一种几丁质合酶及其基因和应用

一种几丁质合酶及其基因和应用【专利摘要】本发明涉及几丁质合酶，特别涉及卵菌门中的几丁质合酶，其氨基酸序列为与如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列在相似性在75％以上，优选在80％以上，更优选在90％以上，最优选在95％以上且具有与如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。所述几丁质合酶的活性水平能够调节卵菌的活性孢子囊和活性游动孢子的产量从而影响卵菌的致病力或寄主的发病程度。【专利说明】一种几丁质合酶及其基因和应用
技术领域：
[0001]本发明涉及几丁质合酶，特别涉及卵菌门中的几丁质合酶。【
背景技术：
】[0002]卵菌门（Oomycota)中存在很多重要的植物病原卵菌，可以侵染多种寄主植物，如辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)可以侵染前科植物辣椒与番前，豆科植物青豆与菜豆以及萌芦科中的大多数植物，造成严重的经济损失。其中辣椒疫病是辣椒种植与生产中的一种毁灭性卵菌病害，在我国大部分地区均有发生，辣椒疫病具有侵染途径多，病程短，蔓延速度快等特点，发病条件适宜时，短期内可造成辣椒大量萎蔫死亡，甚至绝产。而大豆疫霉病菌(Phytophthorasojae)侵染引起的大豆根腐病是严重危害大豆生产的重要病害之一，每年导致的经济损失超过10亿美元。1989年，中国东北地区首次发现大豆疫霉根腐病，现已在中国大豆的主产区黑龙江省和安徽省、内蒙古自治区、福建省及北京市、山东省等地发现。[0003]卵菌门的无性生殖可以产生孢子囊与游动孢子。孢子囊呈梨形或是柠檬形。在发生植物病害时，病原孢子囊通常在植株发病部位表面形成。孢子囊可以随风、雨水以及灌溉用水进行远距离的传播。孢子囊与寄主植株接触后可以直接萌发进行侵染。而在低温潮湿的条件下，孢子囊也可以释放出单核，无细胞壁，双鞭毛的游动孢子。每个孢子囊会释放20-40个游动孢子，一般可以持续游动数个小时到几天，以螺旋方式在水中运动，游动距离为6cm或更长。游动孢子的游动具有自主性并有趋向性，可以使其侵染寄主成功的概率提高。游动孢子易受到外界环境的刺激而休止转变为休止孢，并很快形成细胞壁后萌发形成芽管，在遇到寄主之后分泌胞外酶用来破坏寄主植物的表皮并迅速形成侵染钉，也可以通过自然孔口进行侵入。游动孢子作为病害循环中主要的再侵染源，在病害大规模流行中起着重要的作用。[0004]综上所述，病原孢子囊的形成和游动孢子的产生是卵菌侵染寄主所必需的过程。而且寄主病害的严重度与孢子囊和游动孢子的产量呈正相关。如果能阻断孢子囊的形成和游动孢子的产生，就可以控制卵菌侵染引起的病害如辣椒疫病和大豆疫霉等的发生。【
发明内容】[0005]通过发明人的研究发现，卵菌(Oomycota)中特定的几丁质合酶与卵菌产生活性的孢子囊和活性的游动孢子的产量密切相关，而寄主病害的严重度又与孢子囊和游动孢子的产量呈正相关。因此可以通过调控几丁质合酶来阻断孢子囊的形成和游动孢子的产生，可以达到控制卵菌侵染引起的病害如辣椒疫病和大豆疫霉病等的发生。[0006]因此，本发明之一提供了一种几丁质合酶，其氨基酸序列为与如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列的相似性在75%以上，优选在80%以上，更优选在90%以上，最优选在95%以上且具有与如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。一般来讲，具有较高的相似性，同时又具有相同功能的氨基酸序列在进化关系上具有同源性。而不论氨基酸序列的相似性是高还是低，只要它们具有保守的氨基酸位点或氨基酸模序，并通过进化关系分析软件进一步确认，则认为它们具有同源性。通常具有同源性的氨基酸序列或蛋白质一般使用相同的名称定名。这里的所谓同源性或同源序列，简单地说，是指从某一共同祖先经趋异进化而形成的不同序列，也就是进化过程中源于同一祖先的分支之间的关系。必须指出，相似性（similarity)和同源性(homology)是两个完全不同的概念。相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低，也就是两个序列（核酸、蛋白质）间的相关性。当相似程度高于50%时，比较容易推测检测序列和目标序列可能是同源序列；而当相似性程度低于20%时，就难以确定或者根本无法确定其是否具有同源性。利用DNAMAN软件进行序列比对，本发明的PSCHS1(SEQIDNo.4)和PCCHS(SEQIDNo.22)具有92.34%的相似性，本发明的PSCHSl(SEQIDNo.3)和PCCHS(SEQIDNo.21)具有81.02%的相似性。[0007]其中，所本发明的氨基酸序列可以是如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。本发明的几丁质合酶一般来源于自然界中卵菌(Oomycota)中，即一般来讲，其为天然产物。但其也可以通过构建含有几丁质合酶基因的重组表达载体，在特定的宿主中，例如在常见的芽孢杆菌（Bacillus)、假单胞菌（Pseudomonas)、肠杆菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一种等生物中进行重组表达。[0008]在本发明中，所述几丁质合酶包括存在于水霉目（Saprolegniales)和霜霉目(Peronosporales)，特别是白绣科(Albuginacece)、霜霉科(Peronosporaceae)和腐霉科(Pythiaceae)中的至少一种中的几丁质合酶;优选所述几丁质合酶包括存在于单轴霉属(Plasmopara)、腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)中的至少一种中的几丁质合酶；更优选所述几丁质合酶包括大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、寄生疫霉（Phytophthoraparasitica)和葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)中的至少一种中的几丁质合酶[0009]在本发明中，所述几丁质合酶的氨基酸序列可以具体地如SEQIDNo.4所示。[0010]本发明之二提供了一种能够编码如上任意一种几丁质合酶的DNA序列。优选DNA序列为与如SEQIDNo.3所示的DNA序列的相似性在65%以上，进一步优选在75%以上，更优选在85%以上，特别优选在95%以上且具有与如SEQIDNo.3所示的DNA序列相同功能的DNA序列。如cDNA或重组DNA。例如在本发明中，所述几丁质合酶的DNA序列包括存在于水霉目（Saprolegniales)和霜霉目（Peronosporales)，特别是白绣科(Albuginacece)、霜霉科(Peronosporaceae)和腐霉科(Pythiaceae)中的至少一种中的几丁质合酶;优选所述几丁质合酶包括存在于单轴霉属(Plasmopara)、腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)中的至少一种中的几丁质合酶；更优选所述几丁质合酶包括大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae)、马铃薯晚疫病菌（Phytophthorainfestans)、寄生疫霉（Phytophthoraparasitica)和葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)中的至少一种中的几丁质合酶DNA序列。