一种用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物的制作方法

一种用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物，其由药用级人白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、脂质、微量元素、激素、剪切力保护剂、白藜芦醇、D?氨基葡萄糖盐酸盐、R?848和C3组成。该血清替代物可与基础培养基在使用前方便地通过一定工艺制备成无血清培养基，该无血清培养基可用于免疫细胞悬浮培养。本发明的血清替代物具有以下优势：1)所述血清替代物含有替代性小分子化合物，最大限度降低蛋白成分含量，成分明确，一致性强；2)所述血清替代物可使用常规方法配制，并于?80～?20℃保存；3)所述血清替代物可以分装保存，在使用前方便地与基础培养基混合后使用，避免培养基反复冻融。
【专利说明】
一种用于免疫细胞悬淳培养的血清替代物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物，属于细胞工程与生物医药
技术领域。
【背景技术】
[0002] 体细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体细胞，经体外操作 后回输（或植入）人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及 药物或其他能改变细胞生物学行为的处理，经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗， 也可用于疾病的诊断和预防。体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的 单个核细胞如淋巴因子激活的杀伤细胞（Lymphokine Activated Killer Cells, LAK)、肿 瘤浸润性淋巴细胞（Tumor Infiltrative Lymphocytes,TIL)、单核细胞、巨嗤细胞或体外致 敏的杀伤细胞（IVS)等。国内的免疫细胞治疗较多应用于治疗肿瘤及病毒性感染疾病如 肝炎、艾滋病等。目前临床中应用较为成熟的自体免疫细胞治疗技术是肿瘤生物治疗的重 要方法之一，是在多种免疫活性因子的作用下，有效活化和扩增从自体外周血中分离的免 疫活性细胞（单个核细胞），回输入患者体内，直接杀伤或诱导免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞 或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能。自体免疫细胞治疗技术包括细胞因子诱 导的杀伤细胞（Cytokine Induced Killer Cells，CIK)免疫治疗、树突状细胞（Dendritic Cells，DC)免疫治疗、DC-CIK细胞免疫治疗、自然杀伤细胞（Nature Killer，NK)免疫治疗 等。
[0003] CIK细胞最早是1991年由美国斯坦福大学Schmidt Wolf等首次报道，他们发现在 多种细胞因子如Y干扰素、CD3单抗、白介素-1和白介素-2等的共同作用下，外周血淋巴 细胞可以被定向诱导并大量增殖成为肿瘤杀伤细胞。由于该种细胞同时表达CD3和CD56 两种膜蛋白分子，因此具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非主要组织相容性复合 体限制性杀瘤的优点。与其他免疫治疗细胞相比，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、 杀瘤谱广、副作用小、对正常骨髓造血影响轻微等优点，因此，应用CIK细胞进行自体免疫 细胞治疗被认为是新一代肿瘤治疗的首选方案。
