一组高特异识别盐酸克伦特罗，沙丁胺醇和莱克多巴胺的寡核苷酸适配子的制作方法
【专利摘要】本发明提供一组能同时识别盐酸克伦特罗和沙丁胺寡核苷酸适配子Apt?1，Apt?2和Apt?3，一条能高特异性识别盐酸克伦特罗的寡核苷酸适配子CLB?2，一条能高特异性识别沙丁胺醇的寡核苷酸适配子SAL?5，两条能高特异识别莱克多巴胺的寡核苷酸适配子RAC?5和RAC?6。基于Fe3O4磁性纳米颗粒分离的SELEX技术，将随机寡核苷酸文库通过生物素化标记的互补链固定在亲和素包被磁性纳米颗粒上，经过16轮筛选最终获得高特异亲和的寡核苷酸适配子。该适配体具有广阔的应用前景，能通过标记功能基团或荧光染料运用于食品中盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺的检测，为现今依赖抗体的检测方法提供了新的选择。
【专利说明】
一组高特异识别盐酸克伦特罗，沙丁胺醇和莱克多巴胺的寡 核苷酸适配子
技术领域
[0001]本发明涉及食品安全生物技术领域，特别涉及到利用SELEX技术(指数富集的配体 系统进化技术)分别筛选一组识别盐酸克伦特罗的寡核苷酸适配子，一组识别沙丁胺醇的 寡核苷酸适配子和一组识别莱克多巴胺的寡核苷酸适配子，为基于寡核苷酸适配子检测食 品中瘦肉精的应用提供科学依据和理论基础。
【背景技术】
[0002] 瘦肉精作为一种人工合成的β_肾上腺素受体激活剂，可以减少动物脂肪含量，增 加瘦肉率，同时促进动物生长，减少饲料用量，因而被用于畜牧生产。但是瘦肉精在动物体 内代谢缓慢，经过肉制品进入人体体内蓄积，使人体产生头晕、乏力、心悸，四肢麻木等中毒 症状，严重危害人类的健康。市场上主要使用的瘦肉精分子包括:盐酸克伦特罗(CLB)，沙丁 胺醇（SAL)和莱克多巴胺(RAC)。盐酸克伦特罗在1964年由美国科学家首次合成，在临床上 具有扩张支气管的作用，对防治支气管哮喘、慢性支气管炎，肺气肿等肺部疾病有良好的治 疗效果。后来被发现有促进肌肉发育和脂肪分解的作用，因此被大量添加在畜牧的饲料中 促进动物生长。由于非法添加盐酸克伦特罗受到严格监管和有效打击，沙丁胺醇和莱克多 巴胺作为一种新型的"瘦肉精"逐渐兴起，成为盐酸克伦特罗的替代品，也被人们滥用在动 物饲料中。盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺在动物体内代谢较慢，并大量残留在动物 体内，然后通过肉制品进入人体内并蓄积，导致人体中毒甚至死亡。因此，中国及世界各地 其他国家纷纷出台法律法规禁止瘦肉精在饲料和畜禽生产中使用。
[0003] 目前，盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺测定方法主要有分为仪器分析法和免 疫学方法。仪器分析法仪器分析法包括高效液相色谱(HPLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、胶束毛细管电色谱(CE)、薄层色谱法(TLC) 等，这些方法已经成功地被用于瘦肉精的检测。仪器分析法虽然具有重现性好，检测限低， 灵敏度高优势，但是检测设备较为昂贵，样品处理较为复杂，很难达到现场检测目的。免疫 学方法依赖抗原和抗体特异性结合的检测方法，该方法具有操作简单、灵敏度高，特异性 强，无需大型仪器等优点。但是，由于盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺都是小分子半抗 原，不具备免疫原性，需将其与 BSA等大分子载体蛋白结合制备完全抗原后才能刺激动物分 泌抗体，因此抗体制备不仅耗时繁琐而且成本昂贵，制备出的抗体也易受温度等环境因素 的影响。
[0004]寡核苷酸适配子是通过SELEX技术从体外合成的随机寡核苷酸单链文库中筛选而 得，能够以特定的结构与祀标高特异亲和的一段较短的单链DNA序列。如今，寡核苷酸适配 子已经广泛地应用于如靶标检测、酶抑制，受体调节和药物传递等各种领域。寡核苷酸适配 子相比抗体表现出极大的优势，除了具有较高的特异亲和性，寡核苷酸适配子筛选完全在 体外进行，筛选周期短，合成方便且成本低，易标记一些功能基团和报告分子，同时变性与 复性可逆且速度快，稳定好，受环境条件影响小，可长期保存。随着SELEX技术的不断完善进 步，已经筛选出各种靶标物的适配子，如小分子物质(有机染料，金属，药物，氨基酸，核苷酸 和肽等）、蛋白质(包括酶、抗体、基因调控因子，以及外源凝集素）、肿瘤细胞、病毒和致病菌 等。但目前尚无关于盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺的寡核苷酸适配子制备方法的研 究报道。