Chka基因在制备食管癌诊治产品中的应用
【专利摘要】本发明公开了CHKA基因可以作为食管癌早期诊断的分子标志物。本发明的实验证明，与正常食管组织相比，食管癌组织中的CHKA基因表达显著升高，且经过RNA干扰实验证明CHKA能够影响食管癌细胞的增殖。根据本发明的研究成果，可以研发能够抑制CHKA基因表达的药物，从而实现临床上对于食管癌的预防和治疗。
【专利说明】
CHKA基因在制备食管癌诊治产品中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及CHKA基因在食管癌的诊断、治疗中的用途。
【背景技术】
[0002] 食管癌作为一种消化系统恶性肿瘤，严重威胁人们身体健康、影响生活质量。据流 行病学调查显示，我国是全球食管癌的高发地带，每年因食管癌死亡人数达15万余人，位居 世界食管癌死亡人数的第一位。食管癌的发生与饮食习惯、致癌物质、疾病、遗传、环境等因 素都密切相关。目前，治疗食管癌的临床方法主要有手术疗法、放射疗法、化疗药物疗法、包 括内镜疗法在内的非手术疗法等。但食管癌早期诊断困难，且恶性程度高，一经诊断，已至 晚期，所以目前食管癌的治疗效果和预后仍然很差，5年生存率仍低于30%。随着分子生物 学在肿瘤病因学研究方面的发展，人们对食管癌的发病原因逐步有了新的认识。目前普遍 认为食管癌的发生涉及多种因素，多种基因，并且在多阶段发挥作用，利用在分子生物手段 对其早期诊断、治疗及预防具有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种可用于食管癌早期诊断的分子标志物。相比现有的食 管癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断食管癌的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患 者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 本发明提供了检测CHKA基因表达的产品在制备诊断食管癌的工具中的应用。
[0006] 进一步，所述检测CHKA基因表达的产品包括检测CHKA基因 mRNA水平的产品、和/或 检测CHKA蛋白水平的产品。
[0007] 进一步，所述检测CHKA基因表达的产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检 测、原位杂交或芯片检测CHKA基因表达以诊断食管癌的产品。
[0008] 进一步，所述用RT-PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增CHKA基因的引 物;所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增CHKA基因的引物;所述用 免疫检测诊断食管癌的产品包括:与CHKA蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断食 管癌的产品包括:与CHKA基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断食管癌的产品包括： 蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与CHKA蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与 CHKA基因的核酸序列杂交的探针。
[0009] 所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括的一对特异扩增CHKA基因的引物 如SEQIDN0·3和SEQIDN0·4所示。
[0010] 所述检测CHKA基因表达的产品可以是检测CHKA基因表达的试剂、也可以是包含所 述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
[0011] 所述诊断食管癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高 通量测序平台是一种特殊的诊断食管癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的 基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱， 容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知CHKA基因的异常与食 管癌相关也属于CHKA基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0012] 本发明还提供了一种诊断食管癌的工具，所述工具包括检测CHKA基因表达的试 剂;所述试剂包括检测CHKA基因 mRNA的引物和/或探针、检测CHKA蛋白的抗体。
[0013] 所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
[0014] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定 在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测CHKA基因转录水平的针对 CHKA基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的CHKA蛋白 的特异性抗体;所述基因芯片可用于检测包括CHKA基因在内的多个基因（例如，与食管癌相 关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括CHKA蛋白在内的多个蛋白质 (例如与食管癌相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与食管癌的标志物同时检测， 可大大提高食管癌诊断的准确率。
[0015] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试 剂盒包括用于检测CHKA基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括CHKA蛋白的特 异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方 法检测CHKA基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对CHKA基因的引物 和/或探针。根据CHKA基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测CHKA基因表达水平 的引物和探针。
[0016] 所述试纸包括检测CHKA基因表达的试剂。
[0017] 所述高通量测序平台包括检测CHKA基因表达的试剂。
[0018] 与CHKA基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍 生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任 何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长 度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交 效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过 30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列 最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0019] 进一步，所述CHKA蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述CHKA蛋白 的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F (ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与CHKA蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体 的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
