利用非生物诱导子提高铁皮石斛原球茎中有效物质的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用非生物诱导子提高铁皮石斛原球茎中有效物质的方法。在悬浮培养初期添加水杨酸和茉莉酸甲酯两种诱导子，培养30d发现75μmol水杨酸可显著提高铁皮石斛原球茎内多糖、生物碱及黄酮含量，75μmol茉莉酸甲酯对原球茎内多糖、生物碱、黄酮和总酚含量均有明显的促进作用。通过将几种诱导子进行比较发现，75μmol茉莉酸甲酯最有利于提高原球茎内有效物质含量，铁皮石斛原球茎内多糖、生物碱、黄酮和总酚含量分别提高到323.4mg/g，247.3μg/g，4.0mg/g和4.3mg/g。本发明通过在铁皮石斛原球茎悬浮培养过程中添加诱导子，以期为在短期内提高铁皮石斛原球茎中有效物质含量及大规模生产有效药用成分提供技术参数，同时也为原球茎内有效物质合成机理的研究提供理论依据。
【专利说明】
利用非生物诱导子提高铁皮石斛原球茎中有效物质的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种利用非生物诱导子提高铁皮石斛原球茎中有效物质的方法。
【背景技术】
[0002]铁皮石斛(Dendrobium candidum Kimura et Migo)，又名黑节草，民间称其为“救命仙草”，为兰科石斛属多年生草本植物。作为传统珍贵中药对滋阴清热、生津益胃等有显著功效，又因其富含多糖、生物碱、总酚等生物活性物质而具有免疫调节和抗氧化作用。然而由于铁皮石斛苛刻的生长环境，较低的自然产量以及人们长期的过度采挖，致使野生资源日益减少；铁皮石斛的繁殖方式包括有性繁殖和无性繁殖，有性繁殖过程中因其种子极小且无胚乳，在自然条件下需与真菌共生才能萌发，所以难以生产足够的实生苗应用于栽培；无性繁殖则具有繁殖系数较低，生长周期长等问题，因此，寻找一种可以替代野生及人工栽培铁皮石斛的方式是十分必要的，近年来，植物组织培养已经成为药用植物繁殖及大规模生产其有效成分的主要方式，植物组织培养包括细胞、组织和器官培养。对于药用植物而言在细胞培养过程中存在一定的弊端，药用植物的有效成分主要为具有一定生理活性的次生代谢产物，而次生代谢产物在细胞阶段合成较少，使得有效成分在细胞中的含量不稳定。与此相比较，植物组织和器官培养可以克服这一问题，研究发现培养的植物组织和器官中含有较高含量的次级代谢产物，且次级代谢产物含量稳定。原球茎培养是植物器官培养的一个重要分支，在兰科植物组织培养中，一般用茎尖等外植体诱导产生原球茎进行兰科植物的离体培养。
[0003]原球茎是短缩的、珠粒状的、类似幼茎的器官，实质上是正在生长分化的体细胞胚胎，具有与植株同样的物质代谢和形态发育的潜能，提高并稳定原球茎内多糖、生物碱、黄酮及总酚含量在铁皮石斛原球茎的规模生产、药用价值研究及产品开发中具有重要意义，近年来，利用诱导子进行目标产物调控及生物合成已得到越来越多的国内外学者的关注，被认为是大幅度提高培养物中代谢产物的重要方法之一。
[0004]诱导子是提高植物细胞培养中次生代谢产物含量的有效手段，它作为一种特殊的生化信号，在植物次生代谢过程中，具有快速、专一、有选择地诱导某些特定基因表达的特性，诱导子从来源上分可包括生物诱导子和非生物诱导子两大类。同一植物对不同诱导子的反应不同，因而刺激合成的代谢产物及其含量也有所不同，因此，在实际应用中应综合考虑与灵活运用，使诱导子在药用植物培养过程中发挥最佳促进作用。本发明中选用两种非生物诱导子(水杨酸和茉莉酸甲酯)对悬浮培养的铁皮石斛原球茎进行调控，研究其生长及有效物质积累规律，发现两种诱导子均对有效物质的积累有一定促进作用，对铁皮石斛资源开发及可持续利用具有较高的理论价值。