[0004] 细胞培养基作为细胞培养中的主要载体，对免疫细胞在体外的活化和扩增效果 以及肿瘤细胞杀伤效果都起到至关重要的作用，对自体免疫细胞治疗技术的推广应用有 重大影响。现在常用于临床CIK细胞培养的完全培养基一般为含有10% AB型人血清的 RPMI1640培养基，因其含有人AB型血清，虽经HBV、HCV及HIV的检测，但仍有可能传播其 他疾病，安全性低，并且还存在批间差异大、不宜质控、成分不明确、价格昂贵等问题。与传 统的完全培养基相比，无血清培养基可达到生物洁净要求、成分明确、质量稳定，便于质控， 客服了人AB型血清的缺点，能减少患者意外感染的机会，对于免疫治疗的推广应用有重要 意义。多数研究表明，无血清培养基可代替含血清的完全培养基，二者所得培养物的数目和 功能相当，蒋永新等人对无血清培养基与完全培养基体外诱导扩增CIK细胞的细胞功能进 行了系统性的分析，通过对CIK细胞增殖能力、细胞表型分析以及杀瘤活性等方面的研究 结果表明无血清培养基支持细胞增殖能力更为稳定可靠，使用无血清培养基培养所得细胞 功能未收到损害。（蒋永新等，中华肿瘤防治杂志，2006,13 [12] :900-903 ;蒋永新等，肿瘤 防治研究，2006, 33 [11] :784-787)
[0005] 无血清培养过程中添加血清替代成分的方式有两种，一种是在新研发的无血清 培养基成分中已经包含了各种血清替代成分，可直接进行培养；另一种是单独提供血清 替代物，在培养时代替血清添加进入培养体系中，还需另行添加部分血清替代成分如生长 因子、激素等。目前市场上可商购获得的血清替代物大部分为进口产品，如Gibco公司的 KnockOutTM SR和Amsbio公司的PuriQTM Serum Replacement均适用于胚胎干细胞的无 血清培养，Sigma Aldrich公司提供的SERUM REPLACEMENT 3以及Biowest公司提供的 FreeAdd则适用于常规细胞的无血清培养。
[0006] 虽然无血清培养基具有许多传统的含血清培养基无法比拟的优势，但是其仍存在 以下的不足有待改善：a.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培 养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便；b.针对性强，不同类型的细胞、甚至不同 细胞系或细胞株对培养基营养成分的需求都不同；c.使用无血清培养基进行原代细胞分 离时细胞得率偏低；d.目前大部分无血清培养基所必需的胰岛素和转铁蛋白仍以动物为 来源，并没有消除血清带来的安全隐患；e.成本较高。

【发明内容】

[0007] 为解决上述技术问题，本发明的一个目的在于提供一种用于免疫细胞悬浮培养的 血清替代物，其中该替代物可在使用前与基础培养基方便地通过一定的工艺组成无血清培 养基，该培养基可用于免疫细胞悬浮培养。该血清替代物具有化学成分明确、无动物源性成 分、保存简便、针对性强、安全有效、简单易行、成本低廉等优点。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供一种包含所述用于免疫细胞悬浮培养的血清替代 物的组合物，所述组合物典型地由所述血清替代物与基础培养基在使用前方便地通过一定 的工艺制备获得，所述培养基典型地为用于免疫细胞悬浮培养的无血清培养基。
[0009] 本发明的第一个目的是这样实现的：
[0010] -种用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物，其特征在于：其包含以终浓度计 50-200mg/L药用级人白蛋白、50-500mg/L重组人转铁蛋白、10-100mg/L重组人胰岛素、 15-60mg/L 脂质、1. 5-30mg/L 微量元素、10-100mg/L 激素、500-3000mg/L 剪切力保护剂、 l_50mg/L 白藜芦醇、500_2000mg/L D-氨基葡萄糖盐酸盐、l_50mg/L R-848 和、l_200mg/L C3〇
[0011] 优选地，其包含以终浓度计100_200mg/L药用级人白蛋白、100-300mg/L重组人转 铁蛋白、30_80mg/L重组人胰岛素、30-50mg/L脂质、2-15mg/L微量元素、20-50mg/L激素、 1000-2000mg/L剪切力保护剂、10-20mg/L白藜芦醇、1000-1500mg/L D-氨基葡萄糖盐酸 盐、10-30mg/L R-848 和、10-150mg/L C3。
