密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用

密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用
【专利摘要】本申请公开了一种密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用。本申请的密执安棒状杆菌多重检测试剂中含有五条锁式探针，分别为Seq ID No.1所示序列的CMN锁式探针、Seq ID No.2所示序列的CMM锁式探针、Seq ID No.3所示序列的CMI锁式探针、Seq ID No.4所示序列的CMS锁式探针、Seq ID No.5所示序列的CMT锁式探针。本申请的多重检测试剂，含有五个亚种的特异性锁式探针，能够同时对五个亚种进行特异性检测；提高了检测效率和检测质量。本申请的试剂及试剂盒，为密执安棒状杆菌高通量检测提供了一种简单有效的途径，适于检验检疫部门使用，为保障生物安全，避免病菌传播提供了有力的科学依据。
【专利说明】
密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本申请涉及植物病原菌检测领域，特别是涉及一种密执安棒状杆菌多重检测试 剂、试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 密执安棒状杆菌(Clavibacter michiganensis)为放线菌目、微球菌科、密执安棒 状杆菌属，是重要的植物病原细菌。其中，密执安棒状杆菌的五个亚种：Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(缩写CMN)、Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis(缩写CMM)、Clavibacter michiganensis subsp· insidiosus(缩写 CMI)、Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus (缩写CMS)、Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius(缩写CMT)，是目前密执安棒状杆菌属检验检疫研究 的重点。这五个亚种是危害性大、分布广的密执安棒状杆菌属亚种，并且，五个亚种的形态 学特征近似，分子生物学特征也相近，因此很难鉴别。
[0003] Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis又称玉米内州萎蔫病菌，主要 分布于北美洲，自然寄主包括玉米(Zea mays)、墨西哥假蜀黍(Zea mexicana)，接种寄主包 括墨西哥假蜀泰（Euchlaena mexicana)、甘庶（Saccharum off icinarum)、高粱（Sorghum bicolor)、苏丹草（Sorghum sudanense)、鸭茅状磨擦禾(Tripsacum dactyloides) D病菌在 种子中至少存活1年，可进行远距离传播，对感染的玉米品种具有毁灭性的危害，是我国进 境植物检疫性有害生物。
[0004] Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis又称番前细菌性溃疡病菌， 在亚洲、欧洲、北美洲、中美洲及加勒比海地区、南美洲、非洲和大洋洲等都有分布，是世界 范围的重要病害，也是我国进境植物检疫性有害生物。Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis的自然寄主包括：番前（So lanum ly coper si cum)、辣椒（Cap si cum annuum)、前属（Solanum)、龙葵（Solanum nigrum)、裂叶前（Solanum trif lorum)和其他的 前科杂草。接种寄主包括：燕麦（Avena sativa)、西瓜（Citrullus 1&1^切8)、西瓜 (Citrullus vulgaris)、黄瓜（Cucumis sativus)、树番前（Cyphomandra betacea)、向日葵 (Helianthus annuus)、大麦（ordeum vulgare)、秘鲁番前（Lycopersicon peruvianum)、酉昔 栗番前（Lycopersicon pimpinellifolium)、心叶烟（Nicotiana glutinosa)、黑麦（Secale cereale)、Solanum humboldtii、Solanum muricatum、Solanum nigrum var guineense、 Solanum pruniforme>Solanum racemif lorum、马铃薯（Solanum tuberosum)、普通小麦 (Triticum aestivum)。病菌在在土壤里的病残组织中可存活2~3年。
[0005] Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus又称苜蓿细菌性萎蔫病菌，在亚 洲、欧洲、北美洲、南美洲、非洲和大洋洲等都有分布，也是世界范围的重要病害，也是我国 进境植物检疫性有害生物。其自然寄主包括:百脉根Lotus corniculatus、苜蓿属Medicago (野苜蓿Medicago falcata、紫苜蓿Medicago sativa)、白香草木樨Melilotus albus、驴喜 豆〇11〇13^(31118￥；!_(^36：[>0113、木犀371'；!_邱3：[ >從8從118、车轴草属1'1^：[>01；!_11111。接种寄主包括： Medicago dzawknetica、Medicago glutinosa、Medicago hemicycla、小首蕃Medicago minima、Medicago prostratanMedicago sativa var·gaetula、Medicago sativa var·parviflora、Medicago sativa var·pi 1ifera、Medicago sogdiananMedicago suffruticosa、Medicago tianschanica、Medicago transoxana、玉米Zea mays。 Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus一般在受害寄主根管和病残寄主组织上 越冬，也可在种子和干草上越冬，春季通过伤口侵入根系，引起萎蔫病。