[0005]本发明利用悬浮培养的方式培养铁皮石斛原球茎，在培养初期添加诱导子(水杨酸和茉莉酸甲酯)，培养周期为30d，处理后发现诱导子对原球茎生物量无明显影响，但对原球茎中有效物质(多糖、生物碱、黄酮和总酚)含量的积累有一定促进作用。该方法通过在铁皮石斛原球茎悬浮培养初期添加诱导子，以期为提高铁皮石斛原球茎中有效物质含量及大规模培养生产有效药用成分提供技术参数，同时也为原球茎内有效物质合成机理的研究提供理论依据。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种利用非生物诱导子提高铁皮石斛原球茎中有效物质的方法。以悬浮培养的铁皮石斛原球茎为材料，用水杨酸和茉莉酸甲酯对原球茎进行处理，通过对两种诱导子浓度的筛选，将几种诱导子的最佳浓度进行比较，制定提高铁皮石斛原球茎中有效物质含量的具体方案，为铁皮石斛资源的有效开发利用提供一种新途径。
[0007]本发明采用了以下技术方案:
[0008]利用非生物诱导子提高铁皮石斛原球茎中有效物质的方法。
[0009]①铁皮石斛原球茎的诱导及培养
[0010]将继代培养30d的铁皮石斛原球茎作为试验材料进行悬浮培养，在含有25ml液体培养基的50ml锥形瓶中接入3g (Fff)原球茎，在转速为121r/min的振荡器(GTCS-2013B，金坛市科析仪器有限公司，中国)上进行培养，温度为25°C，光照强度1600LUX，每天光照16h。
[0011]②诱导子处理
[0012]在含有25ml液体培养基的50ml锥形瓶中接入3g (Fff)原球茎，在培养初期分别进行两种诱导子的不同浓度处理，30d收获原球茎，测定其生物量及有效物质含量。再比较上述试验筛选出的两种诱导子的最佳浓度对原球茎生物量及有效物质含量的影响。
[0013]③铁皮石斛原球茎中多糖含量测定
[0014]将诱导子处理的铁皮石斛原球茎烘干至恒重后研磨，采用苯酚-浓硫酸法，通过紫外分光光度计(UV-2600，上海天河环境技术有限公司，中国)测定多糖含量。
[0015]④铁皮石斛原球茎中生物碱含量测定
[0016]将诱导子处理的铁皮石斛原球茎烘干至恒重后研磨，采用改良的酸性染料比色法，通过紫外分光光度计测定生物碱含量。
[0017]⑤铁皮石斛原球茎中黄酮含量测定
[0018]将诱导子处理的铁皮石斛原球茎烘干至恒重后研磨，采用硝酸铝染色法，通过紫外分光光度计测定其黄酮含量。
[0019]⑥铁皮石斛原球茎中总酚含量测定
[0020]将诱导子处理的铁皮石斛原球茎烘干至恒重后研磨，采用福林酚比色法，通过紫外分光光度计测定其总酚含量。
[0021]本发明整体研究了非生物诱导子处理浓度对铁皮石斛原球茎中有效物质(多糖、生物碱、黄酮和总酚)含量的作用效果，在此基础上优化并筛选出了合理的诱导子及处理浓度，形成了一条完整的提高铁皮石斛原球茎中有效物质含量的途径。
【附图说明】
[0022]图1水杨酸浓度对铁皮石斛原球茎生物量的影响
[0023]图2水杨酸浓度对铁皮石斛原球茎中有效物质积累的影响
[0024]图3茉莉酸甲酯浓度对铁皮石斛原球茎生物量的影响
[0025]图4茉莉酸甲酯浓度对铁皮石斛原球茎中有效物质积累的影响
[0026]图5不同诱导子对铁皮石斛原球茎生物量的影响
[0027]图6不同诱导子对铁皮石斛原球茎中有效物质积累的影响
【具体实施方式】
[0028](一 )材料与方法
[0029]①铁皮石斛原球茎的诱导及培养