本发明以食品或饲料中常见的非法添加剂盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺为 靶标，并与固定了随机寡核苷酸文库的Fe 304磁性纳米颗粒孵育，筛选获得一组识别盐酸克 伦特罗的寡核苷酸适配子，一组识别沙丁胺醇的寡核苷酸适配子和一组识别莱克多巴胺的 寡核苷酸适配子，制备的寡核苷酸适配子具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团和报告 分子，将广泛应用于食品和饲料中瘦肉精的快速检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一组识别盐酸克伦特罗的寡核苷酸适配子，一组识别沙丁 胺醇的寡核苷酸适配子和一组识别莱克多巴胺的寡核苷酸适配子，为开发瘦肉精的新型分 离富集或分析检测工具奠定良好基础。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种制备瘦肉精的寡核苷酸适配子的方法，它可以方 便、准确地获取与盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺高特异亲和的寡核苷酸适配子，效 果显著。
[0007] 本发明方法利用基于Fe3〇4磁性纳米颗粒分离的SELEX技术，将随机寡核苷酸文库 通过生物素化标记的互补链固定在亲和素包被Fe 304磁性纳米颗粒。以盐酸克伦特罗，沙丁 胺醇，莱克多巴胺作为靶标与固定文库孵育。通过16轮的SELEX反复筛选后，对富集文库进 行克隆测序，并分析代表序列的亲和力和特异性，最终获得一组识别盐酸克伦特罗的寡核 苷酸适配子，一组识别沙丁胺醇的寡核苷酸适配子和一组识别莱克多巴胺的寡核苷酸适配 子。
【附图说明】
[0008] 图1是基于Fe3〇4磁性纳米颗粒分离的SELEX技术的原理图。
[0009] 图2是序列△?乜、厶?七2、厶?卜3、0^-2、3厶1^-5，1^(：-5，1^(：-6的模拟二级结构图。
[0010]图 3 是序列Apt 1、Apt2、Apt-3、CLB-2、SAL-5，RAC-5，RAC-6 寡核苷酸适配体的饱和 结合曲线图。
[0011] 图4是序列4?衍^?七2^?卜3、0^-2、341^-5，1^(：-5，1^(：-6寡核苷酸适配体的特异 性试验结果。
【具体实施方式】：
[0012] 以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。
[0013] 实施例1:盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺特异性结合寡核苷酸适配子的 SELEX筛选1、体外化学合成初始随机寡核苷酸(ssDNA)文库及引物（由美国Integrated DNA Technologies公司完成），序列如下：
[0014] 5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3' (40N代表40个随机核 苷酸）；
[0015] 上游引物：：5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3'
[0016] 5'磷酸化下游引物:5' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'
[0017] 生物素化的文库互补短链PI :57 -Bio-AGCACGCATAGG-3'
[0018] 将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100μΜ|￡存液存于-20°C备用。
[0019] 2、随机ssDNA文库的固定与孵育
[0020] 第一轮筛选反应体系为600yL，lnmol ssDNA文库和短链P1以1:2摩尔量比加入BB 缓冲液（50mM Tris-HCl，5mM KCl，100mM NaCl，lmM MgCl2，pH 7.4)中混合均匀后，在95°C 加热lOmin，再转移至37°C下杂交互补3h。然后将互补杂交链与清洗后的600yg亲和素包被 的磁珠在37°C，130rpm下反应6h，通过亲和素和生物素的特异性结合，使ssDNA文库固定在 磁珠上。ssDNA固定化的磁珠采用BB缓冲液多次清洗，以去除非特异性结合的ssDNA AOOyL ssDNA固定化的磁珠溶液与混合靶标(盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺，初始浓度各为 O.lmM)在37°C下孵育2h，与靶标特异性亲和的ssDNA从磁珠上解离下来。在外加磁场作用 下，特异性亲和的ssDNA与靶标留在上清液中，并作为模板进行PCR扩增。