[0006] Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus又称马铃薯环腐病菌在亚洲、 欧洲、北美洲、中美洲及加勒比海地区、南美洲、非洲等都有分布，是世界范围的重要病害， 也是我国进境植物检疫性有害生物。其自然寄主为马铃薯Solanum tuberosum，接种寄主包 括:厶1：116仙63、甜菜136七3￥11]^31^8、番前1^(3(^618；[(30116 8(31116111：111]1等前属植物。带菌种薯 是主要的初侵染源，采用切块播种时，切刀传病是扩大再侵染的主要途径。切一刀病薯的切 刀能传染24~40个健薯。灌溉水或雨水也可将病薯腐烂释放出来的细菌传到健薯或健株根 茎上。带菌种薯细菌随养分和水分流动沿维管束依次向上进入新芽、茎、叶柄和叶内，形成 系统侵染。当葡匐茎长出时，病菌又沿葡匐茎的维管束进入新生薯块，但种子不带菌。
[0007] Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius又称密执安棒状杆菌棋盘亚 种，是Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensisNClavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp·insidiosus、Clavibacter michiganensis subsp .sepedonicus的近似种，在检验检疫过程中，极易引起混淆。
[0008] 由于以上五种密执安棒状杆菌的形态学特征和分子学特征都极其相似，容易引起 混淆，因此，亟需一种能够对密执安棒状杆菌进行有效检测鉴定的方法或试剂。

【发明内容】

[0009] 本申请的目的是提供一种密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用。
[0010] 本申请采用了以下技术方案：
[0011] 本申请的一方面公开了一种密执安棒状杆菌多重检测试剂，该多重检测试剂中含 有五条锁式探针，五条锁式探针分别为Seq ID No. 1所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis 特异性锁式探针、Seq ID Νο·2 所不序列的 Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针、Seq ID Νο·3所不序 列的Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus特异性锁式探针、Seq ID Νο·4所不 序列的Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针、Seq ID Νο·5所 不序列的Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针。
[0012] 本申请的另一面还公开了的密执安棒状杆菌多重检测试剂在密执安棒状杆菌滚 环扩增检测、滚环扩增液相芯片检测中的应用。
[0013] 需要说明的是，本申请的试剂实际上就是五种密执安棒状杆菌亚种的特异性锁式 探针，因此，可以将其用于密执安棒状杆菌滚环扩增检测。而本申请的一种优选实现方式 中，将滚环扩增与液相芯片结合，利用液相芯片对滚环扩增产物进行检测和分析，与常规的 凝胶电泳相比，具有更高的灵敏度和准确性。
[0014] 还需要说明的是，本申请的试剂，即五条特异性锁式探针，经过严密的设计和验 证，五条锁式探针可以组合在一起进行多重检测，并且，五条锁式探针都具有很好的特异 性，不会相互干扰，具有很好的一致性。
[0015] 本申请的另一面公开了一种密执安棒状杆菌的滚环扩增检测方法，包括采用本申 请的多重检测试剂，对待测样品进行滚环扩增，通过五条锁式探针的扩增情况判断待测样 品中是否含有Clavibacter michiganensis subsp · nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus、 Clavibacter michiganensis subsp·sepedonicus和/或Clavibacter michiganensis subsp.tesseliarius〇
[0016] 需要说明的是，本申请的密执安棒状杆菌多重检测试剂，实际上就是五种密执安 棒状杆菌亚种的锁式探针，其设计之处就考虑到将其用于滚环扩增，以进行多重检测；因 此，本申请提出了多重检测密执安棒状杆菌的滚环扩增检测方法。其中，通过五条锁式探针 的扩增情况判断待测样品，目前主要的方法包括凝胶电泳或芯片杂交;而本申请的优选方 案中将其与液相芯片结合，通过液相芯片判断锁式探针的扩增情况。
[0017] 本申请的再一面公开了一种密执安棒状杆菌的滚环扩增液相芯片检测方法，包括 以下步骤，
[0018] (1)提取待测样品的DNA样本；
[0019] (2)采用权利要求1所述的多重检测试剂，对提取的DNA样本进行滚环扩增；
[0020] (3)将五种偶联微球对滚环扩增产物进行杂交和液相芯片分析，获得检测结果；
[0021 ] 其中，五种偶联微球分别为偶联有Clavibacter michiganensis subsp . nebraskens is特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有 Clavibacter michiganensis subsp · insidiosus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微 球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus特异性锁式探针Zip序列的液 相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp · tessellarius特异性锁式探针 Zip序列的液相芯片微球。
[0022] 优选的，Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip 序列为 Seq ID No. 6 所不序列，Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis 特异性 锁式探针 Zip序列为 Seq ID Νο·7 所不序列，Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针Zip序列为Seq ID Νο·8所不序列，Clavibacter michiganensis subsp .sepedonicus 特异性锁式探针 Zip序列为 Seq ID No. 9 所不序列， Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No. 10所示序列。
[0023] 需要说明的是，锁式探针的基本结构是，从5'到3'端依序为:T1检测臂区、通用引 物结合区、Zip区和Τ2检测臂区；其中Τ1检测臂区和Τ2检测臂区是用于跟靶标序列特异性结 合的区域，每条锁式探针的检测臂区是不同的，特别是最末几个碱基是不同的，以此保障检 测的特异性;每条锁式探针的通用引物结合区序列是一样的，以方便所有锁式探针在连接 成环后，采用一对引物完成所有环状锁式探针的扩增;而Zip区是每条锁式探针的特异识别 区，类似于条形码的作用，Zip区通常是一段约20bp的随机序列，每条锁式探针的Zip区都不 同。在锁式探针中Zip区的作用就是识别锁式探针，因此，可以用于进行基因芯片杂交，以判 别锁式探针是否有扩增等。而本申请中，则是将滚环扩增与液相芯片结合，所以，在液相芯 片的微球上偶联Zip区序列；如果锁式探针有连接成环，并且有进行扩增，则其扩增产物就 可以与偶联微球结合，从而被液相芯片系统检测出来。
