一种抑制细胞色素p450基因表达的载体及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体及其构建方法，以及，一种干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制基因CYP81A6的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对除草剂显性敏感的水稻。使得敏感植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。
【专利说明】
一种抑制细胞色素 P450基因表达的载体及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种抑制细胞色素 P450基因表达的RNAi 植物表达载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 农作物杂种优势利用是农业增产重要手段之一。水稻是全世界最重要的粮食作物 之一，具有明显的杂种优势。中国是世界上首个成功实现杂交水稻商品化生产的国家，杂交 水稻使我国水稻产量提高了20%，全国杂交水稻常年种植面积已超过水稻年播种面积的 50%。"三系法"和"两系法"是目前杂交水稻制种的主要方法，但由于三系核质互作的基因 型限制及两系的光温敏在特殊条件下的不稳定，杂交水稻产业的发展已受到制约。美国先 锋公司的SPT技术利用转基因技术成功解决了杂交制种中的一系列问题，并于2012年在玉 米中实现商业化应用，水稻杂交制种也极有可能利用类似SPT技术实现更新换代。同时，转 基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛。然而转基因产品自诞生之日起产生的争 议，至今仍甚嚣尘上。因此，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染 其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。
[0003] 因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草 剂敏感的不育系是解决问题的有效手段之一。
[0004] 苯达松(bentazon)是一种苯并噻二唑类除草剂，属杂环类选择性化学除草剂，多 数阔叶类杂草和莎草科杂草对苯达松敏感，而包括水稻在内的禾本科和豆科植物则对其有 较强的耐药性，苯达松具有广谱，高效，低毒的特性。因此，苯达松用于清除稻田的阔叶类杂 草和莎草科杂草十分有效，而对水稻又十分安全(张集文(2010)水稻苯达松敏感突变研究 进展.中国水稻科学24 : 551-558)。水稻对苯达松抗性由一个单隐性基因细胞色素 P450 (CYP81A6)控制，该基因位于水稻第3号染色体上，参与苯达松在植物体内的羟基化脱毒过 程。苯达松敏感型突变体"如^118111"、180773"、"嘉浙1^"、"62 11113"和"62 11123"等都是由 于CYP81A6基因突变造成的。CYP81A6基因的突变，导致上述突变体无法在体内降解苯达松， 从而导致喷施苯达松除草剂时，植物死亡。同时，该细胞色素 P450也是磺酰脲类除草剂的作 用靶标，包含CYP81A 6突变基因或苯达松敏感的植物，在喷施磺酰脲类除草剂时，也会导致 死亡。
[0005] 因此，有必要开发出一种能够有效的影响水稻细胞色素 P450(CYP81A6)表达的技 术手段，从而为杂交水稻制种、培育转基因新品种、防止转基因逃逸等方面提供有效管控方 案。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种能够有效的影响水稻细胞色素 P450(CYP81A6)表达的植 物表达载体及其构建方法：
[0007] 为达到以上目的，本发明提供了一种抑制细胞色素 P450基因表达的RNAi植物表达 载体，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No. 1-3所示的DNA片 段所形成的发卡结构。
[0008] 其中，SEQ ID No.l所示的DNA片段为基于CYP81A6的长度为471bp的正向DNA片段， SEQIDNo.3所示的DNA片段为基于CYP81A6的长度为471bp的与SEQIDNo.l所示的DNA片 段反向互补的DNA片段。SEQ ID No.2为来自水稻Zinc finger基因的内含子序列（Rice intron)〇
[0009] SEQ ID No.l至3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发夹表达 盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成发 卡的"环"，SEQ ID No.l和3所示的DNA片段互补形成发卡的"莖"。
[0010] 其中，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物 组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。
[0011] 其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV 35S启动子或Actin 启动子;所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。优选的，当启动 子为水稻或玉米的Ubi启动子时，能够取得非常强的干扰CYP81A6基因表达的效果。
[0012] 所述终止子包括:N0S终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序 列。优选的，所述终止子为N0S终止子。
[0013] 所述RNAi植物表达载体还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动 子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子，CAMV 35S启动子或 Actin启动子，优选的，当启动子为CAMV 35S启动子时，能够取得良好的驱动选择标记基因 在植物中超量表达的效果。所述终止子为N0S终止子或Ub i终止子，优选为N0S终止子。