[0012] 更优选地，其包含以终浓度计100mg/L药用级人白蛋白、100mg/L重组人转铁蛋 白、100mg/L重组人胰岛素、40mg/L脂质、5mg/L微量元素、30mg/L激素、1500mg/L剪切力保 护剂、15mg/L白藜芦醇、1200mg/L D-氨基葡萄糖盐酸盐、20mg/L R-848和80mg/L C3。
[0013] 其中，所述脂质包括但不限于花生四烯酸、胆固醇、油酸、亚油酸、硫辛酸、亚麻酸 等；所述微量元素包括但不限于铁、铜、锌、硒、钴、镍、锰等；所述激素包括但不限于地塞米 松、孕酮、胆固醇等；所述剪切力保护剂包括但不限于泊洛沙姆等。
[0014] 本发明的第二个目的是这样实现的：
[0015] -种包含所述用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物的组合物，其特征在于：所述 组合物由50% -95%的基础培养基与5-50%的本发明血清替代物组成；优选地，所述组合 物由70% -95%的基础培养基与5-30%的本发明血清替代物组成；更优选地，所述组合物 由85% -95 %的基础培养基与5-15 %的本发明血清替代物组成；最优选地，所述组合物由 90 %的基础培养基与10 %的本发明血清替代物组成。
[0016] 其中，所述基础培养基包括但不限于RPMI1640培养基、DMEM培养基等。
[0017] 所述组合物通常为无血清培养基，所述无血清培养基通常用于免疫细胞悬浮培 养。其中，所述基础培养基和所述用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物的组合物由常规方 法配制（戴育成等人，专利申请号201110081988. 5)。
[0018] 本发明的血清替代物具有以下优势：1)所述基础培养基成分明确，可以使用常规 方法配制，并于常温保存；2)所述用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物蛋白含量低，可以 于-80~-20°C保存；3)所述用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物可以分装保存，在使用前 方便地与基础培养基混合后使用，避免培养基反复冻融。
[0019] 在优选的实施方案中，包含本发明血清替代物的无血清培养基可用于CIK细胞增 殖培养。将包含本发明血清替代物的培养基与完全培养基（含有10% FBS)、市售的进口 无血清培养基、市售的国产无血清培养基进行比较。按照文献报道的方法分离纯化外周血 单个核细胞（PBMC)，并进行体外诱导制备CIK细胞。CIK细胞增殖曲线结果表明，包含本发 明清替代物的无血清培养基可以有效的促进CIK细胞的体外增殖，其增殖效果显著的好于 完全培养基和国产无血清培养基，而与市售的进口无血清培养基X-VIV0 15的效果相当。 CIK表面标志分子表达水平的测定结果表明，包含本发明血清替代物的无血清培养基诱导 出的CIK细胞的品质优于传统的完全培养基和国产的无血清培养基，与进口培养基培养出 的CIK细胞品质相当。CIK细胞体外杀伤效能的评价表明，包含本发明血清替代物的无血清 培养基制备的CIK细胞对靶细胞的杀伤效率显著高于完全培养基和国产无血清培养基；在 20 : 1时，其杀伤活性略高于进口的无血清培养基。
[0020] 在另一个优选的实施方案中，包含本发明血清替代物的无血清培养基可用于NK 细胞的体外培养。将包含本发明血清替代物的培养基与完全培养基（含有10% FBS)、市售 的进口无血清培养基、市售的国产无血清培养基进行比较。按照文献报道的方法分离纯化 外周血PBMC并进行体外诱导制备NK细胞。NK增殖曲线结果表明，包含本发明血清替代物 的无血清培养基对于NK细胞体外增殖培养的效果与进口无血清培养基X-VIV0 15效果相 当，明显优于完全培养基和国产无血清培养基。NK细胞表面分子标志物的检测结果表明，使 用包含本发明血清替代物的无血清培养基制备的NK细胞其表面相关分子标志物的表达水 平显著高于完全培养基和国产无血清培养基，并略高于进口无血清培养基,表明包含本发 明血清替代物的无血清培养基培养出的NK细胞具有很好的细胞纯度。