[0024] 本申请的再一面公开了一种密执安棒状杆菌多重检测试剂盒，该试剂盒中含有本 申请的密执安棒状杆菌多重检测试剂。
[0025] 需要说明的是，本申请的试剂，即五条锁式探针，可以单独制成产品，以方便密执 安棒状杆菌多重检测使用。
[0026] 优选的，试剂盒中还含有五条锁式探针的通用引物，通用引物包括第一引物，第一 引物为Seq ID No. 11所示序列。
[0027] 更优选的，通用引物还包括第二引物，第二引物为Seq ID No. 12所示序列。
[0028] 需要说明的是，本申请的试剂，实际上就是密执安棒状杆菌五个亚种的五条特异 性的锁式探针，因此，在将其制成试剂盒的时候，为了方便滚环扩增使用，还可以在其中配 置通用引物。可以理解，对于滚环扩增而言，通用引物可以是一条引物，也可以采用两条引 物，都可以进行滚环扩增；当然，优选的，采用两条引物进行滚环扩增能够获得更好的扩增 效果。
[0029] 优选的，试剂盒中还含有五条锁式探针的五条捕获探针，五条捕获探针分别为Seq ID No.6所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.7所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.8所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.9所示序列或其反向互补序列、Seq ID No. 10 所示序列或其反向互补序列。
[0030]需要说明的是，在考虑到采用基因芯片或者斑点杂交判断滚环扩增产物的情况， 本申请的试剂盒还可以选择性的配备五条捕获探针，这五条捕获探针，实际上就是针对锁 式探针的Zip区而设计的；可以直接是Zip区序列，也可以是其反向互补序列；当然，最好采 用Zip区序列，这样可以避免锁式探针本底显色。如果使用Zip区的反向互补序列，则即便锁 式探针没有连接成环、没有被扩增，同样可以与捕获探针杂交，也就是说直接的锁式探针也 可以与捕获探针杂交，从而显色，即本底显色。可以理解，如果配备捕获探针，或者采用基因 芯片或斑点杂交对滚环扩增产物进行判断，则需要对第一引物进行生物素标记。
[0031] 优选的，试剂盒中还含有用于液相芯片检测的，五条锁式探针的五种偶联微球，五 种偶联微球分别为偶联有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式 探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis 特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有 Clavibacter michiganensis subsp·tesseliarius特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微 球。
[0032] 需要说明的是，考虑到滚环扩增与液相芯片结合，为了方便使用，本申请的试剂盒 中直接提供了偶联有锁式探针Zip序列的液相芯片微球，滚环扩增完成后，直接采用本申请 试剂盒提供的偶联微球进行杂交，然后采用液相芯片系统进行分析，即可获得结果，使用简 单方便。
[0033]本申请的有益效果在于：
[0034]本申请的密执安棒状杆菌多重检测试剂，含有五个亚种的特异性锁式探针，能够 同时对五个近似种进行特异性检测；提高了检测效率和检测质量。本申请的试剂以及基于 该试剂的试剂盒，为密执安棒状杆菌的高通量检测提供了一种简单有效的途径，特别适合 于检验检疫等部门使用，为保障生物安全，避免密执安棒状杆菌传播提供了有力的科学依 据。
【附图说明】
[0035]图1是本申请实施例中CMN的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
[0036]图2是本申请实施例中CMM的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
[0037]图3是本申请实施例中CMI的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
[0038]图4是本申请实施例中CMS的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
[0039]图5是本申请实施例中CMT的捕获探针与微球偶联的测试结果图；
[0040] 图6是本申请实施例中五重滚环扩增液相芯片检测体系杂交温度优化结果；
[0041] 图7是本申请实施例中五重滚环扩增液相芯片检测体系杂交时间优化结果；
[0042] 图8是本申请实施例中五重滚环扩增液相芯片检测体系中，杂交时，滚环扩增产物 用量优化结果；
[0043] 图9是本申请实施例中五重滚环扩增液相芯片检测体系特异性检测结果。
【具体实施方式】
[0044] 下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进 一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0045] 实施例
[0046]本例的密执安棒状杆菌多重检测试剂由密执安棒状杆菌的五个亚种： Clavibacter michiganensis subsp·nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus >Clavibacter michiganensis subsp·sepedonicus、Clavibacter michiganensis subsp·tessellarius 的五条锁式探针组成。本例采用滚环扩增结合液相芯片对五条锁式探针进行特异性试验， 五条锁式探针的设计以及相关试验详细如下：
[0047] 一、供试材料及主要溶液
[0048] 1.供试菌株
[0049] 本例采用了两株CMI菌株、三株CMM菌株、三株CMN菌株、两株CMS菌株和两株CMT菌 株进行试验，同时，采用了七个其它近似种属的菌株作为阴性对照进行试验。菌株详细情况 如表1所示。
[0050] 表1供试菌株及其来源
[0051]