再如本发明的DNA序列在严格条件下与如SEQIDNo.3所示DNA序列能够进行分子杂交且编码如上任意一种几丁质合酶的DNA序列。上述严格条件可为用6\33(：，0.5%303的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。[0011]在本发明中，几丁质合酶的DNA序列可以具体地如SEQIDNo.3所示。[0012]本发明之三提供了如上任意一种DNA序列转录得到的mRNA序列。本发明之四提供了一种能够抑制和/或杀灭卵菌(Oomycota)生长的方法，所述方法包括通过抑制如上任意一种DNA序列的转录，或抑制如上任意一种RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如上任意一种几丁质合酶的活性来抑制和/或杀灭所述卵菌生长。[00?3]在本发明中，所述卵菌包括水霉目（Saprolegniales)和霜霉目(Peronosporales)，特别是白绣科(Albuginacece)、霜霉科(Peronosporaceae)和腐霉科(Pythiaceae)中的至少一种中的几丁质合酶;优选所述几丁质合酶包括存在于单轴霉属(Plasmopara)、腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)中的至少一种中的几丁质合酶；更优选所述几丁质合酶包括大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、寄生疫霉（Phytophthoraparasitica)和葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)中的至少一种[0014]在本发明中，所述方法可用于抑制和/或杀灭大豆、马铃薯、番茄、烟草、茄子、刺槐、腊梅和葡萄中的至少一种产生的卵菌病害。[0015]本发明之五提供了一种筛选卵菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述卵菌，当所述待检测物能够抑制如上任意一种DNA序列转录，或抑制如上任意一种RNA序列翻译，或抑制和/或失活如上任意一种几丁质合酶的活性，则所述待检测物为所述卵菌的抑菌和/或杀菌剂。所述卵菌包括水霉目（Saprolegniales)和霜霉目(Peronosporales)，特别是白绣科(Albuginacece)、霜霉科(Peronosporaceae)和腐霉科(Pythiaceae)中的至少一种中的几丁质合酶;优选所述几丁质合酶包括存在于单轴霉属(Plasmopara)、腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)中的至少一种中的几丁质合酶；更优选所述几丁质合酶包括大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、寄生疫霉（Phytophthoraparasitica)和葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)中的至少一种。[0016]本发明之六提供了一种降低卵菌侵染寄主能力的方法，其包括通过抑制如上任意一种DNA序列的转录，或抑制如上任意一种RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如上任意一种几丁质合酶的活性来降低所述卵菌侵染所述寄主的能力。所述卵菌包括水霉目(Saprolegniales)和霜霉目（Peronosporales)，特别是白绣科(Albuginacece)、霜霉科(Peronosporaceae)和腐霉科(Pythiaceae)中的至少一种中的几丁质合酶;优选所述几丁质合酶包括存在于单轴霉属(Plasmopara)、腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)中的至少一种中的几丁质合酶；更优选所述几丁质合酶包括大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae)、马铃薯晚疫病菌（Phytophthorainfestans)、寄生疫霉（Phytophthoraparasitica)和葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)中的至少一种。[0017]本发明之七提供了一种检测卵菌中几丁质合酶转录水平的方法，其包括选取如上任意一种DNA序列中的任意一段80-300bp，特别是150-200bp长的靶标序列来进行反转录荧光定量PCR检测；优选还包括内参序列。所述卵菌包括水霉目（Saprolegniales)和霜霉目(Peronosporales)，特别是白绣科(Albuginacece)、霜霉科(Peronosporaceae)和腐霉科(Pythiaceae)中的至少一种中的几丁质合酶;优选所述几丁质合酶包括存在于单轴霉属(Plasmopara)、腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)中的至少一种中的几丁质合酶；更优选所述几丁质合酶包括大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、寄生疫霉（Phytophthoraparasitica)和葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)中的至少一种[0018]本发明之八提供了一种用于扩增卵菌中几丁质合酶表达水平的引物序列，即用于扩增靶标序列的引物序列，优选所述引物序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示;更优选所述内参序列的引物序列如SEQIDN0.7-12所示。所述卵菌包括水霉目（Sapr0legniales)和霜霉目（Peronosporales)，特别是白绣科(Albuginacece)、霜霉科(Peronosporaceae)和腐霉科(Pythiaceae)中的至少一种中的几丁质合酶;优选所述几丁质合酶包括存在于单轴霉属(Plasmopara)、腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)中的至少一种中的几丁质合酶;更优选所述几丁质合酶包括大豆疫霉病菌(Phytophthorasojae)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、寄生疫霉（Phytophthoraparasitica)和葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)中的至少一种。[0019]另外，含有上述任意一种DNA序列的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。在本发明中，所述重组表达载体具体为在PT0R载体的酶切位点Xbal和EcoRI中间正向插入序列表中如SEQIDNo.3所示的DNA片段后得到的重组质粒。