【附图说明】
[0021] 图1是不同培养基培养的CIK细胞的体外生长曲线。
[0022] 图2是不同培养基诱导的CIK细胞表面标志分子表达水平。
[0023] 图3是以人白血病细胞系K562为靶细胞时，不同培养基培养的CIK细胞随着效靶 比的细胞毒百分比。
[0024] 图4是以人宫颈癌细胞系Hela为靶细胞时，不同培养基培养的CIK细胞随着效靶 比的细胞毒百分比。
[0025] 图5是以及人肺腺癌细胞系A549为靶细胞时，不同培养基培养的CIK细胞随着效 靶比的细胞毒百分比。
[0026] 图6是不同培养基培养的NK细胞的体外生长曲线。
[0027] 图7是不同培养基诱导的NK细胞表面标志分子表达水平。
【具体实施方式】
[0028] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技 术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0029] 实施例1.用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物的制备
[0030] 本发明的血清替代物配方A如表1所示。
[0031] 表1 :本发明血清替代物的配方（配方A)
[0032]
[0033] 所述血清替代物的配制方法如下：
[0034] 1.制备铁饱和人转铁蛋白溶液：
[0035] (1)将40mg FeCl3溶于20ml ImM HC1溶液，分装并冷冻保存于-20°C，得到1号 储存液；
[0036] (2)取200mg人转铁白蛋白，溶于20ml RPMI1640培养基中，加入300μ 1的1号储 存液并搅拌均匀，即得铁饱和的人转铁蛋白溶液（l〇mg/ml)，于-30°C保存。
[0037] 2.制备胆固醇溶液：称取58mg胆固醇粉末，加入20ml RPMI1640培养基中，超声 波振荡器于4°C震荡1小时，使之完全乳化，即得胆固醇储存液（2. 9mg/ml)，于-30°C保存。
[0038] 3.制备亚油酸溶液：称取80mg亚油酸溶于20ml标准乙醇中，充分震荡溶解，采用 0. 45 μ m的滤膜过滤2次除菌，即得亚油酸储备液（4mg/ml)，于8°C储存。
[0039] 4.其余成分均溶解于RPMI1640培养基中，得储备液。其中，药用级人白蛋白储备 液（10mg/ml)、重组人胰岛素储备液（10mg/ml)于-20°C储存；硫酸亚铁（0.2mg/ml)、硫酸 铜（0. 02mg/ml)、硫酸锌（0. lmg/ml)、亚硒酸钠（0.0 lmg/ml)、氯化钴（0. lmg/ml)、氯化镍 (0· 05mg/ml)、氯化猛（0· 02mg/ml)、地塞米松（0· lmg/ml)、泊洛沙姆 188(150mg/ml)、白藜 芦醇（1. 5mg/ml)、R-848 (2mg/ml)和 C3 (8mg/ml)其储备液于 8°C储存。
[0040] 5.将上述各组分的储备液各10ml加入容器中混合并搅拌均匀，加入RPMI1640培 养基将总体积补充至900ml，采用0· 45um和0· 22um滤膜各一张（上层为0· 45um，下层为 0. 22um)进行过滤除菌，并用5% NaHC03调节pH到7. 2,再加入RPMI1640培养基将体积补 充至1000ml，即得本发明血清替代物A。
[0041] 6.将血清替代物A分装并于-20°C储存。
[0042] 实施例2.包含本发明血清替代物的无血清培养基的配制
[0043] 1.将市售的培养基按说明书配制，即得RPMI 1640基础培养基（RPMI Medium 1640培养基，北京东方华辉生物医药科技有限公司）。其中RPMI 1640基础培养基配方如 表2所示。