[0014] 所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因（如⑶S基因、荧光素酶基因等）、荧光 标记基因（如荧光蛋白基因）、抗生素标记基因（可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉 素、卡那霉素基因）、除草剂筛选标记基因（如抗草甘膦基因、抗双草醚基因等)或抗化学试 剂标记基因（如抗除莠剂基因等）。特别优选的，所述标记基因为潮霉素基因。
[0015] 在本发明的一种优选的实施方式中，所述的RNAi植物表达载体是将SEQ ID No.l 所示的DNA片段插入到植物双元转化载体pTCK303的BamH I和Cla I位点间，得到中间载体 l;再将SEQIDNo.3所示的DNA片段插入到所述中间载体l的KpnI、XholI位点间，所得到 的RNAi植物表达载体pTCK303-P450i-3。
[0016] 特别优选的，所述的RNAi植物表达载体，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
[0017] 其中，所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。
[0018] 值得注意的是，用于RNAi植物表达载体构建的中间载体和具有选择标记基因的 RNAi表达载体，工程菌及包含P450i-3茎环结构的细胞、愈伤组织、转基因苗、种子等均属于 本发明的保护范围。
[0019] 本发明的另一个方面还提供了一种RNAi植物表达载体的构建方法，所述方法包 括:将SEQ ID No.l所示的DNA片段插入到植物双元转化载体pTCK303的BamH I和Cla I位点 间，得到中间载体l;将SEQIDN0.3所示的DNA片段插入到所述中间载体l的KpnI、Xh 0lI 位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-P450i-3。
[0020] 具体的，所述方法可以按照以下步骤进行：
[0021] (1)设计引物，正向引物所带酶切位点为Κρη I和Cla I，反向引物所带酶切位点为 Xho1 I和BamH I。
[0022] P450RNAi-F3 GGGGTACCATCGATCGCATCCGTCGGCAAC
[0023] P450RNAi-R3 CCGCTCGAGGGATCCGGCCTGCACATGGCCT
[0024] (2)RNAi植物表达载体的构建与转化
[0025] 以水稻cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增P450i-3基因片段。扩增体系及程 序如下：
[0026] 程序：94°(：预变性5-1〇111丨11，94°(：变性3〇8,59°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,3〇-35个循 环，72°C再延伸30s;16°C结束。
[0028] 获得PCR产物片段，回收后，连接pMD18-T载体(Takara)，命名为pMD18-T-P450i-3。 采用的植物双元转化载体为PTCK303,按照酶切位点，分别切pTCK303载体及pMD18-T-P450i-3,将内切（酶切位点为BamH I、Cla I)获得的目的片段连入pTCK303载体的Rice Intron(SEQ ID No.2所示序列）一端，将该载体命名为pTCK303-P450i-3a。以pTCK303-p450i-3a为载体，按照酶切位点，分别切pTCK303-P450i-3a与pMD18-T-P450i-3，将外切（酶 切位点为Kpn I、Xho I)获得的目的片段连入pTCK303-P450i-3a载体的Rice Intron另一 端，获得载体 pTCK303-P450i-3。
[0029]本发明还提供了一种本发明所述的RNAi植物表达载体在干扰植物细胞色素 P450 基因 CYP81A6表达制备除草剂显性敏感植物中的应用。
[0030] 本发明的RNAi植物表达载体可通过农杆菌介导遗传转化法、基因枪法、花粉管通 道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
[0031] 优选的，所述应用包括将pTCK303-P450i-3导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组 织。所述愈伤组织可以为花药诱导的愈伤组织、成熟胚诱导的愈伤组织、幼胚诱导的愈伤组 织、幼穗诱导的愈伤组织。
[0032]本发明的一个方面还提供了一种获得除草剂显性敏感植物的方法，包括将所述 RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物细胞色素 P450基因 CYP81A6表达。
[0033]在本发明的一种实施方式中，所述获得除草剂显性敏感植物的方法包括：
[0034] (1)构建RNAi植物表达载体:将SEQ ID No. 1所示的DNA片段插入到植物双元转化 载体PTCK303的BamH I和Cla I位点间，得到中间载体1;将SEQ ID如.3所示的0嫩片段插入 到所述中间载体1的Kpn I、Xhol I位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-P450i-3;
[0035] (2)转化:将pTCK303-P450i-3导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后 的愈伤组织进行诱导分化获得除草剂显性敏感植物。
[0036] 其中，所述RNAi植物表达载体pTCK303-P450i-3具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序 列。
[0037] 其中，所述除草剂可以为苯达松或磺酰脲类除草剂。所述植物为水稻，优选的，所 述植物为转基因水稻株系。