[0020]在本发明中，所述重组菌具体为向目的大豆疫霉中导入了如SEQIDNo.3所示的DNA片段后得到的重组大豆疫霉。其中，如SEQIDNo.3所示的DNA片段是以重组载体的形式导入的；所述重组载体具体为在PT0R载体酶切位点Xbal和EcoRI中间正向插入如SEQIDNo.3所示的DNA片段后得到的重组质粒。所述目的大豆疫霉具体为大豆疫霉菌株PS6。[0021]扩增编码如上任意一种几丁质合酶的DNA序列全长或其上的任意一段DNA序列的一条引物和/或引物对也属于本发明的保护范围。[0022]实验证明，本发明所提供的几丁质合酶在卵菌自身生长发育过程中起作用，利用PEG_CaCl2介导的原生质体转化技术获得的沉默转化子的生长发育较野生型有明显变化，主要包括孢子囊形成数量减少，游动孢子产量下降等;通过游动孢子接种离体的寄主的叶片后发现沉默转化子接种的病斑面积显著小于野生型，进一步通过游动孢子接种活体的寄主的黄化苗发现沉默转化子接种的植株病斑直径也显著低于野生型。因此，卵菌中几丁质合酶的活性水平可以调节活性孢子囊和活性游动孢子的产量，从而影响卵菌的致病力或寄主的发病程度。本发明为进一步研制卵菌病菌发育过程和分子检测技术(例如本发明已经开发的荧光定量PCR检测技术），以及卵菌所导致的多种植物病害的防治与研究提供了技术基础。【附图说明】[0023]图1为PSCHS1基因在大豆疫霉不同发育阶段(横坐标从左向右依次为:菌丝(MY)、孢子囊（SP)、游动孢子(Z0)、休止孢(CY)、侵染大豆叶片1.5h、3h、6h、12h、24h、48h)的相对表达量。[0024]图2为野生型大豆疫霉（Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)，空载体对照转化子CK，PSCHS1基因的沉默转化子ST1-1、ST1_2和ST1-3中PSCHS1的相对表达量。[0025]图3为野生型大豆疫霉（Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)，空载体对照转化子CK，PSCHS1基因的过表达转化子0T1-1、0T1-2和0T1-3中PSCHS1的相对表达量。[0026]图4为野生型大豆疫霉（Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK、PSCHS1基因的沉默转化子ST1-1以及PSCHS1基因的过表达转化子0T1-1的菌落照片。[0027]图5为野生型大豆疫霉（Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK、PSCHS1基因的沉默转化子ST1-1、STl-2和ST1-3以及PSCHS1基因的过表达转化子0T1-1、0T1-2和0T1-3的孢子囊数量图。[0028]图6为野生型大豆疫霉（Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK、PSCHS1基因的沉默转化子ST1-1以及PSCHS1基因的过表达转化子0T1-1的孢子囊形态照片。[0029]图7为野生型大豆疫霉（Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK、PSCHS1基因的沉默转化子ST1-1、STl-2和ST1-3以及PSCHS1基因的过表达转化子0T1-1、0T1-2和0T1-3的游动孢子数量。[0030]图8为野生型大豆疫霉（Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK、PSCHS1基因的沉默转化子ST1-1、STl-2和ST1-3以及PSCHS1基因的过表达转化子0T1-1、0T1-2和0T1-3对大豆叶片的致病效果。[0031]图9为野生型大豆疫霉（Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK、PSCHS1基因的沉默转化子ST1-1、STl-2和ST1-3以及PSCHS1基因的过表达转化子0T1-1、ST1-2和ST1-3对大豆黄化苗的致病效果。[0032]图10为PCCHS基因在辣椒疫霉不同发育阶段（菌丝(MY)、孢子囊（SP)、游动孢子(Z0)、休止孢(CY)、侵染辣椒叶片1.5h、3h、6h、12h、24h、48h)的相对表达量。[0033]图11为野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK及PCCHS基因的沉默转化子T22、T33、T62中PCCHS的相对表达量。[0034]图12为野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK及PCCHS基因的沉默转化子T33和T62的孢子囊形态照片。[0035]图13为野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK及PCCHS基因的沉默转化子T22、T33、T62的孢子囊数量。[0036]图14为野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK及PCCHS基因的沉默转化子T33和T62的孢子囊形态扫描电镜结果。[0037]图15为野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK及PCCHS基因的沉默转化子T22、T33和T62的游动孢子的数量。[0038]图16为野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK及PCCHS基因的沉默转化子T33和T62对辣椒叶片的致病效果。[0039]图17为野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK及PCCHS基因的沉默转化子T33、T62对辣椒植株的致病效果。【具体实施方式】[0040]以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0041]大豆疫霉菌株PS6:存放于中国农业大学植物保护学院种子病理与杀菌剂药理实验室，公众可从中国农业大学获得。[0042]辣椒疫霉菌株LT1534:由美国田纳西大学KurtLamour教授馈赠，记载于"GenomeSequencingandMappingRevealLossofHeterozygosityasaMechanismforRapidAdaptationintheVegetablePathogenPhytophthoracapsici"，MolPlantMicrobeInteract，2012，公众可从中国农业大学获得。[0043]裂解酶、纤维素酶、甘露醇均购买自Sigma-Aldrich公司，货号分别为：L1412、C8546、M1902。[0044]培养基配方：[0045]PDA固体培养基:PDA固体培养基:称取马铃薯200g，削皮切块后置于1L蒸馏水中加热30分钟，用四层纱布过滤收集滤液后再次定容至1L，加入14g琼脂粉和18g葡萄糖煮沸，121°C湿热灭菌20分钟，即得。[0046]V8固体培养基：100mlV8蔬菜汁，1500转/分(5000g)下离心10min，取上清液与去离子水1:9比例稀释（100ml的上清液加入900ml去离子水），加入lg碳酸钙，15g琼脂，高压蒸汽灭菌（121°C)20min。