与中国绵羊尾型性状相关的snp分子标记及其应用
【专利摘要】本发明涉及与中国绵羊尾型性状相关的SNP分子标记，该SNP标记位于绵羊第11号染色体第18295084碱基对。本发明还提供了用于检测该SNP标记的特异性引物和方法，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.2?3所示。本发明具有如下优点：(1)本发明的SNP分子标记不受中国绵羊品种、年龄限制，可用于中国绵羊尾型的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进瘦尾型绵羊品种的培育。(2)检出中国绵羊EVI2A基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简便。(3)中国绵羊EVI2A基因的SNP位点的检出，为中国肥尾绵羊的瘦尾化的标记辅助选择提供了科学依据。
【专利说明】
与中国绵羊尾型性状相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及与中国绵羊尾型性状相关的SNP分子 标记、以及检测中国绵羊尾型性状的方法。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性标记（SNP)主要是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧 核苷酸的变异所引起的DNA片段的多态性。SNP的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现的 形式有替换、插入和缺失等。SNP的检测方法，目前常用的包括，sanger测序、DNA芯片、飞行 时间质谱、以及最新的高通量二代测序等技术。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型 是近些年兴起的一种方法。SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种 以及遗传多样性等研究领域。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种 方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不 断探索并选育更优良的家畜品种。
[0003] 绵羊是一种很早就被驯化的家畜，为人类文明的发展作出了重大贡献，在驯化过 程中，形成了多种多样的品种，且表型差异很大，如毛色、体型、繁殖力、尾型等。借助高通量 技术寻找影响表型性状的特定的基因组区域已成为动物遗传学领域研究的热点。绵羊尾部 脂肪的沉积给现代集约化养殖造成了不便，也造成了更多饲料成本的增加。
[0004] 亲嗜性病毒插入位点蛋白EVI2A(Ecotropic viral integration site 2A)，存在 与脂肪等细胞中，可与成纤维细胞生长因子FGFR(Fibroblast growth factor receptor) 互作，影响FGFR介导的脂肪生成和成脂分化通路，因此该基因的突变可能会影响绵羊的瘦 尾和肥尾表型。
[0005] 鉴于此，本发明利用Ovine HapMap中可以确定尾型的品种进行全基因组扫描和尾 型关键基因的定位，发现EVI2A基因座位的多态性变异对中国绵羊尾部脂肪沉积性状的影 响达到全基因组显著水平，为培育适合现代畜牧业发展需要的绵羊新品种提供理论基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种辅助鉴定中国地方绵羊不同尾型性状的SNP标记 及其应用。
[0007] 本发明的另一个目的是提供用于检测与中国地方绵羊瘦尾与肥尾性状相关的SNP 标记的引物及含有该引物的试剂盒。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明提供了一种与中国地方绵羊尾型性状相关的SNP 标记，所述SNP标记位于绵羊第11号染色体第18295084bp处，该SNP分子标记的多态性为T/ C〇
[0009] 发明人对来自不同地区和品种的中国地方绵羊进行了大量的基因型与尾型相关 性研究，发现本发明所提供的SNP位点在不同尾型的中国地方绵羊群体中基因频率差异显 著。等位基因 T在瘦尾羊中的频率高达100 %，而在肥尾羊中该等位基因频率均在40 %以下， 在肥尾品种之一的哈萨克羊中最低，为13%，这对于通过基因型区分和筛选不同尾型性状 的中国地方绵羊具有较大的指导意义。当中国地方绵羊的基因型为TT时该绵羊偏向具有瘦 尾性状，当中国绵羊的基因型为CC为时可以判定绵羊为肥尾羊，其尾部沉积脂肪能力强，可 以加速瘦尾羊的育种进程。
[0010] 本发明还提供了用于检测本发明所述SNP分子标记的特异性引物，包括：
[0011] 正向引物：5'-TTCCAGCATGCTCAAGAGGG-3'；（SEQIDN0·2)
[0012] 反向引物：5'-TTGTCGTCCTCACAGACACC-3'（SEQ ID N0.3)。
[0013] 本发明提供了所述SNp分子标记在中国绵羊育种中的应用。