[0044] 2.包含本发明血清替代物的无血清培养基的配方：本发明的无血清培养基（培养 基A)包含90 %的RPMI 1640基础培养基和10 %的血清替代物A。
[0045] 3.无血清培养基（培养基A)的制备：临用前将100ml血清替代物A缓慢加入 到800ml RPMI 1640基础培养基中，搅拌均匀后，用5% NaHC03调节pH到7. 2,再加入 RPMI1640培养基将体积补充至1000ml，即得包含本发明血清替代物A的无血清培养基（培 养基A)。
[0046] 表2 RPMI 1640基础培养基配方
[0047]
[0048] 实施例3.无血清培养基A培养CIK细胞增殖能力的评价 [0049] 利用健康人外周血，按照文献报道的方法分离纯化外周血单个核细胞（PBMC)，并 进行体外诱导，制备CIK细胞。实验分为4组（表3)，分别采用：1)本发明的无血清培养基 培养基A(培养基A)、2)完全培养基（RPMI 1640+10%FBS)、3)进口无血清培养基（X-VIV0 15 (L0NZA))和4)国产无血清培养基，进行细胞培养。
[0050] PBMC纯化后将细胞数调整至5X 106/ml，接种至T175培养瓶中。从诱导第1天起， 每3天进行半量换液，并保持培养基中细胞因子的终浓度不变。同时取样利用台盼蓝拒染 法进行计数，直至培养第21天结束，绘制CIK细胞增殖曲线。其中，使用市售无血清培养基 和传统的完全培养基的实验组，CIK的诱导按照文献中报道的方法进行，使用包括人源化的 小鼠抗人⑶3单克隆抗体，INF- γ和重组人E-2 ;使用本发明培养基的实验组，培养CIK时 只添加重组人IL-2。具体实验分组如下表所示：
[0051] 表3 CIK细胞增殖能力评价分组
[0052]
[0053] 实验结果如图1所示，本发明的无血清培养基（培养基A)可以有效的促进CIK细 胞的体外增殖，其增殖效果显著的好于传统的完全培养基和国产无血清培养基；与市售的 无血清培养基X-VIV0 15的效果相当。
[0054] 实施例4.无血清培养基A诱导CIK细胞表面标志分子表达水平的测定
[0055] 实施例3中所制备的CIK细胞，在培养至21天时收获。使用荧光抗体对细胞进 行标记后进行流式细胞分析，检测CIK细胞表面标志分子在培养前和培养后的表达水平变 化。每个样品标记的细胞量为IX 1〇6,检测的细胞表面分子包括：⑶3,⑶4,⑶8,和⑶56。 检测后，将四个实验组的不同细胞亚群与对照组，即诱导前的细胞进行比较；同时将诱导后 的四组之前的数据进行比较，观察培养后收获细胞中目的细胞的含量以及诱导效率。实验 分组如表4所示。
[0056] 表4 CIK细胞表面标志分子表达水平的测定分组
[0057]
[0058]
[0059] 实验结果如图2所示。与对照组（即诱导前）相比，四个实验组中⑶3+细胞亚 群的百分比均增加，但是没有显著性差异；四个实验组之间相比的结果也没有显著性差异。 ⑶3+/⑶56+和⑶3+/⑶8+两个双阳性细胞亚群的比例，在诱导后的四个实验组中均显著上 升，其中X-VI0V 15组和使用本发明培养基组的比例显著高于完全培养基组。⑶3+/⑶4+双 阳性细胞亚群的比例在诱导后在完全培养基组和国产无血清实验组中发生了轻微上调；在 进口培养基和培养基A组中发生了下降。CIK细胞主要是通过⑶3+/⑶56+和⑶3+/⑶8+两 个T细胞亚群发挥广谱性抗肿瘤作用，上述两个亚群的细胞比例决定了 CIK细胞的生物活 性，是判断CIK细胞质量的重要标准。此结果表明，培养基A诱导出的CIK的品质优于完全 培养基和国产的无血清培养基，与进口培养基培养出的CIK细胞品质相当。
[0060] 实施例5.无血清培养基A培养的CIK细胞体外杀伤效能的评价 [0061] 利用荧光染料CFSE测定不同实验组获得的CIK体外靶细胞杀伤活性，使用的靶细 胞包括人白血病细胞系K562,人宫颈癌细胞系Hela，以及人肺腺癌细胞系A549。CFSE染色 试剂盒购自Life Technology公司（货号：Cat. 34554)，碘化丙陡（PI)购自Sigma公司。 K562、Hela和A549细胞系均购自中国协和医科大学基础医学研究所。实验分组与实施例3 相同，如表3所示。