[0038] 本发明利用RNAi技术，构建了一个针对水稻细胞色素 P450(CYP81A6)的植物双元 转基因载体。将该载体转化水稻，成功抑制了该基因的表达，并将水稻从对苯达松或磺酰脲 类除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对苯达松或磺酰脲类除草剂显性敏感的水 稻。使得转基因植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交 水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有非常重要的应用价值。
【附图说明】
[0039] 图1为P450i-3 RNAi载体的构建流程图
[0040] 图2为pTCK303-P450i-3 RNAi载体经BamH I和Xhol I双酶切的电泳图。图中1为未 酶切的重组质粒，图中2为酶切的重组质粒，Μ为D15 0 0 0 m a r k e r，所切出的片段大小为 1432bp，包括目的片段的正向、反向互补序列及水稻内含子序列。
[0041] 图3为转基因株系潮霉素抗性基因 PCR检测电泳图；1，H20;2,阴性对照（中花11非 转基因植株）；3，阳性对照;4-20，转基因敏感株系;Μ，Marker。
[0042] 图4为pTCK303-P450i-3转基因 TO代三叶期幼苗对0.25g/L苯达松溶液敏感度测 试。枯萎死亡的均为敏感株系。
[0043] 图5为pTCK303-P450i-3转基因幼苗细胞色素 P450基因 CYP81A6的表达量。其中WT 为中花11作为阴性对照，其余为转基因株系。
[0044] 图6对比例1中苯达松敏感的P450i转基因株系T0代3-5叶期幼苗对10g/L以上浓度 苯达松溶液敏感度测试。其中22、23、24、60为独立?450丨转基因株系
【具体实施方式】
[0045]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0046] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0047] 实施例1菌株、质粒的获得及PCR引物的合成
[0048] (1)菌株和质粒
[0049]作为骨架载体的植物双元转化载体PTCK303包含潮霉素抗性基因、玉米Ubi启动子 及N0S终止子;pMD18_T克隆载体(Takara)。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH5a;农杆 菌(Agrobacterim tumefacieus)菌株为EHA105。
[0050] (2)PCR引物序列
[00511 设计正向引物所带酶切位点为Κρη I和Cla I，反向引物所带酶切位点为Xhol I和 BamH I0
[0052] P450RNAi-F3 GGGGTACCATCGATCGCATCCGTCGGCAAC
[0053] P450RNAi-R3 CCGCTCGAGGGATCCGGCCTGCACATGGCCT
[0054]实施例2RNAi植物表达载体的构建与转化
[0055] 为了构建细胞色素 P450基因 CYP81A6的干扰载体，以水稻cDNA为模板，利用实施例 1引物进行PCR扩增P450i-3基因片段。扩增体系及程序如下：
[0056]程序：94°(：预变性5-1〇111丨11，94°(：变性3〇8,59°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,3〇-35个循 环，72°C再延伸30s;16°C结束。
[0059]扩增出471 bp与预期大小相符的基因片段，回收后，连接pMD 18-T载体(Takara)，命 名为pMD18-T-P450i-3,经测序验证片段序列正确。采用的植物双元转化载体为pTCK303(如 图1A所示），按照酶切位点，分别切pTCK303载体及pMD 18-T-P450i-3，将内切（酶切位点为 BamH I、Cla I)获得的目的片段连入pTCK303载体的Rice Intron-端（图1B所示），连接产 物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，重组质粒经酶切，目的片段大小符合预期，该载体命名为 pTCK303-P450i-3a。以 pTCK303-P450i-3a 为载体，按照酶切位点，分别切 pTCK303-P450i-3a 与pMD18-T-P450i-3,将外切(酶切位点为Kpn I、Xhol I)获得的目的片段连入pTCK303载体 的Rice Intron另一端（图1C)，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，重组质粒经BamH I 和Xhol I双酶切，目的片段大小符合预期（图2)，并将重组子送测序验证正确，即为以Rice Intron为环，构建的P450i-3 RNAi载体，将此载体命名为pTCK303-P450i-3。
[0060]实施例3农杆菌转化水稻及转基因植株鉴定
[0061 ] 将pTCK303-P450i-3重组质粒导入农杆菌EHA105菌株，并转化粳稻中花11愈伤组 织，经潮霉素抗性筛选，分化，生根获得再生转基因株系25株，通过PCR鉴定转基因植株中转 入的潮霉素抗性基因，结果显示，PCR阳性植株20株（图3)，将阳性植株移栽至泥土中，成活 17株。
[0062]实施例4水稻苯达松敏感与抗性转基因株系的获得
[0063]为了检测所设计干扰载体片段在转基因植株中的效果，用48%苯达松母液(常州 精度生物科技有限公司）配制〇.25g/L苯达松溶液，喷施pTCK303-P450i-3转基因 T0代三叶 期幼苗，按l〇〇ml/m2计算，喷施量为0.01-0.05g/m2，喷后连续观察。喷施后4d，P450i-3转基 因 TO代幼苗部分株系叶片叶尖卷曲枯黄;喷施后7d，P450i-3转基因 17个株系中，有10个株 系出现不可逆死亡，属于高度敏感株系;有3个株系之前叶片枯萎严重但逐渐恢复生长，属 于中度敏感株系;还有4个株系喷施前后无明显变化，属于抗性株系（图4)。需要强调的是， 虽然本实施例用〇.25g/L苯达松喷施筛选苯达松敏感转基因株系，但筛选敏感株系并不限 于0.25g/L，0.1g/L为本发明所应用的苯达松最低浓度。以上结果表明，我们成功获得了除 草剂显性敏感的转基因材料。