[0021] 3、PCR扩增及ssDNA单链制备
[0022]将阴性对照组和实验组孵育体系的上清液作为模板进行PCR扩增，50yL PCR扩增 体系为:5yL模板，lyL正向引物（ΙΟμ mol/L)，lyL磷酸化反向引物（10μηιο1/υ，lyL dNTPmix (5mmol/L)，0.5yL Taq DNA聚合酶(5U/yL)，5yL 10XPCR扩增缓冲液，36.5yL超纯水。热循 环参数为:94°C变性5min，接着94°C变性308,56°(：退火30 8,72°(：延伸308，进行20轮循环，然 后72°C延伸2min，最后4°C冷却。PCR产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用Gelred染 色后置于Bio-Rad凝胶成像仪拍照，验证PCR产物dsDNA大小是否为80bp，条带是否单一。PCR 产物采用PCR产物纯化试剂盒纯化。采用ND-1000微量紫外可见分光光度计测定纯化PCR产 物浓度，计算Lambda核酸外切酶加入量，保证Lambda核酸外切酶能够完全切除5'端磷酸基 团修饰的反向DNA链，以获得下一轮筛选的单链DNA。向纯化PCR产物中加入Lambda核酸外切 酶和1/10体积的酶切缓冲液在37°C下酶切反应lh，75°C下灭酶10min终止反应。酶切产物采 用8%变性聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素）电泳在250V下分离20min，凝胶在Gelred染色液中染 色15min后置于Bio-Rad凝胶成像仪下成像拍照，确定酶切是否完全，单链产物条带大小是 否正确。将酶切产物转移至1.5ml的离心管中并加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(V:V:V = 25: 24:1)，混合均匀30s呈白色乳状液体，4°C，2000rpm离心5min，4°C，8000rpm离心lmin，将上 层清液小心取出移至离心管中。再加入等体积氯仿:异戊醇(V:V = 24:1)，混匀，在上述相同 离心条件下离心并收集上清液。上清液中加入1/10体积3M的NaAC，充分混匀后再加入2倍体 积无水乙醇，混匀后放置-20 °C沉淀过夜。沉淀后溶液4 °C，14000rpm离心15min去上清后加 入200yL70%乙醇，上下颠倒洗净沉淀，再在4°C，14000rpm离心15min，去上清可见白色固体 沉淀，放置在50°C烘箱中干燥后加入200yL TE缓冲液溶解并采用ND-1000微量紫外可见分 光光度计测定纯化ssDNA的浓度。
[0023] 4、循环筛选
[0024]第二轮至第十一轮按照第一轮方法进行筛选，筛选反应体系为300yL。为增加筛选 压力，提高筛选寡核苷酸适配子的亲和性，加入固定体系中ssDNA文库量lOOpmol，并随着筛 选轮数的增加逐渐递减至20pmol，加入孵育体系的靶标混合物浓度由O.lmM逐渐递减至1μ Μ，孵育时间逐渐由2h递减至lh。为提高寡核苷酸适配子的特异性，从第三轮开始每隔一轮 进行一次反筛，ssDNA文库固定化磁珠先加入反筛物质盐酸肾上腺素、多巴胺盐酸盐、重酒 石酸去甲肾上腺素、硫酸异丙肾上腺素、亲和素孵育清洗后再与靶标孵育结合。同时从第十 二轮至十六轮，ssDNA文库分别单独与盐酸克伦特罗，沙丁胺醇，莱克多巴胺孵育，同时另外 两种分子加入反筛体系，以获得分别针对盐酸克伦特罗，沙丁胺醇和莱克多巴胺特异性结 合的寡核苷酸适配子。
[0025] 5、克隆测序与序列分析
[0026]筛选十六轮后，将分别针对盐酸克伦特罗，莱克多巴胺，沙丁胺醇三种靶标筛选的 PCR产物送上海生工生物技术有限公司进行DNA序列测定。针对每种靶标各测定获得40条序 列，采用DNAMAN和RNA Structure 4.6软件分别分析40条序列的同源性信息和二级结构。结 合软件分析结果，针对靶标盐酸克伦特罗将序列分为8个家族，从每个家族中选出1条结构 稳定，自由能级较低的候选寡核苷酸适配子共8条。针对靶标沙丁胺醇将序列分为10个家 族，从每个家族中选出1条结构稳定，自由能级较低的候选寡核苷酸适配子共10条。针对靶 标莱克多巴胺将序列分为9个家族，从每个家族中选出1条结构稳定，自由能级较低的寡核 苷酸适配子共9条。结果发现Apt-l，Apt-2，Apt-3同时出现在盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的候 选寡核苷酸适配子序列中。将挑选的候选寡核苷酸适配子由上海生工生物工程技术服务有 限公司合成5'端标记FAM序列，用于亲和力和特异性分析。