[0052] 表1中，菌株编号是本例对菌株的编号，该编号由六个数字组成，是沿用深圳出入 境检验检疫局植物检验检疫实验室植物病原细菌保存库菌株编号;原始编号是指菌株来源 的原始编号。来源中，1 为ATCC,American Type Culture Collection Center;2为ICMP, International Collection of Microorganisms from Plants;3为NCPPB,National Collection of Plant Pathogenic Bacteria;4为ICPB, International Collection of Phytopathogenic Bacteria;5为LMG,Belgian C〇-〇rdianted Collections of Micro-organisms; 6为中国农业大学种子健康检测中心;7为中国检验检疫科学研究院。
[0053] 2.菌株培养
[0054]首先用无菌接种环挑取所用供试菌株在营养培养基(NA)28°C活化48h后备用；然 后用无菌水配制成浓度约1 X 108CFU/mL的细胞菌悬液。菌悬液浓度测定方法为，用紫外光 栅分光光度计在波长为600nm测量配制的细菌悬浮液样品光密度值约为0.1，然后以10倍梯 度稀释，再分别取l〇〇yL稀释为10 5、106和107倍的细菌悬浮液涂于NA培养基，各梯度4次重 复，置28 °C培养箱中黑暗培养48-72h后进行平板单菌落计数，并计算原配细菌悬浮液浓度。 [0055] 3.DNA提取和浓度测量
[0056]供试菌株DNA的提取参照Axygen的DNA试剂盒说明书进行。即用1.5mL离心管收集 lmL过夜培养的细胞悬浮液，lOOOOg离心2min后弃上清液;加入350yL去离子水悬浮细胞，振 荡混匀；加入〇.8yL RNaseA，漩涡震荡15s，室温静置lmin;加入150yL Buffer C-L和8yL proteinase K立即漩祸震荡lmin，短暂离心后，置56°C水浴30min以上；加入350yL Buffer P-D，漩涡震荡30s混匀。12000g离心10min;将DNA制备管至于2mL离心管中，将离心后的上清 液移至制备管，12000g离心lmin;弃滤液加500yL Buffer Wl，12000g离心lmin;弃滤液加 700yL Buffer W2，12000g离心lmin，重复1次;弃滤液后再离心lmin;将离心后的制备管另 置于洁净的1.5mL离心管中，加入120yL Eluent或无菌水，静置lmin后离心lmin,最后_20°C 保存。最后取lyL按照Nanodrop 2000c核酸蛋白分析仪操作测定DNA浓度。
[0057] 4.主要溶液
[0058] 1)0.1M MES偶联缓冲液pH4.5:称取4.88g MES，用200mL去离子水充分溶解，然后 定容至250mL，pH调整至4.5,0.22μπι过滤除菌，4°C保存备用。
[0059] 2)0.02%Tween 20,即清洗缓冲液I:量取50yL购买的Tween 20,加入200mL去离子 水，混匀，然后定容至250mL，0.22μπι过滤除菌，室温保存备用。
[0060] 3)0.1%SDS，即清洗缓冲液Π :量取2.5mL 10%SDS，加入200mL去离子水，混匀，然 后定容至250mL，0.22μπι过滤除菌，室温保存备用。
[0061 ] 4)1.5\了]\^(：杂交缓冲液，即微球稀释液：量取45〇11^51的了]\^(：、3.7611^20%的 Sarkosyl、37 · 5mL 1Μ的Tris-HCl (ρΗ8 · 0)、6mL 0 · 5Μ的EDTA(pH8 · 0)、2 · 74mL去离子水；混 匀，获得500mL杂交缓冲液，室温保存备用。
[0062] 5)1 ΧΤΕ ρΗ8·0,即样品稀释液：量取2.5mL的100XTE ρΗ8·0,加入去离子水 200mL，混匀，最终定容至250mL，0.22μπι过滤除菌，室温保存备用。
[0063] 6)20%Sarkosyl:称取50g Sarkosyl，用200mL去离子水充分溶解，然后定容至 250mL，0.22μηι过滤除菌，室温保存备用。
[0064] 7) 1 X TMAC杂交缓冲液，即杂交液:量取167mL 1.5 X TMAC杂交缓冲液，加入去离子 水83mL，混匀，即获得1 X TMAC杂交缓冲液，室温保存备用。
[0065]二、锁式探针及通用引物的设计合成
[0066]通过下载并整理NCBI数据库公布的靶标细菌及其近似种核酸序列，采用BioEdit 对其ITS区、16S rRNA gene等保守区域进行比对分析，寻找碱基差异大的保守序列，并找出 不同于近似种的靶标特异位点，或采用常规PCR和实时荧光PCR检测方法中使用的特异性检 测位点，按照锁式探针设计原则，采用Primer Premier 5.0分析锁式探针T1检测臂区和T2 检测臂区的!'111值，并采用1^^81：1'11〇1：1'116 5.4分析锁式探针的二级结构，设计本例的锁式探 针。
[0067]锁式探针中间的连接序列是一段与检测靶序列无关的序列，主要包括通用引物结 合区，约40bp左右，以及用于滚环扩增产物与液相芯片杂交检测的Zip区，约20bp。本例建立 了一套Zipcode核酸序列数据库以供外来危险性植物细菌的锁式探针设计选用。本研究设 计的锁式探针长度在96&口-103&口之间，锁式探针的发夹结构采用1^^31：1'11〇1：1'116 5.4进行 预测，确保发夹结构能值最小。在合成锁式探针时，其5 '端需要进行磷酸化修饰，所有锁式 探针和引物均由大连宝生物工程有限公司(TAKARA)合成，本例设计的锁式探针及通用引物 如表2所示。
[0068] 表2锁式探针和通用引物
[0070] 表2中，CMN-PLP为Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式 探针、0\1]\1-?1^为〇1&￥；^&(^61'111；[(311丨8&116118丨8 81^8口.111；[(311丨8&116118丨8特异性锁式探针、 CMI-PLP为Clavibacter michiganensis subsp· insidiosus特异性锁式探针、CMS-PLP为 Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针、CMT-PLP为 Clavibacter michiganensis subsp· tesseliarius特异性锁式探针。5' 端的 "P04"为磷酸 化修饰。锁式探针虚线部分为T1检测臂区和T2检测臂区，实线部分为通用引物结合区，黑体 部分即实线和虚线之间的部分为Zip区。
[0071] 在锁式探针测试阶段，即采用凝胶电泳验证滚环扩增结果的阶段，所采用的第一 引物的5'端没有生物素标记;在采用液相芯片对滚环扩增产物进行分析时，所使用的第一 引物的5'端具有"Biotin"生物素标记。
[0072]三、液相芯片检测探针的设计合成
[0073]基于滚环扩增的液相芯片检测，需要合成两种探针：1)捕获探针（Capture Probe)，即一段带有5'氨基修饰的-C12-手臂的寡核苷酸，这段序列与锁式探针Zip区的碱 基序列相同，与羧基微球偶联，并用于检测滚环扩增产物；2)验证探针（Validation Oligo)，即一段带有5'生物素(Biotin)标记片段，该序列与捕获探针反向互补，用于捕获探 针与微球偶联的效率验证。所有探针均由大连宝生物工程有限公司（TAKARA)合成，捕获探 针和验证探针如表3所示。本例的捕获探针与微球偶联后即获得偶联微球。