[0020] 在本发明的具体实施方案中，所述检测CHKA基因 mRNA的引物包括SEQ ID N0.3和 SEQ ID NO.4所示的引物对。
[0021 ]本发明还提供了CHKA基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗食管癌的药物中 的应用。所述抑制剂包括抑制CHKA基因表达的试剂、和/或抑制CHKA基因表达产物的试剂。 [0022] 进一步，所述抑制CHKA基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译 的试剂;所述抑制CHKA基因表达产物的试剂包括抑制CHKA基因 mRNA的试剂、抑制CHKA蛋白 的试剂。所述抑制CHKA基因 mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的 试剂。所述抑制CHKA蛋白的试剂包括抑制CHKA蛋白稳定性的试剂、抑制CHKA蛋白活性的试 剂、抑制CHKA蛋白功能的试剂。
[0023] 进一步，抑制CHKA基因 mRNA的试剂包括针对CHKA基因 mRNA的双链核糖核酸;抑制 CHKA蛋白功能的试剂包括CHKA抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制CHKA蛋白功能的抗体。所述抗体 可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。
[0024] 在本发明的具体实施方案中，所述针对CHKA基因 mRNA的双链核糖核酸是siRNA。为 了确保CHKA基因能够被高效剔除或沉默，根据CHKA基因的mRNA序列设计了 s iRNA特异性片 段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则（Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003,Khvorova et.al 2003,Reynolds et.al 2004,Hsieh et.al 2004,Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura·wi.mit·edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITR0GEN(winner of the 2004Frost&Sul1ivan Excellence in Research Award，https ://rnaidesigner · invitrogen · com/sirna/) 〇为了 进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片 断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减 少RNAi干扰的脱靶效应。
[0025] 优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。
[0026] 本发明还提供了一种用于治疗食管癌的药物组合物，所述药物组合物包括上面所 述的CHKA基因和/或其表达产物的抑制剂。
[0027] 本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，其中该载体可为赋形剂、稀释 剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、表面活性剂、悬浮剂、胶 凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料其中之一或两者以上的混合。
[0028] 本发明的药物组合物可用于制造治疗食管癌的药剂。
[0029] 本发明的药物组合物首选应用于哺乳动物，其中该哺乳动物优选为人类病患。
[0030] 本发明的药物组合物可例如以口服、注射等方式给予至该人类病患体内。
[0031 ]本发明的药物组合物还可与其他治疗食管癌的药物联用，多种药物联合使用可以 大大提到治疗的成功率。
[0032]在本发明的上下文中，"CHKA基因"包括CHKA基因以及CHKA基因的任何功能等同物 的多核苷酸。CHKA基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中CHKA基因（NC_ 000011.10)DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0033] 优选地，CHKA基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
[0034] (1)序列表中SEQ ID N0· 1所不的DNA序列；
[0035] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0036] (3)与（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、优选地，90%以上同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA分子。
[0037]在本发明的具体实施方案中，所述CHKA基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的DNA 序列。
[0038] 在本发明的上下文中，CHKA基因表达产物包括CHKA蛋白以及CHKA蛋白的部分肽。 所述CHKA蛋白的部分肽含有与食管癌相关的功能域。
[0039 ] "CHKA蛋白"包括CHKA蛋白以及CHKA蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 CHKA蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱 导突变体、在高或低的严紧条件下能与CHKA的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0040]优选地，CHKA蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
[0041] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0042] (2)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30 个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
[0043] (3)与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又称为序列同一性）， 更优选地，与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0044]在本发明的具体实施方案中，所述CHKA蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列的蛋白质。
[0045] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0046] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是CHKA蛋白的融合 蛋白。对于与CHKA蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留CHKA蛋白 的生物学活性即可。
