高表达外源蛋白的毕赤酵母株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了高表达外源蛋白的毕赤酵母株，它是转染了一种毕赤酵母表达系统表达质粒，所述的表达质粒，它是由下述方法制备的：用Bspt104和Sac Ⅱ双酶切pPICZαA和基因序列为ttcgaaacgCMSYMMatg? 目的基因?ccgcgg所示的基因，连接；序列表中所述的CMSYMM，其中：C=C,M=A/C,S=G/C,Y=C/T，在毕赤酵母AOX启动子作用下，在报告基因EGFP起始密码子ATG前面插入6个碱基（CMSYMM），EGFP表达量提高到100?200%。
【专利说明】
高表达外源蛋白的毕赤酵母株
技术领域
[0001] 本发明属生物技术领域，具体涉及在毕赤酵母Α0Χ启动子作用下高表达外源蛋白 的毕赤酵母株。
【背景技术】
[0002] 毕赤酵母(P.pastoris)，作为一种甲醇诱导型的酵母，可以将甲醇作为唯一的使 用碳源，已经成为基因工程生产外源蛋白最重要的工具，与其他表达系统而言，具有很多优 点，对于大肠杆菌表达系统而言，既具有操作简单、生产成本较低、外源蛋白高产量等优点， 同时还具有蛋白的翻译后加工修饰的作用;对于酿酒酵母而言，具有质粒表达的稳定性高、 表达菌株较稳定、分泌效率较高等的优点；对于哺乳动物表达系统而言，具有操作简单，培 养基低廉，生产过程中不易污染的特点;对于昆虫细胞表达系统而言，具有成本显著降低的 优点。
[0003] 基因的表达调控在蛋白表达过程中发挥重要的作用，基因表达分为DNA转录成RNA 和RNA翻译成蛋白质。转录是基因表达的初始阶段，在这个阶段进行调控，对于生物来说是 最为经济的。真核生物中，基因调控也是主要在转录水平上进行的。通过顺式作用元件和反 式作用因子的相互作用实现了真核生物的转录调控。生物体基因调控主要发生在这些顺式 作用元件上，如启动子、GC盒、CCAAT盒、增强子、沉默子、阻遏子，最近发现起始密码子ATG周 围碱基影响基因的转录效率，影响最终蛋白的产量。
[0004] 大量的实验结果表明起始密码子ATG周围序列对蛋白表达有不同程度的影响。 Tatematsu，K.，et al.在2014年发表的文章中研究了家蚕中的起始密码子ATG周围的序 列对重组蛋白表达量的影响。文章中比较了 50种家蚕的自身基因，发现AAAAATCAAAATGG序 列影响转录效率，之后他们利用EGFP和荧光素酶作为报告基因，构建了 8种由不同的序列组 成的质粒，这些序列长度为包括ATG在内的14个碱基，发现这些序列对基因转录和蛋白产量 有显著影响，并且具有组织特异性。Dai，C.，et al.在2007年发表的文章中报道:他们将 钾离子通道蝎毒素基因插入到pEGFP-ΝΙ真核表达载体的EGFP前面，并在融合蛋白的起始密 码子ATG前插入了Kozak序列GCCACC，发现插入Kozak序列GCCACC使得融合蛋白的表达量大 大升高，而未插入Kozak序列的基本上没有表达。Sano KI et al在2002年的文章中报道他 们在荧光素基因以及龙虾原肌球蛋白的起始密码子ATG前面插入了龙虾原肌球蛋白cDNA的 ATG前21个氨基酸，发现能显著的提高这两种蛋白的表达量。这些报道证明ATG周围序列对 于基因的表达具有极大的影响，但是目前尚未有人对毕赤酵母A0X1启动子介导下ATG周围 序列对基因表达的影响进行研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了提高外源基因毕赤酵母表达系统蛋白的表达量，而提供一种 在毕赤酵母Α0Χ启动子作用下，高表达外源蛋白的毕赤酵母株。
[0006] -种毕赤酵母表达系统表达质粒，它是由下述方法制备的：用Bsptl04和Sac Π 双 酶切pPICZaA和基因序列为ttcgaaacgCMSYMMatg-目的基因-ccgcgg所示的基因，连接； 序列表中所述的 CMSYMM，其中：C=C，M=A/C，S=G/C，Y=C/T; 所述的 CMSYMM 为:CCCGCC、CCCCCC、CCCGAA、CAGTGC、CATAGT 或 AACCCC; 所述的基因序列为SEP ID NO.6。
[0007] 高表达外源蛋白的毕赤酵母株，它是转染了上述的一种毕赤酵母表达系统表达质 粒。
[0008] 本发明提供了高表达外源蛋白的毕赤酵母株，它是转染了上述的一种毕赤酵母表 达系统表达质粒，所述的表达质粒，它是由下述方法制备的：用Bspt 104和Sac Π 双酶切 pPICZaA和基因序列为ttcgaaacgCMSYMMatg-目的基因-ccgcgg所示的基因，连接;序列表 中所述的CMSYMM，其中：C=C，M=A/C，S=G/C，Y=C/T，在毕赤酵母Α0Χ启动子作用下，在报告基 因 EGFP起始密码子ATG前面插入6个碱基(CMSYMM)，EGFP表达量提高到100-200%。
【附图说明】