[0030]取采自浙江温州的铁皮石斛种子进行消毒后，将种子播种到1/2MS+蔗糖30gL琼脂5gL 1 (pH 5.8)的固体培养基中。培养30d后将形成的原球茎接种在含有25mL的原球茎增殖培养基的培养皿(Φ Xh = 90X 15mm)中。增殖培养基为1/2MS+BA 2mgL J+NAA0.5mgL 1+KH2PO4 0.165gL k蛋白胨3gL k蔗糖30gL k倍力凝5gL \pH调节为5.8。将继代培养获得的原球茎切成0.5cmX0.5cm后作为试验材料，称取3g(FW)接种于含有25ml液体培养基(l/2MS+BA2mgL ^NAA0.5mgL ^KH2PO40.165gL 蛋白胨 3gL 蔗糖 30gL 的 50ml锥形瓶中。转速为120r/min，温度为25°C，光照强度1600Lux，每天光照16h。
[0031]②诱导子处理
[0032]在含有25ml液体培养基的50ml锥形瓶中接入3g (Fff)原球茎，在培养初期分别进行两种诱导子的不同浓度处理，将水杨酸浓度设定为25、50、75、100和125ymoL ;茉莉酸甲酯浓度设定为25、50、75、100和125ymoL ;在上述试验的前提下，将几种诱导子的最佳处理浓度之间进行比较。以未加入诱导子为对照，在转速为121r/min的振荡器上培养，30d后将原球茎取出，用自来水冲洗干净，沥干水分后称鲜物重，然后分别放入标记好的培养皿中并置于45°C干燥箱(YHW1103，天津市华北实验仪器有限公司，中国)中烘干至恒重后称干物重。
[0033]③铁皮石斛原球茎中多糖含量的测定
[0034]标准曲线的制作:精密称取干燥至恒重的葡萄糖lOOmg，室温下溶解于10mL的容量瓶中，得到浓度为lmg/mL的葡萄糖标准液。再利用此标准液配制浓度为0.01,0.025、
0.05,0.075,0.1,0.15mg/mL的葡萄糖对照溶液，各取葡萄糖对照液ImL置于试管中，以蒸馈水作为空白对照，然后用苯酸-硫酸法在490nm处测定其吸光值。
[0035]多糖的提取:精密称取铁皮石斛粉末1gJP 90%的乙醇溶液浸泡6h，去除上清液，再次加入90 %的乙醇溶液浸泡6h后，挥干溶液加蒸馏水lOOmL，放入水浴锅内，调节温度为50°C，30min后过滤，重复上述步骤2次，将提取液合并后用旋转蒸发仪浓缩至10mL。用Sevage试剂(氯仿:正丁醇=5: I)去除蛋白，离心过滤得上清液，向上清液内加入95%的乙醇溶液静置12h后抽滤。然后用无水乙醇、丙酮、乙醚三种有机溶剂对滤渣进行冲洗，重复2次，将有机溶剂挥发后，放入40°C烘干箱内烘干至恒重，得多糖。精密称取铁皮石斛多糖样品lmg，置于10mL容量瓶内用蒸馏水稀释至刻度，即配成浓度为10 μ g/mL的铁皮石斛多糖溶液。精密量取ImL多糖溶液按标准曲线项内容操作，求出换算因素:f = ff/(CXD)，式中W为多糖重量(mg)，C为多糖中葡萄糖的浓度(mg/mL)，D为多糖稀释倍数。
[0036]样品溶液的制备:精密量取铁皮石斛干燥粉末100mg，分别加入90 %的乙醇溶液浸泡洗涤6h，重复两次后将滤渣挥干，加蒸馏水20mL，水浴加热30min，重复3次合并滤液，定容至lOOmL，得待测样品溶液备用。精密吸取Iml按标准曲线项操作，求出各待测液中葡萄糖浓度。多糖含量(％) = [ (CXDXfXV)/ff]X100%o式中C为多糖中葡萄糖的浓度(mg/mL)，D为多糖稀释倍数，f为换算因素，V为供试溶液体积(mL)，W为多糖重量(mg)。
[0037]④铁皮石斛原球茎中生物碱含量的测定
[0038]标准曲线的制作:精密称取石斛碱Img放置于10mL容量瓶中，加氯仿至刻度线。精密量取l、2、3、4、5mL的标准液放入1mL的容量瓶中，加氯仿定容。将定容好的标准液分别放入分液漏斗中，其中加入5mL的pH 4.5缓冲液，2ml的0.04%的溴甲酚绿溶液，剧烈振荡3min，静止放置30min后，将分液漏斗内下层的氯仿层用氯仿浸泡处理并干燥的脱脂棉过滤。精密吸取5mL的过滤液放入刻度试管内，加ImL的0.0lmol L 1氢氧化钠无水乙醇溶液，振荡混合均匀。以氯仿1mL作为空白对照，在620nm处测定吸光值，并且绘制标准曲线。标准曲线:y = 0.1034x-0.0917 (R2 = 0.9983)