[0014]本发明提供的与中国地方绵羊尾型性状相关的SNP分子标记在中国地方绵羊分子 标记辅助育种中的应用属于本发明的保护范围。
[0015] 本发明提供了所述SNP分子标记在鉴定中国绵羊尾型性状中的应用。
[0016] 本发明提供一种检测中国绵羊尾型性状的方法，包括以下步骤：
[0017] (1)提取待测绵羊基因组DNA，以其为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获 得扩增产物片段；
[0018] (2)检测扩增产物片段的第352bp处的碱基种类，若碱基种类为T，则待测绵羊尾部 脂肪沉积较少，其为瘦尾羊，若碱基种类为C，则判定待测绵羊尾部脂肪沉积多，为肥尾羊；
[0019] 所述特异性引物包括：
[0020] 正向引物：5 ' -TTCCAGCATGCTCAAGAGGG-3 ' ；
[0021 ]反向引物：5'-TTGTCGTCCTCACAGACACC-3'。
[0022]其中，步骤（1)中PCR扩增反应使用的扩增体系以25μ1计为：50-100ngAU模板DNA 2μ1，10ρ??〇1/μ1正向引物和反向引物各lyl，2XTaq PCR MasterMix 12·5μ1，余量为双蒸 水。
[0023] 其中，骤（1)中PCR扩增反应的条件为:94°C预变性5分钟;94°C变性30秒，60°C退火 30秒，72 °C延伸60秒，共34个循环;72 °C保温5分钟。
[0024] 本发明对于检测PCR扩增产物片段的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规 的检测方法进行，优选的，可以利用Sanger测序或飞行质谱分型等方法来检测待测中国地 方绵羊品种的基因型。
[0025] 本发明还提供了含有本发明所述特异性引物的辅助鉴定中国绵羊尾型性状的试 剂盒。
[0026] 优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种 或多种。
[0027] 优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0028] 进一步，本发明提供了上述试剂盒在中国绵羊育种中的应用。
[0029] 本发明提供了上述试剂盒在鉴定中国绵羊尾型性状中的应用。
[0030] 本发明所述的特异性引物还可以与其他用于中国地方绵羊尾型表型检测的特异 性引物相结合用于中国绵羊分类和育种研究。
[0031 ]本发明的与中国地方绵羊尾型性状相关的SNP标记及其应用具有如下优点：
[0032] (1)本发明提供的分子标记不受中国绵羊品种、年龄等限制，可用于中国绵羊尾型 性状的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进中国绵羊瘦尾品种的育种 进程。
[0033] (2)检出中国地方绵羊品种EV12 A基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简 便。
[0034] (3)中国地方绵羊品种EVI2A基因的SNP位点的检出，为中国绵羊尾型性状的标记 辅助选择提供了科学依据。
【附图说明】
[0035]图1为三种基因型测序峰图；其中，（a)为TT型；（b)为CC型；（c)为TC型。
【具体实施方式】
[0036] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0037] 实施例1绵羊不同基因型与尾型大小的全基因组分析
[0038] 对中国西藏、挪威、芬兰、美国、冰岛共214份瘦尾绵羊以及349份肥尾绵羊的DNA芯 片数据（数据通过ISGC国际绵羊基因组联合会官网http : //www · sheephapmap · org/ hapmap.php下载)进行瘦尾-肥尾的全基因组扫描分析，发现位于第11号染色体EVI2A基因 座位与肥尾性状最为密切相关。进一步结合全基因组重测序，筛选到位于绵羊第11号染色 体第18295084碱基对的SNP与尾型性状最为密切相关(费雪检验P〈0.001)。
[0039]实施例2中国绵羊EV 12A基因多态性位点的鉴定
[0040] 1、提取待测中国地方绵羊品种的基因组DNA
[0041] 采集来自中国地区20只瘦尾型绵羊（来自西藏浪卡子地区）和95只肥尾型的绵羊 (包括11只来自宁夏的滩羊，25只来自山东的小尾寒羊，24只来自新疆的乌珠穆沁羊，23只 来自新疆的哈萨克羊，12只来自新疆的阿勒泰羊)的血样，采用常规的方法提取血液中的基 因组DNA。
[0042] 2、扩增含SNP位点的核苷酸片段
[0043]针对实施例1中筛选到的EVI2A基因座位的SNP位点，根据ensemble数据库收录的 EVI2A基因座位（Gene:ENS0ARG00000003975)的序列设计引物，包括正向引物F:5'_ TTCCAGCATGCTCAAGAGGG-3'和反向引物R:5'-TTGTCGTCCTCACAGACACC-3'，以1 · 1 中的基因组 DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO. 1所示。该SNP位点位于PCR扩 增片段的352bp处，此处碱基为T或C。
