酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法，通过单因素试验和响应面优化试验，确定了碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解制备扁杏杏仁抗氧化肽的最佳工艺条件：酶用量6725U/g、底物浓度3％、酶解温度60℃、pH8.28，经3次平行试验验证，得到的酶解液对OH的清除率的平均值为84.18％，DH的平均值为20.87％，还原力的平均值为0.743，并采用透析袋、凝胶色谱技术、高效液相色谱HPLC、半制备液相RP-HPLC对AAMH进行进一步分离纯化，并采用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪技术和Edman降解法对分离纯化得到的扁杏杏仁抗氧化肽的结构进行了鉴定。
【专利说明】
酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法
技术领域
[0001]本发明涉及扁杏杏仁抗氧化肽的制备方法，具体涉及一种酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法。
【背景技术】
[0002]随着营养学及生物技术的不断发展，研究者们发现，蛋白质经消化道酶分解后并不是以游离氨基酸为主要的吸收形式，而是以介于氨基酸和蛋白质之间的短肽的形式被机体吸收。生物活性肽是介于氨基酸和蛋白质之间的一种短肽，其具有易被人体吸收利用、安全性高、生产成本较低等特点，并充当肠道消化过程中的新陈代谢潜在生理效应物。近年来大量研究表明，利用合适的蛋白酶水解食源性蛋白质可制备生物活性肽，并且将能够清除体内自由基的一类生物活性肽称为抗氧化活性肽，简称抗氧化肽。由于利用蛋白酶从食源性物质中制备的抗氧化肽，不仅具有良好的抗氧化活性，而且酶法水解制备的短肽产物具有营养价值较高、摄入后副作用小、水解条件温和、产品深度开发前景广等特点，广受国内外学者青睐。从已有的报道中可以看出，多种食源性蛋白质经酶解制得的抗氧化活性肽均具有良好的抗氧化活性，如Moure等研究了经超滤酶解后所得的大豆蛋白浓缩物的酶解片断具有抗氧化性能，其中抗氧化活性最强的是分子量小于1kDa的肽片断；Chen等人通过用商业蛋白酶和碱性蛋白酶制备的花生酶解液，具有很好的抗氧化活性，并且预测花生酶解液可作为一种很好的天然抗氧化剂，是一种人类可食用的健康食品；Parrad0等酶解米糠蛋白发现，由6-30个氨基酸组成的米糠肽，具极好的抗氧化活性。但是由于蛋白酶具有专一性，单一蛋白酶的作用位点少，肽得率较低，而碱性蛋白酶经常被研究者用作工具酶，但由于其在酶解过程中需要不断加入NaOH来维持体系pH的平衡，这对后续处理的工作量加大，因此，选用复合酶对蛋白质进行酶解，逐渐成为人们研究的热点，因为利用复合酶制备生物活性肽，不仅有利于其产率的提高，而且当利用内切酶与外切酶联合制备时，其所得多肽的苦味物质要比单独使用内切酶制得的多肽的苦味物质小。
[0003]扁杏杏仁是一种营养价值极高的仁用杏，富含脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和膳食纤维等营养成分。脱脂后的杏仁柏蛋白质含量高达50%以上，但目前大部分被用于饲料或制成功能性较差的杏仁粉，经济利用价值和产品附加值均较低。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明提供了一种酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
[0006]酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法，包括如下步骤:
[0007]S1、取扁杏杏仁500g，于45°C恒温水浴锅中浸泡2h，手工去皮，置于50°C的干燥箱中烘干，粉碎并过80目筛制得扁杏杏仁柏；
[0008]S2、将所得的扁杏杏仁柏和石油醚在30_60°C下，以1: 5(W/V)的比例混合，在室温下不断搅拌脱脂5h，真空抽滤，回收石油醚，以上工艺重复3次后，将所得扁杏杏仁柏置于通风厨中挥发有机溶剂48h，得脱脂扁杏杏仁柏，在4°C下保存；
