药物PEG2000-多粘菌素 E半衰期延长。
[0061] 实施例6 :实施例1获得的PEG2000-多粘菌素 E的体内药效学研究
[0062] 从琼脂板上挑取大肠杆菌单菌落，接种于无菌LB液体培养基中，置于摇床上过 夜，将过夜培养的菌液重新接种到新鲜配制的LB培养基中，菌液与LB培养基的体积比为 1:100,当细菌生长至对数期（0D_~1)，将菌液移入离心管中，4000转/分钟离心10min， 去上清，收集细菌沉淀，用无菌PBS洗涤吹打细菌沉淀使其悬浮，再4000转/分钟离心 lOmin，去上清，收集细菌沉淀，PBS洗涤2次，然后用无菌生理盐水重悬细菌至0D6。。~1，将 18只昆明小鼠随机分为3组，每组6只，分别为多粘菌素 E组、PEG2000-多粘菌素 E组和对 照组，多粘菌素 E组和PEG2000-多粘菌素 E组腹腔注射0. 4ml大肠杆菌菌液，对照组不做 处理，正常饲养。注射菌液后4h，多粘菌素 E组和PEG2000-多粘菌素 E组开始给药治疗，每 8h 给药一次，每次剂量为 5mg/kg，维持 7 天。分别于 12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h 取血，检测白细胞，记录白细胞波动曲线（见图5)。结果表明：多粘菌素 E组白细胞波动较 大，而PEG2000-多粘菌素 E组白细胞波动相对较小。
[0063] 实施例7:肾毒性考察
[0064] 取实施例6中多粘菌素 E组和PEG2000-多粘菌素 E组连续治疗7天后的小鼠，以 及不做处理、正常饲养的对照组小鼠，〇)2室息处死，取肾组织行病理切片（见图6)。图6中 A为PEG2000-多粘菌素 E组，B为对照组，C为多粘菌素 E组。结果表明：对照组未见明显 损伤；PEG2000-多粘菌素 E组肾小管少许扩张，有少量细胞核突出，肾小管管型结构较少出 现；而多粘菌素 E组，肾小管上皮细胞坏死较多，管型结构大量出现；表明PEG修饰后的药 物（PEG2000-多粘菌素 E)肾毒性降低。
【主权项】
1. 一种PEG修饰的多粘菌素，所述PEG修饰的多粘菌素是通过共价键将PEG分子连接 到多粘菌素上的活泼氨基上形成，其中，所述PEG分子的重均分子量为1000至10000。2. -种如下式I所示的PEG修饰的多粘菌素或其药用盐： 其中，各私是H g且各私不同时为H，其中，R是H或C ^C3直链或支链 烷基，η彡160，1彡m彡5,且n、m均为正整数；R1是C ^C1。直链或支链烷基，优选地，R J X是苯丙氨酸或亮氨酸。3. 根据权利要求1或2所述的PEG修饰的多粘菌素或其药用盐，其中，所述多粘菌素是 多粘菌素 A、多粘菌素 B、多粘菌素 C、多粘菌素 D或多粘菌素 E。4. 根据权利要求2所述的PEG修饰的多粘菌素或其药用盐，其中，X =苯丙氨酸 X =亮氨酸且 X =亮氨酸且5. 根据权利要求2所述的PEG修饰的多粘菌素或其药用盐，其中， 式I中1号和/或4号位氨基上连接的R2:其中，R、m、η的定义与与权利要求2中的定义相同。6. 根据权利要求2所述的PEG修饰的多粘菌素或其药用盐，其中， 式I所示的R2部分（mw)彡IOk ;更优选地，R2部分为PEG1000、PEG2000、PEG3000、 PEG5000 和 / 或 PEG6000 等，最优选地，PEG 为 PEG2000 和 / 或 PEG5000。7. 根据权利要求2所述的PEG修饰的多粘菌素或其药用盐，其中， 式I所示的PEG修饰的多粘菌素具有如下结构：其中，η的定义与与权利要求2中的定义相同。8. 权利要求1-7任一项所述PEG修饰的多粘菌素的制备方法，其中，所述的PEG修 饰的多粘菌素是通过置换反应，使用活性PEG分-I# PEG部分连接到多粘菌素上实现的，具体反应路线如下：在以上反应路线中，R、札、R2、m、n、X的定义与权利要求2中的定义 相同；M为置换反应活性基团，优选地，M)9.根据权利要求8所述的方法，其中，1号位氨基相连接，反应进程如下：其中，Rr η、X的定义与权利要求2中的定义相同。10.根据权利要求1-7任一项所述PEG修饰的多粘菌素或其药用盐在制备用于治疗由 革兰氏阴性菌引发的感染的药物中的用途，其中， 优选地，所述由革兰氏阴性菌引发的感染包括败血症、尿路感染、肺部感染以及皮肤、 眼、鼻旁窦、耳等局部感染，以及脑膜炎、心内膜炎、烧伤后感染；和/或 优选地，所述革兰氏阴性菌包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、鲍曼 不动杆菌（Acinetobacter baumannii)、绿胺杆菌（Bacterium pyocyaneum)、大肠杆菌 (Escherichia coli)和克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae)。
【文档编号】A61P17/00GK105885027SQ201510039481
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月26日
【发明人】甘勇, 张馨欣, 张涛
【申请人】中国科学院上海药物研究所