[0047]NPB液体及NPBA固体培养基：125g青豌豆，1L去离子水，高压蒸汽灭菌（121°C)20min后，4层纱布过滤，取滤液，并添加如下各物质:K2HP〇41.0g，KN033.0g，MgS〇40.5g，CaCl20.lg，CaC〇32.0g，D-山梨醇5.0g，D-甘露醇5.0g，葡萄糖5.0g，酵母粉2.0g，维生素2.0ml，微量元素2.0ml，琼脂粉(配制固体培养基时）15g，并用去离子水定容至1L。高压蒸汽灭菌（121°C)20min。[0048]PM液体培养基：125g青豌豆，1L去离子水，高压蒸汽灭菌（121°C)20min后，4层纱布过滤，取滤液，加入91.lg甘露醇，lgCaCh，2g碳酸妈，并用去离子水定容至1L。高压蒸汽灭菌（121°C)20min。若制备PM固体培养基，1LPM液体培养基中添加10.5gAgar高压蒸汽灭菌即可。MMg培养液:0.4MD-甘露醇，15mMMgCl2,4mM2-(N-吗啡啉）乙磺酸(MES)，pH5.7;高压蒸汽灭菌（121°C)20min。[0049]pTOR载体:南京农业大学王源超实验室惠赠，记载于"邵菁亢，辣椒疫霉游动孢子群体效应的研究。2014年，中国农业大学，硕士学位论文"一文，公众可从中国农业大学获得。[0050]实施例1[005111.几丁质合酶PSCHS1基因的克隆[0052]1.1大豆疫霉总RNA的提取[0053]大豆疫霉菌株PS6在固体培养基V8上在25°C下黑暗培养6天后，从菌落边缘打取直径为5mm的菌饼接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，25°C黑暗培养6天后刮取菌丝，取30mg左右的菌丝，至于无RNase的2ml离心管中，并加入两颗直径5mm的钢珠，液氮冷冻后使用球磨仪研磨至粉末状。采用Promega公司的SVTotalRNA提取试剂盒提取大豆疫霉RNA，具体方法步骤参考试剂盒中植物组织RNA提取的说明。[0054]1.2大豆疫霉反转录第一链cDNA的合成[0055]第一链cDNA合成米用Takara公司的Prim^'Script?!?!'reagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)试剂盒进行。具体步骤如下：[0056](1)去除基因组DNA(10μ1反应体系）：5XgDNAEraserBuffer2μ1;gDNAEraserΙμL;总RNA2μ1;无RNase的超纯水5μ1。[0057](2)反转录反应(20μ1反应体系）：步骤（1)的反应液10μ1;5>CPrimeScript⑩Buffer24yl;F*HmcScripl?RTEnzymeMixIlyl;RTPrimerMixΙμL;无RNase的超纯水4μ1〇[0058]反应条件：37°(：151^11;851€58;4°(：保存。将获得的〇0财稀释4倍用于1^&1^1116PCR反应。[0059]1.3PSCHS1基因克隆[0060]设计克隆大豆疫霉几丁质合酶PSCHS1基因的引物，PSCHS1-F(SEQIDNo.l):ATGAGCGGCGCCCCGCCCCCGT;PSCHS1-R:(SEQIDNo·2):TTAGGCCGCCGAGGAGACGTCGTT。以步骤2获得的大豆疫霉基因组cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增产物回收后分别与Tl-simpleVector(全式金，北京)连接，并转化大肠杆菌T1，通过蓝白斑筛选、质粒DNA的酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明PSCHS1基因由2742个脱氧核苷酸组成(见SEQIDNo.3)，其编码913个氨基酸(序列见SEQIDNo.4)。[0061]2PSCHS1基因在大豆疫霉不同发育阶段的表达模式分析[0062]将不同发育阶段（即菌丝(MY);孢子囊(SP);游动孢子(Z0);休止孢(CY);菌丝侵染大豆叶片后1.511、311、611、1211、2411和4811)的大豆疫霉菌株?36的总1?祖(提取方法参照1.1大豆疫霉总RNA的提取)反转录合成的cDNA(参照1.2大豆疫霉反转录第一链cDNA的合成来合成cDNA)为模板，对PSCHS1基因进行荧光定量PCR检测。以大豆疫霉RPS基因、RPL13a基因和β-tublin基因中的脱氧核苷酸片段为内参。其中PSCHS1基因中的脱氧核苷酸片段用引物PSCHS1-RT-F和PSCHS1-RT-R扩增；大豆疫霉RPS基因中的脱氧核苷酸片段用引物RPS-F和RPS-R扩增;RPL13a基因中的脱氧核苷酸片段用引物RPL13a-F和RPL13a-R扩增;β-tublin基因中的脱氧核苷酸片段用引物β-tublin-F和β-tublin-R扩增。[0063]荧光定量PCR引物如下表所示：[0065]由RealtimePCR反应米用Takara公司的SYBR?PremixExTaqTM(PerfectRealTime)试剂盒，反应体系如下所示：[0068]反应条件如下所示:预变性:95°C30s;95°C5s，62°C30s，72°C34s，40个循环。[0069]使用AB]PR1SMS7500进行RealtimePCR反应，每个样品做三次重复，采用2-AACt的方法计算PSCHS1基因的相对表达量。[0070]结果如图1所示，目的基因PSCHS1的表达量从大豆疫霉孢子囊形成阶段开始出现上调，且PSCHS1在大豆疫霉侵染大豆叶片阶段表达量也显著上调，因此将这两个生长发育阶段作为研究重点。[0071]3.大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子和过表达转化子的获得[0072]3.1大豆疫霉PSCHS1基因的沉默表达载体和过表达载体的获得[0073]以大豆疫霉菌株PS6的cDNA为模板，采用引物PSCHS1-Xbal-F(SEQIDNo.13):TCTAGACTGCCCATTCATACGGTGTT(下划线部分为Xbal的识别酶切位点，用于沉默载体构建)和PSCHSl-EcoRI-R(SEQIDNo.14):GAATTCCTGCTGGAAGCCTTGGAACA(下划线部分为EcoRI的识别酶切位点，用于沉默载体构建）以及引物PSCHSl-EcoRI-F(SEQIDNo.15):GAATTCCTGCCCATTCATACGGTGTT(下划线部分为EcoRI的识别酶切位点，用于过量表达载体构建）和PSCHS1-Xbal-R(SEQIDNo.16):TCTAGACTGCTGGAAGCCTTGGAACA(下划线部分为XbaI的识别酶切位点，用于过量表达载体构建）进行PCR扩增。将扩增产物回收后分别与!^-simpleVector(全式金，北京)连接，并转化大肠杆菌T1，通过蓝白斑筛选、质粒DNA的酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序，并扩繁PT0R质粒用于酶切。酶切体系如下(酶购买自NEB):[0074][0075]在37Γ水浴中酶切5-15min。[0076]将酶切后的PSCHS1基因连接至酶切后的pTOR质粒中，连接体系如下（T41igase购买自NEB):pT0Rlyl;PSCHSl5μ1;5Χligationbuffer2yl;T41igase0·5μ1;超纯水1·5μ1;总体积1〇μ1。置于25°C条件下连接30min，转化大肠杆菌ΤΙ，通过抗性标记筛选、质粒DNA的酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序。