[0009]S3、取脱脂扁杏杏仁柏若干，用蒸馏水配置成浓度为2-4%的溶液，置于50°C的恒温震荡水浴锅中，预热30min，调节PH至7.5-8.5，按5000-10000U/g的比例加入碱性蛋白酶-风味蛋白酶复合酶，碱性蛋白酶:风味蛋白酶的酶活比为3: 2，55-65°(:下，酶解2.511后，将酶解液于90°C的水浴锅灭酶15min，终止反应，待冷却至室温后，以4000r/min离心20min，取上清液冷冻干燥即得扁杏杏仁酶解液；
[0010]S5、向经处理后一端封好的透析袋中加入2/3的扁杏杏仁肽酶解液，将另一端封好，置于盛有500mL双蒸水的烧杯中，用磁力搅拌器不断搅拌，每隔4h换水一次，直到透出液不再有颜色变化，将透出液在50 0C的旋转蒸发仪浓缩，将浓缩液冷冻干燥24h，得到了分子量大于3500Da的组分A和分子量小于3500Da的组分B ；
[0011]S6、将经过处理后的葡聚糖凝胶Sephadex G_25装柱(1.6 X 60cm);称取透析袋截留量小于3500Da的组分B的冻干粉若干，溶于双蒸水中，配成50mg/mL的溶液，取2mL溶液上柱，选用超纯水作为洗脱液，并用蒸馏水以0.3mL/min的流速洗脱；将洗脱组分分管收集，每5min收集一管；重复上样，合并每次分离时相同位置的组分峰，将所收集的组分峰冷冻干燥，得组分B1、组分B2、组分B3和组分B4 ；
[0012]S7、将所得4个组分进行抗氧化活性测定，并将具有较强抗氧化活性的组分B4配制成浓度为40mg/mL，用葡聚糖凝胶Sephadex G_15继续进行进一步分离纯化，按出峰先后顺序分别记作组分B4a和组分B4b，分别重复牧集同一时间的各组分，并进行冷冻干燥；
[0013]S8、将组分 B4b 经 RP-HPLC (Zorbax SB-C18 4.6 X 250 X 5um) Agilent 1260 分离后，收集得到 10 个主要组分，分别记作 B4b-1，B4b-2，B4b-3，B4b_4，B4b_5，B4b_6，B4b_7，B4b-8，B4b-9，B4b-10，重复进样，多次收集各组分，并分别将其冷冻干燥；
[0014]S9、通过测定各组分的DPPH清除率，筛选出抗氧化活性较强的两个组分B4b-4和B4b-6 ;采用MALD1-T0F-MS质谱分析法测得抗氧化活性肽B4b_4和B4b_6的分子量为674.1Da和567.9Da ;采用Edman降解法对组分B4b_4和B4b_6的N-端氨基酸序列进行测定，得到组分B4b-4的氨基酸序列为Val-Leu-Tyr-1lt-Trp ;组分B4b_6的氨基酸序列为Ser-Val-Pro-Tyr-Glu0
[0015]优选的，酶用量为6725.65U/g、底物浓度为2.98%、酶解温度为60.54 °C、pH为
8.28 ο
[0016]本发明具有以下有益效果:
[0017]通过单因素试验和响应面优化试验，确定了碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解制备扁杏杏仁抗氧化肽的最佳工艺条件:酶用量6725U/g、底物浓度3%、酶解温度60°C、pH8.28，经3次平行试验验证，得到的酶解液对OH的清除率的平均值为84.18%, DH的平均值为20.87%，还原力的平均值为0.743，并采用透析袋、凝胶色谱技术、高效液相色谱HPLC、半制备液相RP-HPLC对AAMH进行进一步分离纯化，并采用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪技术和Edman降解法对分离纯化得到的扁杏杏仁抗氧化肽的结构进行了鉴定，从而为开发具有高附加值的扁杏杏仁抗氧化活性肽提供理论基础和试验依据。
【附图说明】
[0018]图1为本发明实施例中AAMH和透析后组分的抗氧化活性示意图。
[0019]图2为本发明实施例中sephadex G_25分离AAMH所得成分的示意图
[0020]图3为本发明实施例中sephadex G_25分离组分的抗氧话活性的示意图
[0021]图4为本发明实施例中Sephadex G_15分离AAMH所得成分的示意图。
[0022]图5为本发明实施例中Sephadex G_15分离组分的抗氧化活性的示意图。
[0023]图6为本发明实施例中组分B4b纯度检测色谱图。
[0024]图7为本发明实施例中半制备RP-HPLC分离组分B4b的图谱
[0025]图8为本发明实施例中RP-HPLC洗脱组分的抗氧化活性示意图。