[0047]本发明的CHKA蛋白也包括对SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要 经过修饰的蛋白质仍然能够保留CHKA蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的 氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
[0048]在本发明的上下文中，"诊断食管癌"既包括判断受试者是否已经患有食管癌、也 包括判断受试者是否存在患有食管癌的风险。
[0049] 在本发明的上下文中，"治疗食管癌"从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓 解、疾病的完全治愈，还包括用于评价疾病的治疗效果。
[0050] 本发明的优点和有益效果：
[0051] 本发明首次发现了CHKA基因表达与食管癌相关，通过检测受试者组织中CHKA的表 达，可以判断受试者是否患有食管癌、或者判断受试者是否存在患有食管癌的风险，从而指 导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0052]本发明发现了一种新的分子标记物-CHKA基因，相比传统的检测手段，基因诊断更 及时、更特异、更灵敏，能够实现食管癌的早期诊断，从而降低食管癌的死亡率。
【附图说明】
[0053]图1显示利用基因芯片检测CHKA基因在食管癌组织与正常食管组织中的表达情 况；
[0054] 图2显示利用Western blot检测CHKA蛋白在食管癌组织与正常食管组织中的表达 情况；
[0055] 图3显示利用QPCR检测s iRNA对CHKA基因的干扰效率；
[0056] 图4显示利用Western blot检测siRNA对CHKA蛋白表达的影响；
[0057]图5显示抑制CHKA蛋白功能对食管癌细胞增殖的影响。
[0058]具体的实施方式
[0059] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0060] 实施例1 CHKA基因的差异表达 [0061 ] 1、实验材料：
[0062]食管癌组织为医院胸外科手术切除的标本，正常食管组织为胃镜室镜下取出的标 本，手术切除的食管肿瘤组织离体后立即取材，取材时均佩戴一次性无菌手套，应用高压灭 菌的手术刀片切取。
[0063]所有病例均经病理确诊。包括食管癌组织40例，正常食管组织30例。其中食管鳞癌 34例，食管腺癌6例。以正常食管组织作为对照组。所有患者术前均病理证实，术前均未行放 疗、化疗等治疗，且无其他部位的肿瘤等。所有组织均在手术半小时内液氮保存后，移入-80 度冰箱冻存。
[0064] 2、食管癌组织和正常食管组织的RNA的获取
[0065] 使用Tr i ζ ο 1-步法提取食管癌组织和正常食管组织的总RNA，通过Nano drop ND-1000读取260nm和280nm处的吸光度值(A)测定RNA溶液的纯度。经1 %甲醛变性琼脂糖凝胶 电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。
[0066] 3、基因芯片杂交及扫描
[0067] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美 国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因），在芯片杂交炉中65°C杂交17h，然后 洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0068] 4、芯片数据处理与分析
[0069] 杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值 的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
[0070] 5、统计学处理
[0071] 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P〈 0.05差异有显著性意义。
[0072] 6、结果
[0073] 结果显示(如图1所示），与正常食管组织相比，食管癌组织中CHKA基因的mRNA水平 显著增加，差异具有统计学意义(P〈〇.05)。
[0074]实施例2CHKA蛋白的差异表达 [0075] 1、研究对象同实施例1。
[0076] 2、提取组织总蛋白
[0077] 按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0078] 3、Western blot检测
[0079] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、 显色。
[0080] 4、统计学处理
[0081 ]将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将CHKA蛋白 条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具有统 计学意义。
[0082] 5、结果
[0083]结果如图2所示，与正常食管组织相比，食管癌组织中CHKA蛋白的表达水平显著增 加，差异具有统计学意义(P〈〇. 05)。
[0084] 实施例3抑制CHKA基因表达
[0085] l、siRNA 设计合成
[0086] 针对 CHKA 的 siRNA 序列：
[0087] siRNAl-CHKA：
[0088] 正义链为5'-AUUCUUCAGUAUCUAAUCGCC-3'（SEQ ID N0.7);
[0089] 反义链为5'-CGAUUAGAUACUGAAGAAUUA-3'（SEQ ID N0.8)，
[0090] siRNA2-CHKA：
[0091] 正义链为5'-AUGAAAUGUAGCCAUUUUCUC-3'（SEQ ID N0.9);
[0092] 反义链为5'-GAAAAUGGCUACAUUUCAUGG-3'（SEQ ID N0.10)，
[0093] siRNA3-CHKA：
[0094] 正义链为5'-AAGAUAUUACCUUCUUGACAG-3'（SEQ ID N0.11);
[0095] 反义链为5'-GUCAAGAAGGUAAUAUCUUGU-3'（SEQ ID N0.12)
[0096] 以上s i RNA序列与阴性对照s i RNA序列（s i RNA-NC)均由上海吉玛制药技术有限公 司提供：
[0097] 2、食管癌细胞的培养与转染
[0098] 2.1细胞培养
[0099]食管癌细胞系ECA109接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中、将其放置于37 °C、5 % C02培养箱内培养，待细胞达80 %融合时，用0.25 %胰蛋白酶消化传代。
[0100] 2.2细胞转染
[0101] 将食管癌细胞按1 X 104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5%C02培养箱中细 胞培养24h，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司）的说明书转染，实验分 为、阴性对照组和实验组(20nM)，其中，阴性对照组siRNA与CHKA基因的序列无同源性，浓度 为20nM/孔，同时分别转染。
[0102] 2、利用QPCR实验检测s iRNA的干扰效率。
[0103] 2.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0104] 2.2逆转录
[0105] 利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
[0106] 2.3QPCR
[0107] (1)引物设计
[0108] 根据Genbank中CHKA基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0109] CHKA 基因：