[0039]石斛碱的测定:精密量取铁皮石斛原球茎粉末0.5g，放入圆底烧瓶内，加入适量浓氨水使干燥粉末湿润，密封放置30min后，加入1mL的氯仿，进行水浴回流2h，待其冷却后称重，用氯仿补足失去的重量，用氯仿浸泡处理并干燥的脱脂棉过滤。精密量取过滤液2mL，用氯仿定容至10mL，置于分液漏斗内，作为待测液。将待测液按照标准曲线制作方法进行操作，测定吸光度并计算生物碱含量。
[0040]⑤铁皮石斛原球茎中黄酮含量的测定
[0041]标准曲线的制作:精密称取芦丁 10mg，用70%的乙醇溶解并用250mL容量瓶定容摇匀。得到浓度为40 μ g/L的标准液，分别精密吸取此标准溶液0.1,0.2,0.4,0.6,0.8mL置于试管中，加蒸馏水至2mL，以70 %的乙醇为对照，分别加入0.3mL5 %的NaNO2溶液，摇匀静止6min，加入0.3mL10%的Al (NO3)3溶液，摇勾静止6min，再加入4%的NaOH溶液2mL，反应1min后，在51nm处测定其吸光值。
[0042]样品溶液的制备:将上述处理的铁皮石斛原球茎研磨成粉末，精密称取样品0.2g，置于离心管中，加入10mL70%的乙醇后置于60°C的水浴锅中2?3h，冷却后，在温度为4°C、转速为，000r/min条件下离心15min，取上清液定容至25mL，从中取出ImL稀释至5mL。精密量取ImL按标准曲线制作方法进行操作，计算黄酮含量。
[0043]⑥铁皮石斛原球茎中总酚含量测定
[0044]标准曲线的制作:精密称取没食子酸25mg，用蒸馏水充分溶解并定容至250mL容量瓶。得到浓度为0.lmg/mL的标准液，分别精密量取标准溶液0.05,0.1,0.15,0.2,0.25、0.3和0.35mL置于试管中，加蒸馈水至lmL，以蒸馈水为对照，再加入0.1mL福林-酸试剂，放置6min后再向试管中加入2% Na2CO3溶液0.5mL，置于暗处，Ih后在760nm处测定吸光值。
[0045]样品溶液的制备:将处理得到的铁皮石斛原球茎研磨成粉末，精密称取样品
0.lg，置于离心管中，加入10mL80%的乙甲醇后置于80°C的水浴锅中lh，冷却后，在温度为4°C、转速为5000r/min条件下离心15min，取上清液定容至25mL，从中取出ImL稀释至2mL作为样品溶液。按标准曲线制作方法进行操作，计算总酚含量。
[0046]( 二)结果与分析
[0047]通过对铁皮石斛原球茎鲜物重和干物重的测定，并利用紫外分光光度计对原球茎中多糖、生物碱、黄酮和总酚含量进行分析，得到如下结果:
[0048]①水杨酸浓度对铁皮石斛原球茎生物量和有效物质含量积累的影响
[0049]培养初期加入浓度为25、50、75、100和125 μπιο?的水杨酸，30d后测定原球茎生物量及有效物质含量，结果发现75 μmol的水杨酸可显著提高原球茎内多糖含量，其中的多糖含量由未处理中的204.9mg/g增加到272.9mg/g ;生物碱含量也在水杨酸浓度为75 μ mol时得到显著提高，由未处理时的180.1 μ g/g提高到240.5 μ g/g ;75 μπιο?水杨酸处理中原球茎内的黄酮含量(3.7mg/g)略低于水杨酸浓度为100 μ mol时原球茎内黄酮含量(3.8mg/g)，但两者之间无明显差异，且仍高于未处理中黄酮含量(3.lmg/g);水杨酸对铁皮石斛原球茎内总酚含量无明显影响。由此发现，加入75 μπιο?的水杨酸对铁皮石斛原球茎内多糖、生物碱及黄酮含量有明显提高效果。