[0009] 图 1 EcoRI和Sacn 双酶切重组质粒pPICZaA-EGFP电泳图（1:DNA Marker DL2000; 2:酶切前的重组质粒pPICZaA-EFGP; 3:酶切后的重组质粒）； 图2 PCR法筛选EGFP阳性转化菌株1:DNA分子标识物lOObp; 2-13:部分克隆酵母基因 组PCR产物； 图3普通视野和荧光视野下阴性(X-33)菌体的EGFP荧光检测，Scale bars: 15 mm; 图4普通视野和荧光视野下阳性克隆的菌体的EGFP荧光检测，Scale bars: 15 mm; 图5普通视野和荧光视野下阴性(X-33)菌体的EGFP荧光检测，Scale bars: 15 mm; 图6普通视野和荧光视野下阳性克隆上清的EGFP荧光检测，Scale bars: 15 mm。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1重组质粒PPICZaA-EGFP的构建 根据EGFP-pcDNA3.1质粒上EGFP基因序列（基因序列如SEP ID N0.1所示）及引物设计 原则，设计引物，PCR引物中引入了酶切位点EcoR I和Sac Π 。
[0011 ]上游引物：5'- gctgaattCatggccaccatggtgagc _3' 下游引物：5'_ CACCGCGGctacttgtacagctcgtccatg -3' PCR反应体系为
在PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：
将上述PCR反应得到的EGFP基因片段经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳验证，然后将PCR片段 和载体pPICZaA用EcoRI和SacII酶切消化，分别将消化后的质粒和PCR片段用UNIQ-10柱式 微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行胶纯化回收，琼脂糖凝胶电泳验证结果后，用T4 DNA连 接酶16 °C过夜连接。连接体系为：
将连接产物用热激转化法，转化到感受态DH5a大肠杆菌感受态细胞中，在LB+Zeocin平 板上筛选，挑取单菌落，培养扩增后用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0试剂盒提取质粒DNA，将提取的质粒用限制性内切酶EcoR I和Sac Π 37 °C过夜消 化，产物取2μ1进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证。如图1所示，将酶切鉴定质粒送金唯智生物科 技(北京)有限公司测序，序列如SEQ ID NO. 2所示(序列左侧为EcoR I，右侧为SacII)，最终 将序列正确的菌株标记为pPICZaA-EGFP。
[0012] 实施例2重组质粒pPICZaA-EGFP-1的构建 根据a信号肽序列和EGFP序列设计一对引物，并在上游引物中引入Pst I限制性内切酶 酶切位点，下游引物使用与构建pPICZaA-EGFP相同的引物。
[0013] 引物1:5 ' - GCTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACT-GCAGTTTTATTCGCAGCATC-3 ' 引物2:5'- CACCGCGGctacttgtacagctcgtccatg _3' PCR反应体系为：
在PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：
扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳验证后纯化回收，得到突变出Pst I酶切位点的PCR片 段，将上述反应得到的突变片段和载体pPICZaA用Bsptl041和SacII消化，酶切产物用琼脂 糖凝胶电泳验证后，按照UNIQ-10柱式微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行胶纯化回收，琼 脂糖凝胶电泳验证结果后，用T4 DNA连接酶16°C过夜连接。连接体系为：
转化大肠杆菌，在LB+Zeocin平板上筛选，挑取单菌落，培养扩增后用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0试剂盒提取质粒DNA，送金唯智生物科技(北京）有限 公司测序，测序正确的标记为pPICZαA-EGFP-l，序列如SEPIDN0.3所示。
[0014] 实施例3重组质粒pPICZaA-EGFP-n的构建 提取质粒pPICZaA-EGFP-Ι，0.8%的琼脂糖凝胶电泳验证质粒的质量，用Bspt 104 I和 Pst I双酶切质粒pPICZaA-EGFP-1，琼脂糖凝胶电泳验证后进行胶纯化回收双酶切产物； 同时将两条含有6个随机碱基的短寡核苷酸单链用退火缓冲液（10mM Tris pH8.0，50mM NaCl，ImM EDTA)稀释成浓度lOOpmol/yL的溶液，各取10yL与EP管仲，在水浴锅中95°C高温 变性5 m i η，自然缓慢冷却至室温，用T 4 D N A连接酶连接到胶回收产物上，得到重组质粒 pPICZaA-EGFP-n， 短寡核苷酸单链序列为： 引物 1:5 ' - CGAAACGNNNNNNATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA-3 ' 引物 2:5 ' -GTAAAAATTGAAGGAAATCTCATNNNNNNCGTTT-3 ' 连接体系如下：