[0026]图9为本发明实施例中组分B4b-4的MALD1-TOF-MS图谱。
[0027]图10为本发明实施例中组分B4b-6的MALD1-TOF-MS图谱。
【具体实施方式】
[0028]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0029]本发明实施例提供了一种酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0030]S1、取扁杏杏仁500g，于45°C恒温水浴锅中浸泡2h，手工去皮，置于50°C的干燥箱中烘干，粉碎并过80目筛制得扁杏杏仁柏；
[0031]S2、将所得的扁杏杏仁柏和石油醚在30_60°C下，以1: 5(W/V)的比例混合，在室温下不断搅拌脱脂5h，真空抽滤，回收石油醚，以上工艺重复3次后，将所得扁杏杏仁柏置于通风厨中挥发有机溶剂48h，得脱脂扁杏杏仁柏，在4°C下保存；
[0032]S3、取脱脂扁杏杏仁柏若干，用蒸馏水配置成浓度为2-4%的溶液，置于50°C的恒温震荡水浴锅中，预热30min，调节PH至7.5-8.5，按5000-10000U/g的比例加入碱性蛋白酶-风味蛋白酶复合酶，碱性蛋白酶:风味蛋白酶的酶活比为3: 2，55-65°(:下，酶解2.511后，将酶解液于90°C的水浴锅灭酶15min，终止反应，待冷却至室温后，以4000r/min离心20min，取上清液冷冻干燥即得扁杏杏仁酶解液；
[0033]S5、向经处理后一端封好的透析袋中加入2/3的扁杏杏仁肽酶解液，将另一端封好，置于盛有500mL双蒸水的烧杯中，用磁力搅拌器不断搅拌，每隔4h换水一次，直到透出液不再有颜色变化，将透出液在50 0C的旋转蒸发仪浓缩，将浓缩液冷冻干燥24h，得到了分子量大于3500Da的组分A和分子量小于3500Da的组分B ；
[0034]AAMH通过透析袋初步分离为分子量大于3.5KDa (记为组分A)和小于3.5KDa (记为组分B)两个组分。将各个组分冷冻干燥后，配制成浓度为6mg/mL的溶液，测定各个组分的还原能力，.0H清除率以及DPPH清除率，并以相同浓度的AAMH和Vc做对比。由图1可以看出，组分A和组分B均具有较强的抗氧化能力，而组分B对.0Η清除能力显著性高于组分A和原液(P < 0.05)，且在P < 0.05水平上与Vc的清除能力没有显著性差异，其.0H的清除率为76.6% ;组分B对DPPH的清除率和还原力分别为70.2%和0.75，均显著性高于扁杏杏仁酶解原液(P < 0.05)，由此说明，小分子肽具有更好的抗氧化活性，因此选择分子量小于3.5KDa的肽类，即组分B进行进一步的分离纯化。
[0035]S6、将经过处理后的葡聚糖凝胶Sephadex G_25装柱(1.6 X 60cm);称取透析袋截留量小于3500Da的组分B的冻干粉若干，溶于双蒸水中，配成50mg/mL的溶液，取2mL溶液上柱，选用超纯水作为洗脱液，并用蒸馏水以0.3mL/min的流速洗脱；将洗脱组分分管收集，每5min收集一管；重复上样，合并每次分离时相同位置的组分峰，将所收集的组分峰冷冻干燥，得组分B1、组分B2、组分B3和组分B4 ；
[0036]葡聚糖凝胶Sephadex G_25的分离结果如图2所示。透析初步分离得到的分子量小于3500Da组分B，经过葡聚糖凝胶S印hadex G_25分离后得到了 4个组分，按分子量从小到大的顺序，分别命名为B1、B2、B3和B4。其中组分84的分子质量最小，洗脱体积最大。最后将所收集到的各组分进行冷冻干燥。
[0037]测定组分B1、B2、B3和B4的抗氧化活性，以对.0H和DPPH的清除能力以及还原力作为评价指标，并以相同浓度Vc的抗氧化活性作为对照，其结果如图3所示。由图3可以看出各个组分均具有较强的清除.0H和DPPH能力，也表现出一定的还原能力。Vc及各组分对.0H的清除能力的强弱顺序为:组分B4 > Vc >组分B3 >组分B2 >组分BI，其中清除能力最强的组分B4对.0H清除率为86.8%，在P < 0.05水平上显著性高于其他3个组分，略低于Vc的清除率87.7 %。各组分及Vc对DPPH清除能力由强到弱的顺序为:组分B4 > Vc >组分B2 >组分B3 >组分BI，对DPPH的清除能力最强的组分B4的清除能力为78.9%，在P < 0.05水平上显著性高于Vc及其他3个组分。组分B4的还原力为0.85，在P < 0.05水平上显著性高于其他3个组分低于Vc的还原能力。对抗氧化活性最强的组分B4进一步采用葡聚糖凝胶Sephadex G_15进行分离纯化。