[0050]②茉莉酸甲酯浓度对铁皮石斛原球茎生物量和有效物质含量积累的影响
[0051 ] 培养初期加入浓度为25、50、75、100和125 μ mol的茉莉酸甲酯，30d后发现茉莉酸甲酯对原球茎生物量无明显影响，但对原球茎中有效物质含量有明显促进作用。不同浓度的茉莉酸甲酯对原球茎内多糖含量积累有不同程度的提升作用，当浓度为75 μπιο?时多糖含量达到最大值(338.5mg/g)，显著高于未处理的原球茎中多糖含量(205.7mg/g);茉莉酸甲酯处理的原球茎内生物碱含量与多糖含量有相同的变化趋势，在75 μπιο?茉莉酸甲酯处理的原球茎中生物碱含量最高，由未处理中的188.9 μ g/g提升到259.9 μ g/g ;原球茎内黄酮含量随茉莉酸甲酯浓度的增大呈现先升高后降低的趋势，在浓度为75 μπιο?时达到最大值(4.lmg/g)，高于未处理原球茎中黄酮含量(3.5mg/g);原球茎内总酚含量则随茉莉酸甲酯浓度的升高而逐渐增大。综合考虑发现，75 μ mol茉莉酸甲酯更有利于铁皮石斛原球茎内有效物质含量积累。
[0052]③不同诱导子对铁皮石斛原球茎生物量和有效物质含量积累的比较
[0053]为进一步验证水杨酸和茉莉酸甲酯对铁皮石斛原球茎生物量和有效物质积累效果，试验添加两种对原球茎生物量和有效物质积累有影响的诱导子，即壳聚糖(30mg/L)和普鲁兰(200mg/L)与所筛选的最佳的水杨酸(75μηιο1)和茉莉酸甲酯(75 μπιο?)处理进行比较。所有诱导子在原球茎培养初期加入，30d后测定原球茎的生物量及有效物质含量，发现四种诱导子对原球茎生物量的积累无明显影响，但对有效物质含量均有一定影响。75 μπιο?茉莉酸甲酯对提高原球茎中多糖含量效果明显，由未处理的226.5mg/g提高到323.4mg/g ;对于生物碱各处理均有不同程度的促进作用，其中75 μπιο?茉莉酸甲酯对提高生物碱含量较为显著，达到247.3 yg/g，明显优于其它三种诱导子；200mg/L普鲁兰，75 μ mol水杨酸，75 μ mol茉莉酸甲酯对提高黄酮含量作用显著，黄酮含量分别达到
3.5mg/g，3.8mg/g和4.0mg/g且无显著差异；各处理对原球莖中总酸含量积累无明显差异，75 μ mol茉莉酸甲酯对提高总酚含量效果较为明显，达到4.3mg/go因此，75 μπιο?茉莉酸甲酯最有利于提尚原球莖内有效物质含量。
[0054]通过对诱导子浓度的筛选及四种诱导子最佳浓度比较的结果进行分析，可发现水杨酸和茉莉酸甲酯对悬浮培养铁皮石斛原球茎生物量积累无明显影响，但对有效物质积累均有一定的促进作用，其中茉莉酸甲酯对有效物质积累的促进作用更为明显。因此，在铁皮石斛原球茎大规模生产中，可通过在培养初期添加75 μπιο?茉莉酸甲酯以期在短期内提高原球茎中有效物质含量。
【主权项】
1.一种利用非生物诱导子提高铁皮石斛原球茎中有效物质的方法，在铁皮石斛原球茎悬浮培养初期加入的水杨酸和茉莉酸甲酯对铁皮石斛原球茎中有效物质积累有显著的效果O2.权利要求1所述的一种利用非生物诱导子提高铁皮石斛原球茎中有效物质的方法，其特征在于筛选出水杨酸和茉莉酸甲酯的最佳浓度，即均为75 μπιο?。3.权利要求1所述的一种利用非生物诱导子提高铁皮石斛原球茎中有效物质的方法，其特征在于确定茉莉酸甲酯为最佳的诱导子。
【文档编号】C12N5/04GK105886452SQ201410853230
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月25日
【发明人】廉美兰, 朴炫春, 魏楠楠, 姚睿
【申请人】廉美兰