[0074] 表3捕获探针和验证探针

[0076] 表3中，CMN-CP为Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis的捕获探针、 CMM-CP为Clavibacter michiganensis subsp .111；!_。1118&11611818的捕获探针、0\11-〇?为 Clavibacter michiganensis subsp · insidiosus的捕获探针、CMS-CP为Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus的捕获探针、CMT-CP为Clavibacter michiganensis subsp · tessellarius 的捕获探针。CMN-V0 为 Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis 的验证探针、CM M-VO为 Clavibact er michiganensis subsp.michiganensis 的验证探针、CMI-VO 为 Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus 的验证探针、CMS-VO 为 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus 的验证探针、CMT-VO 为 Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius的验证探针。其中，"Amin〇-Ci2"表示捕获探针的5'端连接有氨基修饰 的12个碳的手臂，"Biotin"表示验证探针的5'端有生物素标记。
[0077] 四、液相芯片偶联微球的制备和质控
[0078] 1.捕获探针与微球偶联
[0079] 为后续多重液相悬浮芯片检测，需将本研究中靶标菌对应的捕获探针与不同编号 的微球偶联备用。本例捕获探针与偶联微球的编号分别为:CMN-CP偶联52利^球、CMM-CP偶 联45#微球、CMI-CP偶联33#微球、CMS-CP偶联51#微球、CMT-CP偶联35#微球。
[0080] 整个偶联过程需要完全避光，具体步骤包括：
[0081 ] 1)取2份新鲜的EDC粉末，使之恢复至室温；
[0082] 2)蜗旋仪上以最高转速悬浮微球30s混勾，然后在超声清洗仪上超声微球30s防止 微球贴壁；
[0083] 3)取100yL微球到EP离心管中，最高转速离心2min;
[0084] 4)弃上清，取50yL，pH4.5，0.1M的MES重悬微球，彻底蜗旋30s，超声20s，使微球分 散；
[0085] 5)加入2yL稀释好的0. lnmol/yL的捕获探针于重悬微球中，涡旋震荡20s;
[0086] 6)制备新鲜的10mg/mL的EDC溶液，加入2.5yL EDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗 条件下600rpm震荡孵育30min;
[0087] 7)再次制备新鲜的10mg/mL的EDC溶液，加入2.5yL EDC至微球中，彻底混匀，室温 黑暗条件下600rpm震荡孵育30min;
[0088] 8)加入lmL 0.02%Tween 20,稍微蜗旋混匀，以最高转速离心2min，弃上清液；
[0089] 9)用lmL 0.1%SDS重悬沉淀40s，最高转速离心2min，弃上清液；
[0090] 10)用100yL，pH 8.0, IX TE buffer重悬沉淀，蜗旋仪上最高转速蜗旋30s，超声 20s，4°C黑暗条件下储存。
[0091] 2.微球计数
[0092]通过血球计数器来计算偶联后微球的数量，从而估算微球浓度。
[0093] 具体步骤如下：
[0094] 1)微球准备:将偶联好的微球在涡旋仪上重悬40s，用双蒸水按照1:100的比例稀 释微球并彻底混匀；
[0095] 2)血球计数器准备：使用70%乙醇将盖玻片和血球计数器清洁干净，然后将盖玻 片润湿并覆盖至血球计数器上；
[0096] 3)加样：取10yL稀释后的微球转移到血球计数器中并放置几分钟使微球完全扩 散，同时用吸水纸吸掉多余的液体；
[0097] 4)计数:在100倍显微镜下，移动计数器将视野对准计数器的中央大方块，记录计 数池四个角以及中央方块内的微球数(每个方块细胞数应不大于20-50)。
[0098] 5)计算:血球计数器每个大方块可以容纳的体积为1mm2 X 0. lmm=0.1mm3 = 1 (T4cm3 =l(T4mL，因此，每毫升溶液中微球的个数=每个方块内微球平均数X细胞稀释比例X 104;
[0099] 6)微球浓度(个) = (5个方格里微球数量之和)/5 X 10 X 100。
[0100] 本例中CMN-CP偶联52#微球浓度是12500个AxL，CMM-CP偶联45#微球11500个AxL， CMI-CP偶联33#微球浓度是18750个/VL，CMS-CP偶联51#微球浓度是12250个AxL，CMT-CP偶 联35#微球浓度是16500个ΛΛ。
[0101] 3.捕获探针偶联效率验证
[0102] 制备偶联微球工作混合物：
[0103] 制备新鲜偶联好的微球工作液，以便进行偶联效率验证或后续杂交检测，具体步 骤如下：
[0104] 1)微球准备:将偶联微球超声15-20s，充分涡旋振荡混匀待用；
[0105] 2)体系准备:每管反应中工作混合物体系为33yL，每种微球至少5000个，其中包含 22yL的1.5 X TMAC杂交缓冲液，CMN-CP偶联52#微球体积为0.4yL，CMM-CP偶联45#微球体积 为0.4yL，CMI-CP偶联33#微球体积为0.3yL，CMS-CP偶联51#微球体积为0.4yL，CMT-CP偶联 35#微球体积为0.3yL;最后加入无菌水9.2yL，置于冰上备用；
[0106] 制备验证探针工作液：
[0107] 制备新鲜稀释的验证探针工作液，确保每个探针浓度为lOfmol/yL。
[0108] 1)本例的起始验证探针工作原液浓度为O.Olnmol/yL，即lOpmol/yL;
[0109] 2)五个验证探针的工作原液各取4yL，加入80yL pH8.0的TE，获得100yL的验证探 针混合原液，其中，各个验证探针的浓度为〇.4pmolAiL，即400fmolAiL;
[0110] 3)取10yL验证探针混合原液，加入到390yL pH8.0的TE中，彻底涡旋混匀，则获得 400yL验证探针工作液，其中每个探针的终浓度为1 Ofmo Ι/yL，放置冰上备用。
[0111] 偶联效率验证
[0112]为确保捕获探针和微球偶联的效果，需进行偶联效率验证，具体步骤如下：
[0113] 1)向每个PCR管中加入新鲜配置的偶联微球工作混合物33yL;
[0114] 2)向各个PCR管中加入不同浓度的验证探针，形成不同浓度梯度的验证探针体系， 每个浓度重复3次，各浓度设置如下：
[0115] A.直接分别向三个PCR管中加入17yL TE，每个PCR管的总反应体积为50yL，验证探 针的浓度为〇;