[0064] 实施例5细胞色素 P450基因 CYP81A6表达量的检测
[0065] 为了进一步确定干扰载体片段所导致的除草剂显性敏感，是由于其对细胞色素 P450基因 CYP81A6的抑制造成的，我们检测了CYP81A6基因的表达量。分别取转基因敏感株 系、中度敏感株系、抗性株系叶片各2个株系，以中花11作为阴性对照，提取总RNA，并进行反 转录获得cDNA。在Thermo PikoReal96实时荧光定量PCR系统中，以Actin基因为内参，检测 CYP81A6基因的表达。反应体系及程序如下：
[0066] RT-PCR 引物序列：
[0068]荧光定量PCR反应体系及程序如下：
[0069] 程序:94°C预变性7min，94°C变性15s，55°C退火158;72°(：延伸158(荧光检测）；40 个循环;60 °C保温，30s。溶解曲线程序:60-95 °C (每升高0.2 °C，保持1 s); 20 °C保温，10s;结 束。
[0071] 程序:94°C预变性7min，94°C变性15s，55°C退火158;72°(：延伸158(荧光检测）；40 个循环。溶解曲线程序:60-95°C (每升高0.2°C，保持1 s); 20°C保温，1 Os;结束。
[0073]荧光定量PCR扩增结果显示，目标基因和内参基因的熔解曲线峰均为单一峰形，形 状锐利。提示各样品熔解温度均一，扩增产物特异性好，未见非特异的双链DNA产物或引物 二聚体。扩增曲线光滑平稳，荧光吸收图谱的S形曲线形状完好，符合定量检测要求。采用比 较阀值法（2-^巧去）进行相对定量（Liva K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and 2(_Delta Delta C (T))Method[J].Methods，2001,25(4) :402-408.)结果表明，转基因敏感株系中CYP81A6基 因的表达剧烈下调，仅为野生型对照的6 %-7 %，说明P450i-3干扰片段对CYP81A6基因的表 达有极强的抑制作用（图5，敏感株系7-2、敏感株系38-2代表不同的转基因株系）；中度敏感 株系中CYP81A6基因的表达也显著下调，约为野生型对照的30%-41%左右，对CYP81A6基因 的表达也起到显著的抑制作用（图5,中度敏感株系76-2、中度敏感株系80-2代表不同的转 基因株系）；但抗性株系中，该基因表达并未呈现明显变化（图5、抗性株系6-2和抗性株系 50-2代表不同的转基因株系）<XYP81A6基因在对照和各转基因敏感、中度敏感、抗性株系中 的表达与这些株系对苯达松的敏感程度相吻合，表明转基因株系对苯达松的敏感的确是由 于CYP81A6基因的表达下调造成的。以上结果表明，P450i-3干扰片段及pTCK303-P450i-3的 植物双元转化载体可成功用于抑制细胞色素 P450基因 CYP81A6的表达，并培育除草剂显性 敏感的材料。
[0074]实施例6敏感株系各生育期对苯达松的敏感度测试
[0075]为了检测显性敏感株系在不同生育期对苯达松的敏感程度，在不同生育期对其进 行苯达松临界浓度测试。
[0076]以野生型ΖΗ11作为对照，转基因敏感株系苗期（五叶期之前）喷施苯达松溶液 0.01-0.2g/m2，喷施后连续观察，10d~15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常 生长。
[0077]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系初分蘖期喷施苯达松溶液0.25-0.5g/ m2，喷施后连续观察，10d~15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
[0078]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系最大分蘖期喷施苯达松溶液0.5-0.65g/ m2，喷施后连续观察，10d~15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
[0079]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系孕穗期喷施苯达松溶液0.65-0.8g/m2， 喷施后连续观察，l〇d~15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
[0080]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系苗抽穗期喷施苯达松溶液0.8-1.2g/m2， 喷施后连续观察，l〇d~15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
[0081 ]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系开花后7d喷施苯达松溶液1.2-1.8g/m2， 喷施后连续观察，l〇d~15d后，敏感株系出现不可逆死亡，但野生型却正常生长。
[0082] 实施例7敏感株系各生育期对磺酰脲类除草剂的敏感度测试
[0083] 为了检测显性敏感株系在不同生育期对磺酰脲类除草剂的敏感程度，我们在不同 生育期对其进行磺酰脲类除草剂如苄嘧磺隆临界浓度测试。
[0084]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系苗期(五叶期之前)喷施苄嘧磺隆溶液1-5mg/m2，喷施后连续观察，5d~10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
[0085]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系初分蘖期喷施磺苄嘧磺隆溶液5-15mg/ m2，喷施后连续观察，5d~10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