[0062] 将三种靶细胞的密度均调整至6xl04/ml，加入到U型底96孔培养板中，每孔 100 μ 1。收获四个实验组培养的CIK细胞，按照试剂盒说明书对CIK细胞进行标记，将标记 后的细胞按照效靶比5 : 1，10 : 1，和20 : 1的比例与靶细胞等体积混合，设置3个平行 对照空。同时设单独效应细胞和空白培养基作为对照空。混合后培养板在37°C，5%C02条 件下孵育4小时。孵育结束后，每孔加入25tl PI染液（100 μ g/ μ 1)，冰浴孵育5分钟后， 用流式细胞仪进行分析，测定CIK对不同靶细胞的杀伤能力。靶细胞的杀伤百分比的计算 方式为：
[0063] 细胞毒百分比=[实验组死亡的靶细胞-自然死亡的靶细胞/100-自然死亡的靶 细胞]X 100
[0064] 实验结果如图3、图4、图5所示。同一种培养基培养出的CIK细胞随着效靶比的 增加，其对三种靶细胞的杀伤效率均表现出递增的趋势；而在相同效靶比中，不同实验组进 行比较的结果显示，无血清培养基培养基Α制备的CIK细胞对靶细胞的杀伤效率显著高于 完全培养基组和国产无血清对照组；在20 : 1时，杀伤活性略高于进口的无血清培养基，但 是没有显著性差异。
[0065] 实施例6.无血清培养基A培养NK细胞增殖能力的评价
[0066] 采用细胞分离液（人单个核细胞分离液1. 077,货号25710,北京东方华辉生物医 药科技有限公司）从5-10ml健康人外周血中收集PBMC，PBMC用无菌PBS洗涤3遍，并重悬 于PBS中，取样计数。实验分为4组（表5)，分别采用：1)本发明的无血清培养基A、2)完 全培养基（RPMI 1640+10%FBS)、3)进口无血清培养基（X-VIVO 15(L0NZA))和4)国产无 血清培养基，进行细胞培养。
[0067] 分别使用以上培养基稀释分离得到的PBMC，调整细胞密度在1-3X 106/ml范围内。 将稀释好的PBMC接种至T175培养瓶中，同时添加重组人IL-2至终浓度10ng/ml，重组人 IL-15至终浓度50ng/ml，重组人血白蛋白至终浓度0. 1 % (W/V)，放入37°C，5 % C02环境中 培养。每3天进行半量换液，并维持培养基中各细胞因子的浓度水平保持不变，同时取样进 行计数，绘制细胞生长曲线，培养时间共15天。
[0068] 表5 NK细胞增殖能力评价分组
[0069]
[0070] 实验结果如图6所示。经过15天培养，无血清培养基A对于NK细胞体外增殖培 养的效果与进口无血清培养基X-VIV0 15效果相当，明显优于完全培养基和国产无血清培 养基。
[0071 ] 实施例7.无血清培养基A诱导NK细胞表面分子标志物的水平
[0072] 收获使用不同培养基培养的NK细胞，使用荧光标记抗体结合流式细胞分析，检测 NK细胞表面标志物的表达，包括⑶3、⑶56、⑶16、⑶8和⑶57,其中⑶3-/⑶56+，⑶16+/ ⑶56+和⑶8+/⑶57+是NK细胞的标志性分子表型。实验分组如表6所示。
[0073] 具体操作为，检测前将细胞收集，1000rpm，4°C离心5分钟。将细胞用PBS重悬 并计数，调整细胞密度为lxl〇6/ml。取5x105的细胞作为待检样品，加入用2% BSA稀释 的荧光标记抗体标记 FITC-CD3(eBioscience，Cat. 11-0038-41)，APC-CD56(eBioscience， Cat. 17-0569-42)，PerCP-CD8(eBioscience，Cat. 8043-0087-120)，PE-CD16(eBioscience， Cat. 12-0167-42)和 Pacific Blue-CD57(eBioscience，Cat. 322315)对细胞进行标记，室温 避光孵育20分钟。样品孵育后用PBS洗2次，再加入500 μ 1 PBS重悬，用流式细胞仪进行 检测。
[0074] 表6 NK细胞表面标志分子表达水平的测定分组
[0075]
[0076] 实验结果如图7所示。使用无血清培养基A制备的NK细胞其表面相关分子标志物 的表达水平显著高于完全培养基组和国产无血清培养基组，略高于进口无血清培养基组， 表明无血清培养基A培养出的NK细胞具有很好的细胞纯度。