[0044] 其中PCR反应使用的扩增体系以25μ1计为：50-100ng/yl模板DNA 1μ1，10ρπιο1/μ1 正向引物和反向引物各lyl，2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1，余量为双蒸水。
[0045] 其中PCR反应的条件为:94 °C预变性5分钟;94 °C变性30秒，60 °C退火30秒，72 °C延 伸60秒，共34个循环;72°C保温10分钟。3、检测PCR扩增片段，获得SNP标记 [0046]对1.2中的PCR扩增产物进行Sanger测序检测，如果扩增产物序列中第352bp处的 碱基为T，则待测中国绵羊属于瘦尾型。绵羊DNA样品三种基因型的Sanger测序峰图如图1所 示。个体基因型可分为TT型，CC型和TC型。三种基因型的分型结果如图1所示。
[0047]实施例3对115只中国绵羊的EVI2A基因座位的多态性位点进行扩大群体分析
[0048] 按照实施例1提取20份瘦尾羊和95只肥尾型绵羊的基因组DNA样品采用实施例1的 特异性引物进行PCR检测，再进行基于Sanger测序的基因型分型检测。95只肥尾型绵羊羊分 另IJ是滩羊，乌珠穆沁羊，小尾寒羊，阿勒泰羊，哈萨克羊;20只瘦尾羊，全为藏羊。EVI2A基因 如SEQ ID NO. 1所示序列的352bp位点的基因型分型结果如表1所示。该SNP位点在瘦尾绵羊 中的等位基因 T的频率为100%，完全固定。肥尾型绵羊中该等位基因 T的频率均低于40%， 在肥尾型品种之一的哈萨克羊中仅为10%左右(如表1所示）。运用R软件的卡方检验进行分 析，等位基因 T在瘦尾羊中的频率显著高于在肥尾型绵羊中的频率(p = 2.3e-7)。表明了该 SNP位点的等位基因 T与中国绵羊瘦尾性状的相关性。
[0049] 表1EV12A基因的SNP位点在绵羊品种中的基因型频率
[0051] 上述来源于不同地方的中国地方绵羊尾型鉴定结果表明：绵羊尾型基因型判定可 以通过chrll: 18295084bp位点的多态性判定实现。利用分子标记检测确定绵羊尾型可以加 快选育具有瘦尾性状的绵羊，节省了育种时间，使得快速获得具有纯合瘦尾基因型的优良 绵羊种质资源成为可能。
[0052] 上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一 些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于检测中国绵羊尾型性状的SNP分子标记，其特征在于，位于绵羊第11号染色 体第18295084bp处，该SNP分子标记的多态性为T/C。2. 用于检测权利要求1所述SNP分子标记的特异性引物，其特征在于，包括： 正向引物：5 ' -TTCCAGCATGCTCAAGAGGG-3 ' ； 反向引物：5'-TTGTCGTCCTCACAGACACC-3'。3. 权利要求1所述SNP分子标记在中国绵羊育种中的应用。4. 权利要求1所述SNP分子标记在鉴定中国绵羊尾型性状中的应用。5. -种检测中国绵羊尾型性状的方法，其特征在于，包括以下步骤： ⑴提取待测绵羊基因组DNA，以其为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩 增产物片段； (2)检测扩增产物片段的第352bp处的碱基种类，若碱基种类为T，则待测绵羊尾部脂肪 沉积较少，其为瘦尾羊，若碱基种类为C，则判定待测绵羊尾部脂肪沉积多，为肥尾羊； 所述特异性引物包括： 正向引物：5 ' -TTCCAGCATGCTCAAGAGGG-3 ' ； 反向引物：5'-TTGTCGTCCTCACAGACACC-3'。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1)中PCR扩增反应使用的扩增体系以 25μ1 计为：50-100ngAU模板DNA 2μ1，lOpmol/μΙ正向引物和反向引物各ΙμL，2 X Taq PCR MasterMix 12.5μ1，余量为双蒸水。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，骤（1)中PCR扩增反应的条件为:94°C预变 性5分钟;94 °C变性30秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，共34个循环;72 °C保温5分钟。8. 含有权利要求2所述特异性引物的辅助鉴定中国绵羊尾型性状的试剂盒。9. 权利要求8所述的试剂盒在中国绵羊育种中的应用。10. 权利要求8所述的试剂盒在鉴定中国绵羊尾型性状中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105886642SQ201610345182
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】蒋琳, 马月辉, 杨敏, 董坤哲
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所