[0110] 正向引物为5'-TTGCTTGAATCTACTCCAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0111] 反向引物为5'-CTGTAATTGTAACTGCTGTAT-3'（SEQ ID N0.4),
[0112] GATOH 基因：
[0113] 正向引物为5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0114] 反向引物为5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.6)。
[0115] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0116] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0117] 表1PCR反应体系
[0119] (3)PCR反应条件：95°C10min，（95°C15s，60°C40s)*40个循环。以SYBR Green作为 荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确 定目的条带，△△ CT法进行相对定量。
[0120] 2.4统计学方法
[0121]实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰CHKA基因表达组与对照组之间的差异采用 t检验，认为当P〈0.05时具有统计学意义。
[0122] 2.5 结果
[0123] 结果如图3所示，与s i RNA2-CHKA、s i RNA3-CHKA相比，s i RNA1 -CHKA能够更有效的抑 制CHKA基因的表达，差异具有统计学意义(P〈0.05)，使用siRNAl-CHKA进行后续的实验。
[0124] 3、Western blot实验检测siRNAl-CHKA的干扰效率
[0125] 步骤同实施例2。
[0126] 结果如图4所示，与转染s iRNA-NC组相比，转染s iRNA 1 -CHKA的细胞中CHKA蛋白的 含量明显降低，差异具有统计学意义(P〈〇.05)。
[0127] 实施例4CHKA基因的表达对食管癌细胞增殖能力的测定
[0128] 使用Cell Counting kit-8(cck-8)试剂盒用于检测食管癌细胞增殖 [0129] 1、步骤
[0130]按照前面实施例的方法进行食管癌细胞的培养和转染，细胞分为二个实验组：
[0131] 组1:转染siRNA-NC细胞组；
[0132] 组2:转染siRNAl-CHKA 细胞组。
[0133] 转染24h后，以2.5 X105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，每个实验组设计三复 孔，每孔加入1〇μ1的CCK-8溶液，37°C，5 %⑶2培养箱中孵育4h;然后按照试剂盒说明，选择 450nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值(0D值）。
[0134] 2、统计学方法
[0135] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具 有统计学意义。
[0136] 3、结果
[0137] 结果如表2所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNAl-CHKA细胞组细胞增殖缓慢， 差异具有统计学意义(P〈〇.05)。上述实验结果表明，CHKA基因表达促进了食管癌细胞的增 殖。
[0138] 表2食管癌细胞0D值
[0140] 实施例5食管癌细胞抗体中和实验
[0141] 1、步骤：
[0142] 将食管癌细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔2*103个细胞/孔/200μ1，细胞贴壁 后进行如下处理：
[0143] 实验组1(对照组）：食管癌细胞中加入无关单抗(1:50);
[0144] 实验组2:食管癌细胞中加入抗人CHKA单抗(1:50)。
[0145] 将细胞在37°C、5%⑶2培养箱孵育24小时后，加入3H-TdR(lyCi/孔），再培养24小 时，收集细胞，加液体闪烁液，β计数仪检测cpm值。
[0146] 2、统计学方法
[0147] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具 有统计学意义。
[0148] 3、结果
[0149] 结果如图5所示，相比于对照组，加入抗人CHKA单抗的细胞组细胞增殖减缓。上述 实验结果表明，抑制CHKA蛋白的功能可以抑制食管癌细胞增殖。
[0150] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测CHKA基因表达的产品在制备诊断食管癌的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、 免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CHKA基因表达以诊断食管癌的产品;所述 用RT-PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增CHKA基因的引物;所述用实时定量PCR 诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增CHKA基因的引物;所述用免疫检测诊断食管癌的 产品包括:与CHKA蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断食管癌的产品包括:与CHKA 基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断食管癌的产品包括:蛋白芯片和基因芯片；其 中，蛋白芯片包括与CHKA蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与CHKA基因的核酸序列杂 交的探针。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至 少包括的一对特异扩增CHKA基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。4. 一种诊断食管癌的工具，其特征在于，所述工具包括检测CHKA基因表达的试剂;所述 试剂包括检测CHKA基因 mRNA的引物和/或探针、检测CHKA蛋白的抗体。5. 根据权利要求4所述的工具，其特征在于，所述检测CHKA基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。 6. CHKA基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗食管癌的药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制CHKA基因表达的试 剂、和/或抑制CHKA基因表达产物的试剂。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制CHKA基因表达产物的试剂包括抑 制针对CHKA基因的siRNA、和/或CHKA蛋白的抗体。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述针对CHKA基因的siRNA序列如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示。10. -种用于治疗食管癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求6-9中任一项所述的抑制剂。
【文档编号】A61K45/00GK105886625SQ201610274496
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】杨承刚, 宋宏涛, 王晓云
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司