[0077]利用载体引物进行pT0R-F(SEQIDNo.l7)TCACTCTCACGTGCCCAAGTCC和pT0R-R(SEQIDNo.18)TTGTATTAAATGCATAGACACA进行测序，在pTOR载体的酶切位点EcoRI和Xbal处正向插入如SEQID如.3所示的？30^1基因的重组质粒即为大豆疫霉?30^1基因的过表达载体。[0078]利用载体引物进行pT0R-F(SEQIDNo.l7)TCACTCTCACGTGCCCAAGTCC和pT0R-R(SEQIDNo.18)TTGTATTAAATGCATAGACACA进行测序，在pTOR载体的酶切位点EcoRI和Xbal处反向插入如SEQIDNo.3所示的序列的重组质粒即为大豆疫霉PSCHS1基因的沉默表达载体。[0079]3.2大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子和过表达转化子的获得[0080]采用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法制备大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子和过表达转化子。具体步骤如下：[0081]第一步，大豆疫霉菌株PS6的培养，如下：[0082](1)将大豆疫霉菌株PS6在V8固体培养基平板上于25°C下黑暗培养6天，从菌落边缘切取直径5mm的菌丝块重新转移到NPBA平板上，在NPBA平板25°C下黑暗培养7-10天。[0083](2)从菌落边缘切取2X2mm的菌丝块10块左右，放入装有60ml的三角瓶中，共培养3瓶，25°C条件下黑暗静止培养3天。[0084]第二步，大豆疫霉的原生质体转化[0085](1)静止培养3天后，1层纱布过滤，收集菌丝至50ml的离心管中，用约40ml的0.8MD-甘露醇漂洗菌丝，再次用约40ml的0.8MD-甘露醇漂洗菌丝。室温下75rpm的水平摇床上漂洗lOmin。[0086](2)配制酶液:0.15g裂解酶，0.06g纤维素，10ml0.8MD-甘露醇，8mlddH20,800y10.5ΜKCl，800yl0.5Μ2-(Ν-吗啡啉)-乙磺酸(MES)，400yl0.5ΜCaCl2。并过滤灭菌。[0087](3)向盛有步骤(2)配制的酶液的离心管中加已漂洗好的菌丝，室温下75rpm裂解菌丝35_50min。[0088](4)配置40%的PEG4000(6gPEG4000,3.75ml0.8MD-甘露醇，3ml0.5MCaCl2，3mlH2O)，室温下磁力搅拌至完全溶解，过滤灭菌后，盛于50ml的灭菌小烧杯中，放在冰上备用。[0089](5)酶解充分时，用事先包扎好2层聚酯人造纤维滤布(mira-cloth)的50ml烧杯来过滤菌丝以收集原生质体。然后将收集好的原生质体倒入50mlFalcon离心管中，4°C，524g，离心3min。[0090](6)原生质体离心收集后，弃上清，用30ml左右预冷的W5洗涤沉淀。4°C，524g，离心4min〇[0091](7)弃上清，用10ml左右W5溶液悬浮原生质体，并在冰上搁置30min。[0092](7)4°C，524g，离心4min。弃上清，加入MMg培养液以悬浮原生质体，并使原生质体的终浓度达到2X106/ml左右。[0093](8)室温放置lOmin，分装质粒(步骤一获得的大豆疫霉PSCHS1基因的沉默表达载体或过表达载体)至50ml的Falcon离心管中，每管40yg的质粒DNA。[0094](9)用剪过的枪头吸取lml原生质体加入上述Falcon离心管中，并将质粒与原生质体轻轻混匀，然后置于冰上l〇min。[0095](10)加入40%PEG4000溶液，每管加入1740μ1，轻柔混匀。PEG分3次加，每次加入580μ1〇[0096](11)PEG加入混匀后，放在冰上静止20min。[0097](12)20min后，每管中加入2mlPM培养基，混匀后冰上静置2min。[0098](13)静置2min后再加入8mlPM培养基，再静置2min。[0099](14)置2min后再加入10ml左右的PM培养基，混匀后，室温下静置培养14h，使原生质体再生。[0100](15)在699g下离心5min，弃去上清液。[0101](16)PM固体培养基冷却至一定温度时，加入终浓度为30μg/ml的G418，混匀后，将培养基倒入上述50ml的离心管中，与再生菌丝混勾。[0102](17)将混匀后的PM培养基和菌丝混合物倒入9cm培养皿中，晾干。25°C下黑暗培养3-4天，观察有无菌落长出。若是有菌落长出，则为疑似转化子，提取保存后用于下游的鉴定和分析实验。[0103]实验同时设置向大豆疫霉菌株PS6中仅转入pTOR标记质粒的对照。[0104]3.3大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子和过表达转化子的鉴定[0105]将经过上述3.2小节操作得到的转化子经遗传霉素(G418)抗性V8固体培养基平板25°C培养再次筛选，从菌落边缘打取菌丝块接种在铺有玻璃纸的V8平板上，25°C黑暗培养6天后刮取菌丝，参照前文方法提取转化子样品的RNA。经反转录合成第一链cDNA之后，进行荧光定量PCR验证。以大豆疫霉以大豆疫霉RPS基因、RPL13a基因和β-tublin基因为内参，以野生型大豆疫霉菌株PS6及转化pTOR标记质粒的大豆疫霉菌株PS6为对照。具体引物序列及操作参见本实施例的第2小节:PSCHS1基因在大豆疫霉不同发育阶段的表达模式分析。[0106]使用ABIPR丨SM3i7500进行RealtimePCR反应，每个样品做三次重复，采用2-AACt的方法计算PSCHS1基因的相对表达量。[0107]大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子的鉴定结果显示，作为对照的野生型大豆疫霉菌株PS6及转化pTOR标记质粒的大豆疫霉菌株均扩增出目的条带，而大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子几乎扩增不到目的条带。从大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子随机挑选三个分别标记为ST1-1、ST1_2和ST1-3。大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子的具体鉴定结果如图2所示，PSCHS1的沉默效率介于80%-90%之间。[0108]大豆疫霉PSCHS1基因的过表达转化子的鉴定结果显示，作为对照的野生型大豆疫霉菌株PS6及转化pTOR标记质粒的大豆疫霉菌株均扩增出目的条带，而大豆疫霉PSCHS1基因的过表达转化子扩增所得的目的条带更加清晰，信号更强。从大豆疫霉PSCHS1基因的过表达转化子随机挑选三个分别标记为0Τ1-1、0Τ1-2和0T1-3。大豆疫霉PSCHS1基因的过表达转化子的具体鉴定结果如图3所示，PSCHS1的过表达效率约为野生型的12-53倍。[0109]4.大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子和过表达转化子的生物学形状分析[0110]4.1菌丝生长速率检测[0111]将野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK和沉默转化子ST1-1、STl-2和ST1-3，以及PSCHS1基因的过表达转化子0T1-1、0Τ1-2和0T1-3接种于加有15mlV8固体培养基的9cm培养皿中央上，25°C黑暗条件下培养6天，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，每个菌株3次重复。