[0038]S7、将所得4个组分进行抗氧化活性测定，并将具有较强抗氧化活性的组分B4配制成浓度为40mg/mL，用葡聚糖凝胶Sephadex G_15继续进行进一步分离纯化，按出峰先后顺序分别记作组分B4a和组分B4b，分别重复收集同一时间的各组分，并进行冷冻干燥；
[0039]将经葡聚糖凝胶Sephadex G_25分离得到的抗氧化活性最强的组分B4用截留量小于1500Da的葡聚糖凝胶Sephadex G_15进一步进行分离，结果如图4所示。由图4可以看出，组分B4又被分离成2种主要组分和其他一些小组分，将这两个主要组分按出峰先后顺序分别记作组分B4a和组分B4b，分别重复收集同一时间的各组分，并进行冷冻干燥，其抗氧化活性如图5所示。由图5可以看出，葡聚糖凝胶Sephadex G_15分离得到的各组分对.0Η和DPPH有较好的清除能力，同时各组分也体现出一定的还原能力。组分B4b对.0Η的清除率和还原力分别为79.3%和0.75，接近于Vc的清除率88.8%和还原力0.89，且显著性高于组分B4a(p < 0.05);组分B4b对DPPH的清除率为74.6%，与Vc没有显著性差异，且显著性高于组分Ma (P < 0.05)。综上所述，组分Mb的抗氧化能力优于组分B4a，同时组分B4b较组分B4a出峰晚，分子量小。
[0040]S8、将组分 Mb 经 RP-HPLC (Zorbax SB-C18 4.6 X 250 X 5um) Agilent 1260 分离后，收集得到 10 个主要组分，分别记作 B4b-1，B4b-2，B4b-3，B4b_4，B4b_5，B4b_6，B4b_7，B4b-8，B4b-9，B4b-10，重复进样，多次收集各组分，并分别将其冷冻干燥；
[0041]S9、通过测定各组分的DPPH清除率，筛选出抗氧化活性较强的两个组分B4b-4和B4b-6 ;采用MALD1-T0F-MS质谱分析法测得抗氧化活性肽B4b_4和B4b_6的分子量为674.1Da和567.9Da ;采用Edman降解法对组分B4b_4和B4b_6的N-端氨基酸序列进行测定，得到组分B4b-4的氨基酸序列为Val-Leu-Tyr-1lt-Trp ;组分B4b_6的氨基酸序列为Ser-Val-Pro-Tyr-Gluο
[0042]应用高效液相色谱HPLC，对分离纯化得到的组分Mb进行纯度检测，检测结果如图6所示。图6显示，虽然只有一个主峰，但杂峰也比较多，说明样品不是单一成分，其纯度达不到后续分析所需在95%以上的纯度，因此需要进一步分离纯化。
[0043]本具体实施通过对DH模型进行典型性分析，确定最优条件下OH.的清除率、水解度和还原力。通过用Design Expert7.0软件分析，获得碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解制备扁杏杏仁抗氧化肽的最优条件如下:酶用量为6725.65U/g、底物浓度为2.98%、酶解温度为60.540C、pH为8.28，酶解液对OH.清除率的理论值为85.64%,水解度的理论值为21.46%,还原力的理论值为0.759。为检验响应面方法的可行性，并综合考虑实际操作的便利性，将工艺参数修正为:酶用量6725U/g、底物浓度30Z0、温度60°C、pH8.28，经3次平行试验验证，得到OH.的清除率为84.18%, DH的平均值为20.87%，还原力的平均值为0.743，分别与理论值相差1.7%,2.75%和2.22%，属于允许误差范围，说明利用该模型对碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解制备扁杏杏仁抗氧化肽的工艺参数优化是可行的，得到的工艺参数具有实际应用价值。
[0044]如图7所示，扁杏杏仁抗氧化肽的组分B4b经RP-HPLC(Zorbax SB-C18
4.6 X 250 X 5um(Agilent.USA) Agilent 1260 (Agilent.USA)分离后，收集得到 10 个主要组分，分别记作 B4b-1，B4b-2，B4b_3，B4b_4，B4b_5，B4b_6，B4b_7，B4b_8，B4b_9，B4b_10，重复进样，多次收集各组分，并分别将其冷冻干燥。图8为扁杏杏仁抗氧化肽，经RP-HPLC分离得到的各组分的抗氧化活性测定结果。由图7可以看出组分B4b-6对DPPH的清除能力最强，达到了 80.2%，组分B4b-4次之，其对DPPH.的清除能力为76.9%。并进行下一步的结构鉴定分析。