[0116] B.分别向三个PCR管中加入0.5yL验证探针工作液和16.5yL TE，每个PCR管的总反 应体积为50yL，每个反应中，五个验证探针的量分别为5fmol;
[0117] C.分别向三个PCR管中加入lyL验证探针工作液和16yL TE，每个PCR管的总反应体 积为50yL，每个反应中，五个验证探针的量分别为lOfmol;
[0118] D.分别向三个PCR管中加入2yL验证探针工作液和15yL TE，每个PCR管的总反应体 积为50yL，每个反应中，五个验证探针的量分别为20fmol
[0119] E.分别向三个PCR管中加入5yL验证探针工作液和12yL TE，每个PCR管的总反应体 积为50yL，每个反应中，五个验证探针的量分别为50fmol
[0120] F.分别向三个PCR管中加入10yL验证探针工作液和7yL TE，每个PCR管的总反应体 积为50yL，每个反应中，五个验证探针的量分别为1 OOfmo 1
[0121] G.分别向三个PCR管中加入20yL验证探针工作液，每个PCR管的总反应体积为53μ L，每个反应中，五个验证探针的量分别为200fmol
[0122] 3)每个PCR管充分混匀后，置于PCR仪进行杂交反应，反应条件为95°C，5min; 50°C， 15min，然后 52°C 杂交 30min;
[0123] 4)制备新鲜的4yg/mL的SA-PE，用1 X TMAC缓冲液稀释；
[0124] 5)杂交反应完成后，向每个PCR管中加入100yL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗 条件下600rpm震荡孕育lOmin;
[0125] 6)取125yL PCR管的反应液转移至96孔板中，根据Bioplex使用说明书分析荧光 值，判定探针与微球的偶联效率。
[0126] 按照终量为 Ofmol、5fmol、lOfmol、20fmol、50fmol、lOOfmol、200fmol进行系列梯 度稀释后与偶联微球的捕获探针杂交检测。结果如图1-图5所示，结果表明，5个偶联的捕获 探针与验证探针杂交后均具有较高的杂交信号，其荧光中位值MFI随着对应验证探针用量 增加而逐渐上升，说明微球与捕获探针偶联成功。
[0127] 五、密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系
[0128] 1.五重滚环扩增体系
[0129] 将01^、01^、011、01^、011'五个亚种的锁式探针配置成，各自终浓度均为200?111〇1/1 的混合锁式探针。
[0130] 五重滚环扩增体系中，连接反应体系的总体积为20yL，包括：10XTaq DNA ligase 缓冲液2yL，40U/yL Taq DNAligase 0.5yL，各锁式探针浓度200pm〇VL的混合锁式探针1μ L，每种模板2yL，无菌ddH2〇 6.5yL。
[0131] 连接反应采用热循环连接法，反应条件为：94°C4min ;然后进入20个循环：94°C 30s，65°C5min;循环结束后95°C15min灭活Taq DNA ligase，然后置于冰上。
[0132] 取10yL连接产物加入10yL消化反应混合液：（lOXExonuclease I缓冲液2yL，20U/ yL的Exonuclease I 0 · f5yL; 10 XExonucleaseHI缓冲液2yL; 100U/yL的ExonucleaseHIO · 〇5 yL;无菌dd H20补足10yL)，37°C反应2.5h，彻底消化未环化的线性探针和未反应的DNA模 板，最后95°C反应20min，灭活剩余的核酸外切酶，冰上操作。
[0133] 将连接消化后的产物作为模板，用PF/PR扩增引物进行滚环扩增，反应体系为25μ L: 10 XBst DNA polymerase缓冲液2.5yL，8U/yL Bst DNA polymerase。·5yL，10ymol/L PF 0.5yL，10ymol/L PR 0.5yL，10mmol/L dNTPs lyL，消化产物2yL，无菌dd H20补足25yL，冰 上操作。反应条件:62.5°C反应lh。其中滚环扩增下游引物采用带生物素修饰的PR2。
[0134] 2.五重滚环扩增液相芯片检测体系
[0135] 将五种偶联微球:CMN-CP偶联52#微球、CMM-CP偶联45#微球、CMI-CP偶联33#微球、 CMS-CP偶联5W微球、CMT-CP偶联35利^球，混匀，制成偶联微球工作液。
[0136] 将带生物素标记的01^、0丽、011、013、011'的五重滚环扩增产物与混合的偶联微球 工作液杂交。杂交体系为:滚环扩增产物2_10yL、偶联微球工作液33yL、TE Buffer补足50μ L。其中滚环扩增产物的具体用量按照本例的优化方案添加。
[0137] 杂交反应条件为:95°C，5min; 50°C，15min，杂交温度和时间按照本例的优化方案 进行。
[0138] 杂交的过程中，制备新鲜的4yg/mL的SA-PE，用1XTMAC缓冲液稀释。杂交完成后， 向每个PCR管中加入10 OyL SA-TO报告液，充分混匀，室温黑暗条件下6 0 Or pm震荡孕育 l〇min;震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125yL样品在Bio-plex液相芯片上机进行检测分 析，根据中位荧光强度值(MFI)来进行结果判定。
[0139] 本例为了获得五重滚环扩增液相芯片检测体系，首先对杂交温度进行了优化，然 后对杂交时间、滚环扩增产物用量进行了优化。
[0140] 具体的，杂交温度优化设定了46°C、48 °C、50 °C、52 °C、54°C、56°C等6个杂交温度梯 度进行优化，以温度为变量，其他条件完全相同情况下，每个梯度设置3个重复，确定最佳杂 交温度;其他条件包括杂交时间设定为20min，滚环扩增产物的用量为8yL。杂交时间优化设 定了 lOmin、15min、20min、25min、30min、40min等6个时间梯度，以时间为变量，其他条件完 全相同情况下，每个梯度设置3个重复考察不同时间下杂交效果，确定最佳杂交时间；其它 条件包括杂交温度根据优化的结果设定为52°C，滚环扩增产物的用量为8yL。滚环扩增产物 用量的优化设定了 2yL、4yL、6yL、8yL、1 OyL、17yL等6个体积梯度为优化对象，其他条件完全 相同，每个梯度设置3个重复;其它条件包括杂交温度和杂交时间，根据优化结果，设定杂交 温度为52°C，杂交时间为30min。
[0141] 3.捕获探针特异性验证
[0142] 将五条验证探针分别与混合的偶联微球工作液杂交反应，验证探针的用量为 100加〇1。验证探针工作原液浓度为10?1]1〇1/^1^，将五条验证探针分别稀释200倍，获得 50fmol/yL的验证探针工作液。
[0143] 杂交反应体系为:混合的偶联微球工作液33yL、50fmolAiL的验证探针工作液2yL、 TE Buffer 15yL。另外，设置一个空白对照，即以2yL去离子水空白对照替换2yL的50fmolAi L验证探针工作液。