由此得到菌丝生长速率。[0112]结果显示，与野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子〇(相比，沉默转化子31'1-1、31'1-2、31'1-3以及？3〇^1基因的过表达转化子01'1-1、01'1-2、0T1-3的菌落直径并无明显变化(图4)。[0113]4.2孢子囊数量和形态检测[0114]参照本实施例的第3小节(大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子和过表达转化子的获得）中的方法，制备10%V8固体和液体培养基，将野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK和沉默转化子31'1-1、31'1-2、31'1-3以及?30^1基因的过表达转化子0!'1-1、01'1-2、01'1-3接种于￥8培养基上，25°(：条件下黑暗培养6天，每株菌株用5mm打孔器打取菌饼10个，移入无菌培养皿中，加入20mlV8汁液体培养基，25°C黑暗培养3天后，用20ml去离子水冲洗，每隔30min冲洗1次，共冲洗5次，之后加10ml去离子水定容，置于25°C黑暗条件下6-8h后，通过显微镜观察菌饼上孢子囊产生的数量，3次重复。[0115]结果显示，PSCHS1基因的过表达转化子0Τ1-1、0Τ1-2、0Τ1-3与野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)和空载体对照转化子CK相比，孢子囊数量相当（图5)，并且有一定数量的孢子囊已经释放了游动孢子（图6);但是沉默转化子ST1-1、ST1_2和ST1-3孢子囊产生数量很少，大多呈球形且无游动孢子释放（图6)。这说明PSCHS1基因的表达量降低会影响大豆疫霉孢子囊的正常发育和数量，使得其生长阶段发育向后推迟。基于这一点，也能说明沉默转化子侵染寄主的能力减弱了。[0116]4.3游动孢子数量检测[0117]参照本实施例的第3小节(大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子和过表达转化子的获得）中的方法，制备10%V8固体和液体培养基，将野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK和沉默转化子ST1-1、ST1_2和ST1-3以及PSCHS1基因的过表达转化子0!'1-1、01'1-2、01'1-3接种于￥8培养基上，25°(：条件下黑暗培养6天，每株菌株用5mm打孔器打取菌饼10个，移入无菌培养皿中，加入20mlV8汁液体培养基，25°C黑暗培养3天后，用20ml去离子水冲洗，每隔30min冲洗1次，共冲洗5次，之后加10ml去离子水定容，置于25°C黑暗条件下12h后，用血球计数板测定各悬浮液的孢子浓度，以推算出单位面积各供试菌株的产孢量。[0118]结果显示，PSCHS1基因的过表达转化子0Τ1-1、0Τ1-2、0Τ1-3与野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)和空载体对照转化子CK相比，游动孢子数量相当（图7);但是沉默转化子31'1-1、51'1-2、511-3游动孢子数量很少（图7)。这说明？50^1基因的表达量降低会影响大豆疫霉游动孢子的产生，这与PSCHS1基因的表达量降低影响孢子囊的正常发育和数量密切相关。[0119]4.4转化子的离体叶片致病力[0120]采用上述方法制备野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK、沉默转化子31'1-1、31'1-2、31'1-3以及过表达转化子01'1-1、01'1-2、01'1-3的孢子悬浮液。配制孢子悬浮液并在显微镜下计数，计算每ml孢子悬浮液中的游动孢子数量。将孢子悬浮液的浓度稀释到1XlOVr1。收集孢子悬浮液后，取两层吸水纸铺在Φ15cm的培养皿中，倒入适量去离子水后放入玻璃支架，采健壮、等位、同龄的大豆叶片置于玻璃支架上面。将稀释后的孢子悬浮液接种于大豆叶片，每片叶片接种2滴，每滴10μ1，每组接种5片叶片。将培养皿封口后置于温度为25°C，湿度为70%条件下，12h光暗交替培养5d。每天观察症状，拍照记录。[0121]结果显示，接种野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)孢子悬浮液的叶片发病较快，在接种第3天时接种位点就出现坏死腐烂斑，并且病斑有扩大趋势，在接种第5天时病斑面积可达到3.lcm2。接种空载体对照转化子CK孢子悬浮液的叶片出现了相同症状，无菌水接种的大豆叶片没有出现病斑（图8);而用沉默转化子ST1-1、ST1-2、ST1_3及过表达转化子0Τ1-1、0Τ1-2、0Τ1-3的孢子悬浮液接种的大豆叶片在接种第4天在接种位点出现坏死性腐烂斑，强度显著减弱（病斑颜色比对照浅，面积比对照小），发病面积显著小于接种大豆疫霉野生型菌株PS6(WT)的叶片，在接种第三天时病斑面积仅介于0.4cm2-1.2cm2(图8)。[0122]4.5转化子的活体植株致病力[0123]采用上述方法制备野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)、空载体对照转化子CK、本实施例的第3小节(大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子和过表达转化子的获得)得到的沉默转化子31'1-1、31'1-2、31'1-3及过表达转化子01'1-1、01'1-2和01'1-3的孢子悬浮液。配制孢子悬浮液并在显微镜下计数，计算每ml孢子悬浮液中的游动孢子数量。将孢子悬浮液的浓度稀释到IXlOVr1。将游动班子悬浮液接种于黑暗条件下培养4天的"日本青"幼苗下胚轴处，距离子叶约1.5復。25°(：黑暗保湿培养4811，然后测量病斑直径并拍照。每个菌株接种10个幼苗下胚轴，实验重复至少3次。[0124]结果显示，接种野生型大豆疫霉(Phytophthorasojae)菌株PS6(WT)孢子悬浮液的幼苗接种48h时发病直径为4.9cm。接种空载体对照转化子CK孢子悬浮液的幼苗出现了相同症状，无菌水接种的大豆幼苗没有出现病斑（图9);而用本实施例的第3小节（大豆疫霉PSCHS1基因的沉默转化子和过表达转化子的获得)得到的沉默转化子ST1-1、ST1-2、ST1_3及过表达转化子0Τ1-1、0Τ1-2和0T1-3的孢子悬浮液接种的大豆幼苗发病程度著低于接种大豆疫霉野生型菌株PS6(WT)的叶片，在接种48h时发病直径介于0.5-2.4cm之间。[0125]上述实验按说明PSCHS1基因参与了大豆疫霉侵染寄主及导致大豆疫霉病程发生的过程，是重要的致病因子。[0126]实施例2[0?27]1·辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)几丁质合酶PCCHS基因的克隆[0128]操作同实施例1。[0129]不同之处在于：[0130]1)本实施例选用辣椒疫霉菌株LT1534,培养时间为4天。[0131]2)设计克隆辣椒疫霉几丁质合酶PCCHS基因的引物为PCCHS-F(SEQIDNo.19):ATGAGCGACCTTCCACCT;PCCHS-R(SEQIDΝο·20):TTACGCGACCGAGGAGAT。