【主权项】
1. 一种用于免疫细胞悬浮培养的血清替代物，其特征在于，该血清替代物包含：药用 级人白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、脂质、微量元素、激素、剪切力保护剂、白藜芦 醇、D-氨基葡萄糖盐酸盐、R-848和C3。2. 根据权利要求1所述的血清替代物，其特征在于：其包含以终浓度计50-200mg/L药 用级人白蛋白、50_500mg/L重组人转铁蛋白、10-100mg/L重组人胰岛素、15-60mg/L脂质、 I. 5-30mg/L微量元素、10-100mg/L激素、500-3000mg/L剪切力保护剂、l-50mg/L白藜芦醇、 500-2000mg/L D-氨基葡萄糖盐酸盐、l-50mg/L R-848 和、l-200mg/L C3。3. 根据权利要求1所述的血清替代物，其特征在于：优选地，其包含以终浓度计 100-200mg/L药用级人白蛋白、100-300mg/L重组人转铁蛋白、30-80mg/L重组人胰岛 素、30-50mg/L 脂质、2-15mg/L 微量元素、20-50mg/L 激素、1000-2000mg/L 剪切力保护 剂、10-20mg/L白藜芦醇、1000-1500mg/L D-氨基葡萄糖盐酸盐、10-30mg/L R-848和、 10-150mg/L C3。4. 根据权利要求1所述的血清替代物，其特征在于：更优选地，其包含以终浓度计 100mg/L药用级人白蛋白、100mg/L重组人转铁蛋白、100mg/L重组人胰岛素、40mg/L脂质、 5mg/L微量元素、30mg/L激素、1500mg/L剪切力保护剂、15mg/L白藜芦醇、1200mg/L D-氨基 葡萄糖盐酸盐、20mg/LR_848和80mg/L C3。5. 根据权利要求1至4中任意一项所述的血清替代物，其中：所述脂质包括但不限于 花生四烯酸、胆固醇、油酸、亚油酸、硫辛酸、亚麻酸等；所述微量元素包括但不限于铁、铜、 锌、硒、钴、镍、锰等；所述激素包括但不限于地塞米松、孕酮、胆固醇等；所述剪切力保护剂 包括但不限于泊洛沙姆等。6. -种包含根据权利要求1至5中任意一项所述的血清替代物的组合物，其特征在于： 所述组合物可以由根据权利要求1至5中任意一项所述的血清替代物与基础培养基方便地 在使用前通过一定工艺制备。其中，所述基础培养基包括但不限于RPMI1640培养基、DMEM 培养基等。7. 根据权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述组合物由50% -95%的基础培养 基与5-50%的根据权利要求1至5中任意一项所述的血清替代物组成；优选地，所述组合 物由70 % -95 %的基础培养基与5-30 %的根据权利要求1至5中任意一项所述的血清替代 物组成；更优选地，所述组合物由85 % -95 %的基础培养基与5-15 %的根据权利要求1至5 中任意一项所述的血清替代物组成；最优选地，所述组合物由90 %的基础培养基与10%的 根据权利要求1至5中任意一项所述的血清替代物组成。8. 根据权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述组合物为无血清培养基。9. 根据权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述组合物可用于免疫细胞悬浮培养。10. 根据权利要求6所述的组合物在免疫细胞悬浮中的应用，其特征在于：所述免疫细 胞包括但不限于细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine Induced Killer Cells, CIK)、自然 杀伤细胞（Nature Killer，NK)细胞等。
【文档编号】C12N5/02GK105886465SQ201410645405
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月15日
【发明人】赵宇
【申请人】赵宇