16°C恒温水浴槽中过夜连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，在 LB+Zeocin平板上筛选，刮下平板上所有菌体，用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0试剂盒提取质粒DNA，成功获得重组质粒库pPICZaA-EGFP-n。
[0015] 实施例4酵母菌株的转化 用限制性内切酶SacI将质粒库pPICZaA-EGFP-n过夜消化，获得线性化的DNA，按照 invitrogen公司的毕赤酵母表达手册的点转化法转化到山梨醇法制备的感受态酵母细胞 中，在YPD+Zeocin平板上筛选，将生长出的酵母转化子采用CTAB法提取酵母基因组DNA，采 用PCR法对菌株进行鉴定，使用引物如下： 引物 1: GGGCGAGGAGCTGTTCAC 引物2: TCGTTGGGGTCTTTGCTC PCR反应体系为：
在PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：
PCR后约获得630bp长度片段，结果如图2所示，序列如SEP ID N0.4所示。
[0016] 实施例5起始密码子ATG前插入的六个碱基序列测定 起始密码子ATG前插入的六个碱基的具体序列，通过PCR结合测序的方法进行测定。取 提取的酵母基因组DNA为模板，使用如下引物： 引物1:5 '-ttctaacccctacttgacagca-3 ' 弓丨物2:5 '- gaacttcagggtcagcttgc-3 ' PCR反应体系为：
在PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：
PCR后约获得612bp长度片段，将PCR产物直接送金唯智生物科技(北京)有限公司用引 物1进行序列测定，序列如SEP ID NO.5所示。（插入序列每个克隆不一样，所以插入的六个 喊基用NNNNNN标识）。
[0017] 实施例6起始密码子ATG前插入的不同序列对EGFP的表达量及mRNA水平的影响 EGFP在激发光波长为488nm的蓝光或紫外光激发下，会产生不同强度的绿色荧光，用蔡 司焚光显微镜观察未插入任何序列的EGFP和插入不同序列的阳性克隆的菌体的焚光，放大 倍数为40倍，如图3-6,图3和图5为阴性对照，我们没有观察到荧光。图4阳性克隆的酵母菌 体在荧光显微镜下观察到布满绿色荧光，证明阳性菌株表达了绿色荧光蛋白，图6阳性克隆 的细胞培养液离心后上清液中观察到绿色荧光，证明菌株表达的绿色荧光蛋白分泌到细胞 外的培养基中。
[0018] 用酶标仪VICT0R3V 1420-012测定在ATG周围插入序列及未插入任何序列的EGFP 在488nm紫外光激发下的荧光值。插入序列的荧光值为阳性克隆的荧光值减去阴性对照组 的荧光值;变化率的计算方法为插入序列的荧光值减去未插入任何序列的荧光值的差值再 除以未插入任何序列的荧光值。
[0019] 使用Takra公司的试剂RNAiso Plus提取酵母总RNA，PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆转录成cDNA，接着采用荧光定量PCR法监测mRNA的表达水平，选择 ACT1为内参基因，EGFP为靶基因，设计扩增引物，每个阳性克隆平行做4组，通过ABI公司的 Step One Plus荧光定量PCR仪处理数据得到不同克隆的EGFP相对内参基因表达量的比值 RQ值，荧光强度变化率的模式大小基本与RQ值变化基本一致。
[0020] 荧光强度变化率如表1所示。
[0021] 内参基因 ACT1引物 引物1:5'- ATGGACGGAGTCATTGGTGGAGC -3' 引物2:5'- CTACCTACGACCGATGGGAACAC -3' EgFP表达量引物 引物1:5'_ CGACAAGCAGAAGAACGGCATCA _3' 引物2:5'- GAACTCCAGCAGGACCATGTGAT -3' PCR反应体系为：
在PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：
根据表1中ATG前插入的序列及荧光值变化率分析总结得出ATG前插入序列中A、T、C、G 出现的频率表。（C=C; M=A/C; R=A/G; W=A/T; S=G/C; Y=C/T; K=G/T; H=A/C/T; D=A/G/T; B=G/C/ T；N=A/G/C/T) 表2显著增强序列中A，T，C，G出现的频率表
表3中等程度增强序列中A，T，C，G出现的频率表
表4低程度增强序列中A，T，C，G出现的频率表
表5降低序列中A，T，C，G出现的频率表