测序结果表明PCCHS基因由2745个脱氧核苷酸组成（见SEQIDNo.21)，其编码914个氨基酸（序列见SEQIDNo.22)〇[0132]2.PCCHS基因在辣椒疫霉不同发育阶段的表达模式分析[0133]操作同实施例1。[0134]不同之处在于：[0135]在进行靶标PCCHS基因荧光定量PCR检测时选用辣椒疫霉40S核糖体蛋白S3A基因(WS21)、Ubc基因和β-tublin基因中的部分脱氧核苷酸片段作为内参。其中靶标PCCHS基因中的脱氧核苷酸片段用引物PCCHS-RT-F和PCCHS-RT-R扩增;WS21中的脱氧核苷酸片段用引物WS2卜F和WS21-R扩增;Ubc基因中的脱氧核苷酸片段用引物UBC-F和UBC-R扩增;β-tublin基因中的脱氧核苷酸片段用引物β-tublin-F和β-tublin-R扩增。[0136][0137]结果如图10所示，目的基因PCCHS的表达量从辣椒疫霉孢子囊形成阶段开始显著上调，且PCCHS在辣椒疫霉侵染辣椒叶片阶段表达量也显著上调，因此将这两个生长发育阶段作为研究重点。[0138]3.辣椒疫霉PCCHS基因的沉默转化子的获得[0139]操作同实施例1。[0140]3.1在构建辣椒疫霉PCCHS基因的沉默表达载体时的不同之处在于：[0141]以辣椒疫霉菌株LT1534的cDNA为模板，采用引物PCCHS-XbaI-F(SEQIDNo.29):TCTAGAATGAGCGACCTTCCACCT(下划线部分为Xbal的识别酶切位点）和PCCHS_ClaI_R(SEQIDNo.30):ATCGATTTACGCGACCGAGGAGAT(下划线部分为Clal的识别酶切位点)进行PCR扩增。[0142]利用载体引物进行pT0R-F(SEQIDNo.l7)TCACTCTCACGTGCCCAAGTCC和pTOR-R(SEQIDNo.18)TTGTATTAAATGCATAGACACA进行测序，在pTOR载体的酶切位点Xbal和EcoRI处反向插入如SEQIDN〇21所示的序列PCCHS的重组质粒即为辣椒疫霉PCCHS基因的沉默表达载体。[0143]3.2在CaCl2_PEG介导的原生质体转化过程时的不同之处在于:第一步，辣椒疫霉菌株LT1534的培养，如下：[0144](1)将辣椒疫霉菌株LT1534在V8固体培养基平板上于25°C下黑暗培养4天，从菌落边缘切取直径5mm的菌丝块重新转移到NPBA平板上，在NPBA平板25°C下黑暗培养3-4天。[0145](2)菌株培养3-4天后，从菌落边缘切取2X2mm的菌丝块10块左右，放入装有60mlNPB的三角瓶中，共培养3瓶。25°C条件下黑暗静止培养2天。[0146]第二步，辣椒疫霉的原生质体转化[0147](1)静止培养2天后，1层纱布过滤，收集菌丝至50ml的离心管中，用约40ml的0.8MMannitol漂洗菌丝，再次用约40ml的0.8MMannitol漂洗菌丝。室温下75rpm的水平摇床上漂洗l〇min。[0148]3.3实验同时设置向辣椒疫霉菌株1^1534中仅转入?1'0財示记质粒的对照。[0149]3.4在进行辣椒疫霉PCCHS基因的沉默转化子鉴定时的不同之处在于:将辣椒疫霉沉默转化子经G418抗性V8固体培养基平板25°C培养再次筛选，从菌落边缘打取菌丝块接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，25°C黑暗培养4天后刮取菌丝。进行荧光定量PCR验证时以辣椒疫霉40S核糖体蛋白S3A基因(WS21)、Ubc基因和β-tub1in基因为内参，以野生型辣椒疫霉菌株LT1534及转化pTOR标记质粒的辣椒疫霉菌株LT1534为对照。具体引物和操作参见本实施例的第2小节。[0150]辣椒疫霉PCCHS基因的沉默转化子的鉴定结果显示，作为对照的野生型辣椒疫霉菌株LT1534及转化pTOR标记质粒的辣椒疫霉菌株均扩增出目的条带，而辣椒疫霉PCCHS基因的沉默转化子几乎扩增不到目的条带。从辣椒疫霉PCCHS基因的沉默转化子随机挑选三个分别标记为T22、T33和T62。辣椒疫霉PCCHS基因的沉默转化子的具体鉴定结果如图11所示，PCCHS的沉默效率介于60%-80%之间。[0151]4.辣椒疫霉PCCHS基因的沉默转化子的生物学形状分析[0152]4.1菌丝生长速率检测[0153]操作同实施例1。不同之处在于使用的材料为：野生型辣椒疫霉（Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK及沉默转化子T22、T33和T62。[0154]结果显示，与野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK相比，PCCHS基因的沉默转化子T22、T33和T62的菌落直径并无明显变化。[0155]4.2孢子囊数量和形态检测[0156]将野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK和沉默转化子T22、T33和T6接种于V8培养基上，光照培养5天。待辣椒疫霉形成大量孢子囊后，进行显微镜观察。同时，切取在V8固体培养基不同位置的样品，用2.5%(体积分数)戊二醛4°C固定过夜后送样至电镜室，进行扫描电镜观察。[0157]结果显示，沉默转化子T22、T33、T62与野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)和空载体对照转化子CK相比，孢子囊畸形，孢子囊数量显著下降（图12和图13)。进一步借助扫描电镜观察，结果如图14所示沉默转化子T22、T33和T62形成的少量孢子囊形态发生了畸形，乳突更加明显，且孢子囊内形成的内含物显著减少。[0158]4.3游动孢子数量检测[0159]将野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空载体对照转化子CK和沉默转化子T22、T33、T62接种于V8培养基上，25°C条件下黑暗培养3天，光照培养5天。待辣椒疫霉形成大量孢子囊，加入适量无菌蒸馏水置于4°C条件下30min，25°C条件下30min后，收集孢子悬浮液，镜检浓度。[0160]结果显示，沉默转化子T22、T33、T62与野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)和空载体对照转化子CK相比，如图15所示，游动孢子数量显著下降，这与上文提到的沉默转化子孢子囊数量显著下降，孢子囊形态发生畸形密切相关。[0161]4.4转化子的离体叶片致病力[0162]采用上述方法制备野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)，空载体对照转化子CK，沉默转化子T22、T33和T62的孢子悬浮液。配制孢子悬浮液并在显微镜下计数，计算每ml孢子悬浮液中的游动孢子数量。将孢子悬浮液的浓度稀释到1XlOVr1。收集孢子悬浮液后，取两层吸水纸铺在Φ15cm的培养皿中，倒入适量去离子水后放入玻璃支架，采健壮、等位、同龄的辣椒叶片置于玻璃支架上面。将稀释后的孢子悬浮液接种于辣椒叶片，每片叶片接种10滴，每滴l〇yL，每组接种5片叶片。将培养皿封口后置于温度为25°C，湿度为70%条件下，12h光暗交替培养3d。每天观察症状，拍照记录。