[0027] 6、三种瘦肉精寡核苷酸适配子的亲和力和特异性分析 [0028] 6.1亲和力分析
[0029] 基于氧化石墨烯氧化具有吸附单链DNA的特性，构建了寡核苷酸适配子亲和性验 证方法。将固定浓度的瘦肉精靶标（ΙμΜ)分别与与其对应一系列不同浓度（10，25，50，75， 100，150，200ηΜ)的候选寡核苷酸适配子进行孵育，总体积为300yL，37 °C避光孵育2h，并以 BB缓冲液代替靶标作为阴性对照组。孵育结合后加入最佳用量比的G0吸附未与靶标结合的 适配子，离心操作后采用F-7000荧光光度计测定上清液490nm激发下520nm发射的荧光强 度，实验设置三次平行重复，实验采用避光处理。以实验组相对阴性对照组的荧光强度作为 纵坐标，以适配子浓度作为横坐标，采用GraphPad Prism 5.0软件进行非线性回归拟合计 算适配子的解离常数Kd值，并绘制结合饱和曲线，从而获得能与盐酸克伦特罗，沙丁胺醇， 莱克多巴胺亲和力较好的寡核苷酸适配子，即解离常数较低的寡核苷酸适配子。（见表1)。
[0030] 表1.高亲和力的寡核苷酸适配子解离常数Kd值
[0033] 图3为序列4?衍^?七2^?卜3、0^-2、3六1^-5，1^(：-5及1^(：-6与对应靶标的饱和结合 曲线图。
[0034] 6.2特异性分析
[0035]根据5.1的分析结果，获得与盐酸克伦特罗亲和较好的Apt-1、Apt-2、Apt-3和CLB-2序列，与沙丁胺醇亲和较好的Apt-l、Apt-2、Apt-3和SAL-5序列，与莱克多巴胺亲和性较好 的RAC-5和RAC-6序列，其中Apt-1、Apt-2、Apt-3对盐酸克伦特罗和沙丁胺醇都具有高亲和 性。因此，将寡核苷酸适配子Apt-1、Apt-2、Apt-3，CLB-2，SAL-5，RAC-5、RAC-6进行特异性分 析。特异性实验分析盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的寡核苷酸适配子对反筛物质 (盐酸肾上腺素、多巴胺盐酸盐、重酒石酸去甲肾上腺素、硫酸异丙肾上腺素、亲和素）的结 合力。反筛物质与200nM的寡核苷酸适配子在37°C避光孵育2h，并以BB缓冲液代替靶标作为 阴性对照组。孵育结合后加入最佳用量比的G0吸附未与靶标结合的寡核苷酸适配子，离心 操作后采用F-7000荧光光度计测定上清液490nm激发下520nm发射的荧光强度，实验设置三 次平行重复，实验采用避光处理。结果显示Apt-l、Apt-2、Apt-3、CLB-2结合盐酸克伦特罗， Apt-Ι ^?丨-2^?丨-3,341^-5结合沙丁胺醇，1^(：-5和1^(：-6结合莱克多巴胺能力均强于其他 反筛物质，特异性试验结果如图3所示。因此，通过基于Fe 3〇4磁性纳米颗粒分离的SELEX技术 制备一组同时识别盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的寡核苷酸适配子4?卜1^?卜2^?卜3，一条 高特异性识别盐酸克伦特罗的寡核苷酸适配子CLB-2,一条高特异识别沙丁胺醇的寡核苷 酸适配SAL-5和两条高特异识别莱克多巴胺的寡核苷酸适配子RAC-5和RAC-6,为开发瘦肉 精的新型分离富集或分析检测工具奠定良好基础。为食品或饲料中盐酸克伦特罗，沙丁胺 醇，莱克多巴胺的检测提供重要基础。
[0036]本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同 替换或局部该进，都将视为在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一组能同时识别盐酸克伦特罗和沙丁胺寡核苷酸适配子Apt-1，Apt-2和Apt-3,一条 能高特异性识别盐酸克伦特罗的寡核苷酸适配子CLB-2,一条能高特异性识别沙丁胺醇的 寡核苷酸适配子SAL-5,两条能高特异识别莱克多巴胺的寡核苷酸适配子RAC-5和RAC-6,其 特征在于寡核苷酸适配子序列如序列表中序列1，2,3,4,5,6,7所示的序列。2. 如权利要求1中所述的寡核苷酸适配子，其特征在于其5'端或3'端可以进行FITC、氨 基、生物素或巯基化学修饰。3. 如权利要求1中所述的寡核苷酸适配子在食品或饲料中分离富集及分析检测盐酸克 伦特罗，沙丁胺醇和莱克多巴胺的应用。
【文档编号】C12N15/115GK105886512SQ201610128853
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月7日
【发明人】王周平, 巩文慧, 段诺, 吴世嘉, 夏雨, 马小媛
【申请人】江南大学