[0045]扁杏杏仁抗氧化肽组分B4b_4和组分B4b_6的质谱分析如图9和图10所示，MALD1-T0F-MS试验结果显示，分别在分子量为674.1Da和567.9Da左右有一个比较大的峰。
[0046]经测定，扁杏杏仁抗氧化肽组分B4b_4的氨基酸序列为Val-Leu-Tyr-1It-Trp ;组分B4b-6的氨基酸序列为Ser-Val-Pro-Tyr-Glu，与MALD1-TOF-MS测得的分子质量相符。
[0047]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法，其特征在于，包括如下步骤: 51、取扁杏杏仁500g，于45°C恒温水浴锅中浸泡2h，手工去皮，置于50°C的干燥箱中烘干，粉碎并过80目筛制得扁杏杏仁柏； 52、将所得的扁杏杏仁柏和石油醚在30-60°C下，以1: 5(W/V)的比例混合，在室温下不断搅拌脱脂5h，真空抽滤，回收石油醚，以上工艺重复3次后，将所得扁杏杏仁柏置于通风厨中挥发有机溶剂48h，得脱脂扁杏杏仁柏，在4°C下保存； 53、取脱脂扁杏杏仁柏若干，用蒸馏水配置成浓度为2-4%的溶液，置于50°C的恒温震荡水浴锅中，预热30min，调节PH至7.5-8.5，按5000_10000U/g的比例加入碱性蛋白酶-风味蛋白酶复合酶，碱性蛋白酶:风味蛋白酶的酶活比为3: 2，55-65°C下，酶解2.5h后，将酶解液于90°C的水浴锅灭酶15min，终止反应，待冷却至室温后，以4000r/min离心20min，取上清液冷冻干燥即得扁杏杏仁酶解液； 55、向经处理后一端封好的透析袋中加入2/3的扁杏杏仁肽酶解液，将另一端封好，置于盛有500mL双蒸水的烧杯中，用磁力搅拌器不断搅拌，每隔4h换水一次，直到透出液不再有颜色变化，将透出液在50 °C的旋转蒸发仪浓缩，将浓缩液冷冻干燥24h，得到了分子量大于3500Da的组分A和分子量小于3500Da的组分B ； 56、将经过处理后的葡聚糖凝胶S印hadexG_25装柱；称取透析袋截留量小于3500Da的组分B的冻干粉若干，溶于双蒸水中，配成50mg/mL的溶液，取2mL溶液上柱，选用超纯水作为洗脱液，并用蒸馏水以0.3mL/min的流速洗脱；将洗脱组分分管收集，每5min收集一管；重复上样，合并每次分离时相同位置的组分峰，将所收集的组分峰冷冻干燥，得组分B1、组分B2、组分B3和组分B4 ； 57、将所得4个组分进行抗氧化活性测定，并将具有较强抗氧化活性的组分B4配制成浓度为40mg/mL，用葡聚糖凝胶Sephadex G_15继续进行进一步分离纯化，按出峰先后顺序分别记作组分B4a和组分B4b，分别重复收集同一时间的各组分，并进行冷冻干燥； 58、将组分B4b经RP-HPLCAgilent 1260分离后，收集得到10个主要组分，分别记作B4b-1，B4b-2，B4b_3，B4b_4，B4b_5，B4b_6，B4b_7，B4b_8，B4b_9，B4b_10，重复进样，多次收集各组分，并分别将其冷冻干燥； 59、通过测定各组分的DPPH清除率，筛选出抗氧化活性较强的两个组分B4b-4和B4b-6 ;采用MALD1-TOF-MS质谱分析法测得抗氧化活性肽B4b_4和B4b_6的分子量为674.1Da和567.9Da ;采用Edman降解法对组分B4b_4和B4b_6的N-端氨基酸序列进行测定，得到组分B4b-4的氨基酸序列为Val-Leu-Tyr-1lt-Trp ;组分B4b_6的氨基酸序列为Ser-Val-Pro-Tyr-Glu02.根据权利要求1所述的一种酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法，其特征在于，酶用量为6725.65U/g、底物浓度为2.98%、酶解温度为60.54°C、pH为8.28。
【文档编号】C12P21/06GK105886587SQ201510469332
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年7月30日
【发明人】张海生
【申请人】陕西师范大学