[0144] 杂交反应条件根据优化的五重滚环扩增液相芯片检测体系的反应条件进行，具体 的，95°(：，511^11;50°(：，1511^11，然后52°(：杂交3〇11^11。
[0145] 杂交完成后，向每个PCR管中加入100yL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下 600rpm震荡孕育10min;震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125yL样品在Bio-plex液相芯片 上机进行检测分析，观察五种捕获探针是否有交叉反应，以评估捕获探针的特异性。
[0146] 4.单重滚环扩增产物的五重液相芯片检测
[0147] 将五条锁式探针分别与其阳性样品进行滚环扩增，引物采用带生物素标记的引 物。设置一个去离子水空白对照，即以等体积的去离子水替换阳性样品，其它组分相同，进 行滚环扩增。
[0148] 单重滚环扩增体系中，连接反应体系的总体积为20yL，包括：10XTaq DNA ligase 缓冲液2yL，40U/yL Taq DNAligase 0.5yL，200pmol/L的锁式探针lyL，模板2yL，无菌ddH20 14.5yL〇
[0149] 滚环扩增的消化反应，以及后续的滚环扩增与"1.五重滚环扩增体系"相同，在此 不累述。
[0150] 滚环扩增完成后，将五个滚环扩增产物分别与混合的偶联微球工作液杂交反应。 本例采用的五个阳性样品分别为菌株编号470324的CMN菌株的DNA、菌株编号470316的CMM 菌株的DNA、菌株编号470343的CMI菌株的DNA、菌株编号470330的CMS菌株的DNA、菌株编号 470326 的 CMT 菌株的 DNA。
[0151] 杂交反应体系为:滚环扩增产物2yL、偶联微球工作液33yL、TE Bufferl5yL。
[0152] 杂交反应条件为:95°(：，511^11;50°(：，151^11，然后52°(：杂交3〇1^11。
[0153] 杂交完成后，向每个PCR管中加入100yL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下 600rpm震荡孕育lOmin;震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125yL样品在Bio-plex液相芯片 上机进行检测分析，观察实际扩增产物能否与捕获探针杂交产生荧光中位值，各产物与偶 联微球之间是否出现交叉反应。
[0154] 5.密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系特异性
[0155] 选取菌株 CMI(470343、470344)、CMT(470326、470327)、CMS(470330、470333)、CMM (470308、470313、470316)、01^(470321、470324、470325)的0嫩作为单一或协同阳性模板， 其他菌株的DNA作为阴性模板，无菌双蒸水作为空白对照，采用五条锁式探针制备的混合锁 式探针，进行五重滚环扩增。滚环扩增采用的引物为生物素标记的引物。最后将滚环扩增产 物与混合的偶联微球工作液杂交，评估该检测体系的特异性。
[0156] 五重滚环扩增体系中，连接反应体系的总体积为20yL，包括：10XTaq DNA ligase 缓冲液2yL，40U/yL Taq DNAligase 0.5yL，各锁式探针浓度200pm〇VL的混合锁式探针1μ L，模板 2yL，无菌 ddH2〇 14.5yL。
[0157] 后续的消化和滚环扩增与"1.五重滚环扩增体系"相同，在此不累述。
[0158] 杂交反应体系为:滚环扩增产物2yL、偶联微球工作液33yL、TE Bufferl5yL。
[0159] 杂交反应条件为:95°(：，511^11;50°(：，151^11，然后52°(：杂交3〇1^11。
[0160] 杂交完成后，向每个PCR管中加入100yL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下 600rpm震荡孕育10min;震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125yL样品在Bio-plex液相芯片 上机进行检测分析，观察阳性模板是否能够有效的检测出五个密执安棒状杆菌亚种，而其 它阴性模板和空白对照是否符合预期。
[0161 ] 6.密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系灵敏度
[0162] 为评估CMI、CMT、CMS、CMM、CMN五重液相悬浮芯片检测灵敏度，分别选取CMI (470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)、CMN(470324)作为标准阳性菌株，提取 DNA，利用核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，并制成五重混合模板，按10倍梯度进行稀释 至10-6倍。
[0163] 同时，将该五种菌株分别制成纯菌悬液，利用紫外分光光度计，在波长600nm下调 节其光密度值为0.1，并利用无菌水稀释至ΚΓ 8倍，然后分别取100yL的10-6，1〇_7，1〇_8倍梯度 稀释的菌悬液涂于ΝΑ培养基，每个处理3次重复，置于30°C黑暗培养5天后记录菌落数确定 实际的菌悬液浓度，单位cfu/mL。同时将五种菌株的分别制成的纯菌悬液原液混合，制成混 合模板，并按10倍梯度进行稀释至1〇_ 8倍，分别取l〇yL各稀释梯度的混合DNA和混合菌悬液 进行五重滚环扩增，然后对滚环扩增产物进行液相芯片检测，最终确定五重液相芯片检测 灵敏度。
[0164] 五重滚环扩增体系中，连接反应体系的总体积为20yL，包括：10XTaq DNA ligase 缓冲液2yL，40U/yL Taq DNAligase 0.5yL，各锁式探针浓度200pm〇VL的混合锁式探针1μ L，模板 2yL，无菌 ddH2〇 14.5yL。
[0165] 后续的消化和滚环扩增与"1.五重滚环扩增体系"相同，在此不累述。
[0166] 杂交反应体系为:滚环扩增产物2yL、偶联微球工作液33yL、TE Bufferl5yL。
[0167] 杂交反应条件为:95°(：，511^11;50°(：，151^11，然后52°(：杂交3〇1^11。
[0168] 杂交完成后，向每个PCR管中加入100yL SA-PE报告液，充分混匀，室温黑暗条件下 600rpm震荡孕育lOmin;震荡孕育完成后，从PCR反应液中取125yL样品在Bio-plex液相芯片 上机进行检测分析。
[0169] 观察DNA模板和菌悬液模板两者分别可以检测的浓度下限，从而判断五重滚环扩 增液相芯片检测体系的灵敏度。
[0170] 7.密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系重复性