在ATG前面插入6个随机碱基，荧光值及变化率如表1，将变化率高于100%的定义为显著 增强EGFP的表达量，序列特征为CMSYMM;将变化率在50-100%的定义为中等程度增强EGFP的 表达量，序列特征为RHSDYC;将变化率在0-50%的定义为低程度的增强EGFP的表达量，序列 特征为CMBNCB;将变化率降低的定义为降低EGFP的表达量，序列特征为KWBKTN。
[0022] mRNA水平分析：以未插入任何序列的EGFP作为对照组，将其RQ值默认为1，得到在 ATG前面插入序列的不同阳性克隆的RQ值，根据表1中的数据可以看出，mRNA表达量的高低 基本上与改造后的EGFP荧光强度变化一致，这说明，在ATG前面插入的序列是通过影响了 EGFP的转录，使得mRNA的水平发生改变，进而影响了蛋白质的最终产量，实现了基因的表达 调控。
[0023] 实施例7高表达EGFP酵母菌株的构建 根据pPICZaA-EGFP-1质粒上序列特征设计引物，在表达EGFP基因的菌株α信号肽序列 的起始密码子前插入序列CCCGCC，且在该引物中引入了酶切位点Bsptl04和Sac Π 。
[0024]引物1:5，- GCTTCGAAACGCCCGCCATGAGATTTCCTTC 引物2:5'- CACCGCGGctacttgtacagctcgtccatg _3' PCR反应体系为
在PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：
将上述PCR反应得到的带有六个增强基因表达的序列CCCGCC的PCR片段段经过0.8%的 琼脂糖凝胶电泳验证，并将载体pPICZaA及PCR产物用Bsptl04和SacII酶切消化，分别将消 化后的质粒和PCR片段用UNIQ-10柱式微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行胶纯化回收，琼 脂糖凝胶电泳验证结果后，用T4 DNA连接酶16°C过夜连接。连接体系为：
将连接产物用热激转化法，转化到感受态DH5a大肠杆菌感受态细胞中，在LB+Zeocin平 板上筛选，挑取单菌落，培养扩增后用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0试剂盒提取质粒DNA，将提取的质粒用限制性内切酶Bsptl04和Sac Π 37°C过夜消 化，产物取2μ1进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证。将酶切鉴定质粒送金唯智生物科技(北京)有 限公司测序，序列如SEQ ID如.6所示(序列左侧为8叩丨104，右侧为3&(：11)，最终将序列正 确的菌株标记为pP I CZa A-EGFP-2。
[0025]接着用限制性内切酶SacI将质粒库pPICZaA-EGFP-2过夜消化，获得线性化的DNA， 按照inv i trogen公司的毕赤酵母表达手册的点转化法转化到山梨醇法制备的感受态酵母 细胞中，在YPD+Zeocin平板上筛选，将生长出的酵母转化子采用CTAB法提取酵母基因组 DNA，采用PCR法对菌株进行鉴定，使用引物如下： 引物 1: GGGCGAGGAGCTGTTCAC 引物2: TCGTTGGGGTCTTTGCTC PCR反应体系为：
在PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：
PCR后约获得630bp长度片段。
[0026] 选择阳性转化子，在30°C，220转，BMGY培养基中培养36小时，离心收集菌体，用 BMMY培养基重悬继续诱导培养，第二天起，每天按照每10ml培养液加入甲醇50yL量加入甲 醇继续诱导，第四天，对选择的每个酵母目的基因 EGFP表达量进行测定，最终得到高水平表 达EGFP的酵母菌株。
[0027] 其余构建在起始密码子ATG前添加增强基因表达的序列CCCGAA;CAGTGC;CATAGT; AACCCC; CTGACA等序列的酵母菌株的方法与加入CCCGCC的方法相同。
【主权项】
1. 一种毕赤酵母表达系统表达质粒，其特征在于，它是由下述方法制备的：用Bspt 104 和Sac Π 双酶切pPICZaA和基因序列为ttcgaaacgCMSYMMatg-目的基因 -ccgcgg所示的基 因，连接，序列表中所述的CMSYMM，其中：C=C，M=A/C，S=G/C，Y=C/T。2. 根据权利要求1中所述的一种毕赤酵母表达系统表达质粒，其特征在于：所述的 CMSYMM为CCCGCC、CCCCCC、CCCGAA、CAGTGC、CATAGT或AACCCC。3. 根据权利要求1中所述的一种毕赤酵母表达系统表达质粒，其特征在于:所述的基因 序列为SEP ID NO.6所示。4. 高表达外源蛋白的毕赤酵母株，它是转染了权利要求1所述的一种毕赤酵母表达系 统表达质粒。
【文档编号】C12R1/84GK105886525SQ201610468884
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月25日
【发明人】张新民, 滕思莹
【申请人】吉林大学