[0086]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系最大分蘖期喷施苄嘧磺隆溶液15-20mg/ m2，喷施后连续观察，5d~10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
[0087]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系孕穗期喷施苄嘧磺隆溶液20-35mg/m2， 喷施后连续观察，5d~10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
[0088]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系抽穗期喷施苄嘧磺隆溶液35-40mg/m2， 喷施后连续观察，5d~10d后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
[0089]以野生型ZH11作为对照，转基因敏感株系开花后7d喷施苄嘧磺隆溶液40-50mg/ m2，喷施后连续观察，5d~lOd后，敏感株系出现生长停滞，但野生型却正常生长。
[0090] 对比例1
[0091] 按照Lin等先前报道的方法（Lin C，Fang J，Xu X，Zhao T，Cheng J，Tu J，Ye G， Shen Z(2008)A built-in strategy for containment of transgenic plants:creation of selectively terminable transgenic rice.PLoS One 3:el818)构建发卡结构并利用 中花11制备获得苯达松敏感的转基因株系。
[0092] 对苯达松敏感的转基因株系分别喷施浓度为0.5g/L和1 g/L的苯达松，结果发现没 有任何一棵转基因株系被杀死。当对转基因株系喷施l〇g/L以上浓度苯达松时才有表型，且 苯达松敏感的表型率较低，表明按照此方法设计的P450 i对内源基因的干扰效率较低。苯达 松敏感的P450i转基因株系T0代3-5叶期幼苗对10g/L以上浓度苯达松溶液敏感度测试结果 见图6,图6中22、23、24和60代表不同的株系的编号。
[0093]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种抑制细胞色素 P450基因表达的RNAi植物表达载体，其特征在于，含有发卡结构 表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No. 1-3所示的DNA片段所形成的发卡结 构。2. 根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，所述发卡结构表达盒还包括 位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下 游的终止子， 其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV 35S启动子或Actin启动 子;所述植物组织特异性启动子为Rub i s co小亚基启动子或Cab启动子。3. 根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，还包括选择标记表达盒，所 述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启 动子、CAMV 35S启动子，或Actin启动子;所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因、荧光 标记基因、抗生素标记基因、除草剂筛选标记基因或抗化学试剂标记基因，所述终止子为 NOS终止子或Ub i终止子。4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。5. -种RNAi植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括:将SEQ ID No. 1所 示的DNA片段插入到植物双元转化载体pTCK303的BamH I和Cla I位点间，得到中间载体1; 将SEQ ID No.3所示的DNA片段插入到所述中间载体1的Kpn I、Xhol I位点间，得到RNAi植 物表达载体 pTCK303-P450i-3。6. 权利要求1-4中任意一项所述的RNAi植物表达载体在干扰植物细胞色素 P450基因 CYP81A6表达制备除草剂显性敏感植物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括将pTCK303-P450i-3导入农杆菌 EHAl 05菌株，并转化植物愈伤组织。8. -种获得除草剂显性敏感植物的方法，其特征在于，包括将权利要求1-4中任意一项 所述的RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物细胞色素 P450基因 CYP81A6表达。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括： (1) 构建RNAi植物表达载体:将SEQ ID No. 1所示的DNA片段插入到植物双元转化载体 PTCK303的BamH I和Cla I位点间，得到中间载体1;将SEQ ID No.3所示的DNA片段插入到所 述中间载体1的Kpn I、Xhol I位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-P450i-3; (2) 转化:将pTCK303-P450i-3导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈 伤组织进行诱导分化获得除草剂显性敏感植物。
【文档编号】A01H5/00GK105886526SQ201610249721
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】黄培劲, 安保光, 欧阳超, 陈思兰, 吴永忠
【申请人】海南波莲水稻基因科技有限公司