[0163]结果显示，接种野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)孢子悬浮液的叶片发病较快，在接种第2天时接种位点就出现坏死腐烂斑，并且病斑有扩大趋势，在接种第三天时病斑面积可达到3.8cm2。接种空载体对照转化子CK孢子悬浮液的叶片出现了相同症状，无菌水接种的辣椒叶片没有出现病斑（图16);而用沉默转化子T22、T33和T62的孢子悬浮液接种的辣椒叶片在接种第3天在接种位点出现坏死性腐烂斑，强度显著减弱(病斑颜色比对照浅，面积比对照小），发病面积显著小于接种辣椒疫霉野生型菌株LT1534(WT)的叶片，在接种第三天时病斑面积仅介于0.2cm2-l.4cm2(图16)。[0164]4.5转化子的活体植株致病力[0165]采用上述方法制备野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)，空载体对照转化子CK，沉默转化子T22、T33和T62的孢子悬浮液。配制孢子悬浮液并在显微镜下计数，计算每ml孢子悬浮液中的游动孢子数量。将孢子悬浮液的浓度稀释到1XlOVr1。收集孢子悬浮液后，选取含有50个穴的穴盘种植辣椒，每个穴中播种2粒辣椒种子，将辣椒置于温室中培养，待辣椒长到六叶期时，进行活体接种试验。采用灌根的方法接种孢子悬浮液，每个穴接种3ml孢子悬浮液，每组接种30株辣椒幼苗，每天观察症状，拍照记录，7天后观察统计结果。[0166]病情参照以下标准划分为0-5级:0:植株健康；1:叶部变黄且茎部未坏死;2:茎部小面积坏死;3:茎部中等面积坏死，植株萎蔫;4:茎部大面积坏死，植株严重枯萎;5:植株死亡。[0168]结果显示，接种野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)孢子悬浮液的植株发病较快，在接种第3-4天时接种位点就出现茎部坏死，并且坏死有扩大趋势，在接种第七天时病情指数可达2-3级。接种空载体对照转化子CK孢子悬浮液的植株出现了相同症状，无菌水接种的辣椒植株没有出现病斑（图17);而用实施例3得到的沉默转化子T22、T33和T62的孢子悬浮液接种的辣椒植株在接种第5-6天在接种位点出现坏死，病情指数显著低于接种辣椒疫霉野生型菌株LT1534(WT)的叶片，在接种第七天时病情指数介于Ο-?级。[0169]上述实验按说明PCCHS基因参与了辣椒疫霉侵染寄主及导致辣椒疫霉病程发生的过程，是重要的致病因子。【主权项】1.一种几丁质合酶，其氨基酸序列为与如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列的相似性在75%以上，优选在80%以上，更优选在90%以上，最优选在95%以上且具有与如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的几丁质合酶，其特征在于，所述几丁质合酶包括存在于疫水霉目（SaproIegniales)和霜霉目（Peronosporales)，特别是白绣科(Albuginacece)、霜霉科(Peronosporaceae)和腐霉科(Pythiaceae)中的至少一种中的几丁质合酶;优选所述几丁质合酶包括存在于单轴霉属(Plasmopara)、腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)中的至少一种中的几丁质合酶；更优选所述几丁质合酶包括大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae)、马铃薯晚疫病菌（Phytophthorainfestans)、寄生疫霉（Phytophthoraparasitica)和葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)中的至少一种中的几丁质合酶;最优选所述几丁质合酶的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。3.-种能够编码如权利要求1或2所述的几丁质合酶的DNA序列；优选所述DNA序列为与如SEQIDNo.3所示的DNA序列的相似性在65%以上，进一步优选在75%以上，更优选在85%以上，特别优选在95%以上且具有与如SEQIDNo.3所示的DNA序列相同功能的DNA序列；最优选所述DNA序列如SEQIDNo.3所示。4.如权利要求3所述的DNA序列转录得到的RNA序列。5.-种能够抑制和/或杀灭卵菌(Oomycota)生长的方法，所述方法包括通过抑制如权利要求3所述的DNA序列的转录，或抑制如权利要求4所述的RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如权利要求1或2所述的几丁质合酶的活性来抑制和/或杀灭所述卵菌生长;优选所述卵菌包括水霉目（Saprolegniales)和霜霉目（Peronosporales)，特别是白绣科(Albuginacece)、霜霉科(Peronosporaceae)和腐霉科(Pythiaceae)中的至少一种中的几丁质合酶;优选所述几丁质合酶包括存在于单轴霉属(Plasmopara)、腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)中的至少一种中的几丁质合酶;更优选所述几丁质合酶包括大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae)、马铃薯晚疫病菌（Phytophthorainfestans)、寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)和葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)中的至少一种中的几丁质合酶。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法用于抑制和/或杀灭大豆、马铃薯、番茄、烟草、茄子、刺槐、腊梅和葡萄中的至少一种产生的卵菌病害。7.-种筛选卵菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述卵菌，当所述待检测物能够抑制如权利要求3所述的DNA序列转录，或抑制如权利要求4所述的RNA序列翻译，或抑制和/或失活如权利要求1或2所述的几丁质合酶的活性，则所述待检测物为所述卵菌的抑菌和/或杀菌剂。8.-种降低卵菌侵染寄主能力的方法，其包括通过抑制如权利要求3所述的DNA序列的转录，或抑制如权利要求4所述的RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如权利要求1或2所述的几丁质合酶的活性来降低所述卵菌侵染所述寄主的能力。9.一种检测卵菌中几丁质合酶转录水平的方法，其包括选取如权利要求3所述的DNA序列中的任意一段80-300bp，特别是150-200bp长的靶标序列来进行反转录荧光定量PCR检测;优选还包括内参序列。10.-种用于扩增如权利要求9所述方法中的所述靶标序列的引物序列，优选所述引物序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示；更优选用于扩增所述内参序列的引物序列如SEQIDNo.7-12所示。【文档编号】C12N15/11GK105886481SQ201610321982【公开日】2016年8月24日【申请日】2016年5月16日【发明人】刘西莉,张灿,王为镇,牟文君,蔡萌,刁永朝,刘利,刘鹏飞,李健强【申请人】中国农业大学