[0171] 以CMN、CMM、CMI、CMS、CMT五个亚种的混合DNA作为模板，采用五条锁式探针制备的 混合锁式探针，进行五重滚环扩增。滚环扩增采用的引物为生物素标记的引物。最后将滚环 扩增产物与混合的偶联微球工作液杂交，评估该检测体系的特异性。在相同条件下做3次重 复性试验，计算其变异系数(CV% )，以此验证密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测 体系的重复性。
[0172] 变异系数(CV% )=标准差/算数平均值X 100%
[0173] 六、结果及分析
[0174] 1.五重滚环扩增液相芯片检测体系
[0175] 杂交温度优化:本例设置了46°C、48°C、50°C、52°C、54°C、56°C等6个杂交温度梯度 进行优化，结果表明：五重滚环扩增产物与混合的偶联微球工作液的杂交温度在46 °C_52°C 之间时，五种靶标菌被检测到的荧光中位值都逐渐上升;在52 °C -56 °C之间，五种靶标菌被 检测到的荧光中位值都逐渐减少，如图6所示。综合考虑，最终确定该五重检测中杂交最佳 温度为52°C。
[0176] 杂交时间优化:本例设置了 1〇111；[11、15111；[11、20111；[11、25111；[11、30111；[11、40111；[11等6个时间梯 度。结果显示，以最佳杂交温度52°C进行杂交时，五重滚环扩增产物与混合的偶联微球工作 液的杂交时间从l0min到30min时，其荧光中位值缓慢升高；当杂交时间从30min到40min时， 五个靶标菌的荧光中位值都减少;如图7所示。可见30min是比较明显的拐点，因此，确定最 佳杂交时间为30min。
[0177] 滚环扩增产物用量优化:本例设定了 2以1^、4以1^、6以1^、8以1^、1(^1^、17以1^等6个体积梯 度。结果显示，以最佳杂交温度52 °C、最佳杂交时间30min进行杂交时，随着加入体系中滚环 扩增产物体积的增加，五种靶标菌的检测荧光强度值相应降低，如图8所示，因此确定最佳 添加体积为2yL。
[0178] 最终确定五重滚环扩增液相芯片检测体系的最佳杂交温度为52°C、最佳杂交时间 为30min，杂交反应中滚环扩增产物的用量为2yL。
[0179] 2.捕获探针特异性验证
[0180] 采用五条验证探针分别与混合的偶联微球工作液杂交反应，判断五种捕获探针是 否有交叉反应，以评估捕获探针的特异性。其中验证探针相当于最理想的扩增产物，与捕获 探针完全反向互补，倘若有交叉反应，现实的扩增产物理论上也会出现交叉反应，所以出现 交叉反应将无法进行后续检测。
[0181]本例的五条捕获探针的特异性验证结果如表3所示，结果显示，本例的五条验证探 针仅与其对应的偶联微球有杂交，而与其它微球无杂交，可见，本例的五条捕获探针具有良 好的特异性。
[0182] 表4验证探针对捕获探针特异性验证结果
[0183]
[0184] 表4中，结果判定"CMI/CMT/CMS/CMM/CMN"栏，"+"表示检出为阳性，表示检出为 阴性;例如表示"CMI"阳性，其余为阴性；表示"CMT"阳性，其余为 阴性；以此类推。
[0185] 3.单重滚环扩增产物的五重液相芯片检测
[0186]本例将五条锁式探针分别与其阳性样品进行滚环扩增，五个滚环扩增产物分别与 混合的偶联微球工作液杂交反应。结果如表5所示，阳性样品与预设的对应的偶联微球有杂 交信号，而与其它偶联微球没有杂交信号，例如CMN的阳性样品滚环扩增产物，仅与52#微球 有杂交信号，其它偶联微球没有杂交信号。该检测结果与捕获探针特异性验证结果相同。
[0187]表5单重滚环扩增产物的五重液相芯片检测
[0188]
[0189] 表5中，结果判定"CMI/CMT/CMS/CMM/CMN"栏，"+"表示检出为阳性，表示检出为 阴性;例如表示"CMI"阳性，其余为阴性；表示"CMT"阳性，其余为 阴性；以此类推。
[0190] 4.五重滚环扩增液相芯片检测体系特异性
[0191] 本例以CMN、CMM、CMI、CMS、CMT五个亚种的混合DNA作为阳性模板，其他17个菌株的 DNA作为阴性模板，无菌双蒸水作为空白对照，进行五重滚环扩增，扩增完成后与混合的偶 联微球工作液杂交。
[0192] 结果如表6和图9所示，当样品1中包含CMI、CMT、CMS、CMM、CMN五种混合DNA时，五重 检测体系可以同时检测到33、35、51、45、52号微球的荧光中位值分别为360、528.5、587、 321、403，根据结果判定全部为阳性。当样品2中只含011、011\?1、(：丽四种混合0嫩时五重 检测体系可以同时检测到33、35、45、52号微球的荧光中位值分别为374.5、619.8、461.5、 682，而无靶标对应的51号微球仅显示背景值，根据结果判定CMI、CMT、CMM、CMN样品检测均 呈阳性。同样，当样品同时含有3种、2种或1种阳性靶标DNA时，五重检测体系均可同时检测 出对应微球显示阳性信号，而当仅存在其他非靶标菌DNA时，五种微球菌未出现强荧光值， 表明该五重检测体系可在同一反应同时检测出CMI、CMT、CMS、CMM、CMN协同混合模板，也可 以检测出单一靶标菌DNA模板，而其他对照菌株结果均为阴性。因此，该CMI、CMT、CMS、CMM、 CMN五重检测方法具有较好的特异性。
[0193] 表6五重滚环扩增液相芯片检测体系特异性检测结果
[0194]
[0195] 表6 中，1表示CMI (470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)、CMN (470324)混合 DNA;2 表示〇11(470343)、〇11'(470326)、〇丽(470316)、〇1^(470324)混合0嫩；3 表示CMI(470343)、CMT(470326)、CMN(470324)混合DNA;4表示CMS(470330)、CMM(470316)混 合DNA; 5表示CMM(470316); 6表示CMM(470308); 7表示CMN(470324);8表示CMN(470325); 9表 示CMT(470326); 10表示CMT(470327); 11 表示CMI(470343); 12表示CMI(470344); 13表示CMS (470330); 14表示CMS(470333) ; 15表示AC(470106); 16表示CFF(470366) ; 17表示XCC (470703) ;18表示PSST(470522) ;19表示PSPI(470580) ;20表示PST0(470537) ;21 表示EA (470404); 22表示空白对照。结果判定"CMI/CMT/CMS/CMM/CMN"栏，"+"表示检出为阳性， 表示检出为阴性;例如表示"CMI"阳性，其余为阴性；表示"CMT"阳 性，其余为阴性；以此类推。
[0196] 5.五重滚环扩增液相芯片检测体系灵敏度
[0197] 将菌株 CMI(470343)DNA 原始浓度为 14.8即/^1^、011'(470326)0嫩原始浓度为171^/ yL、CMS(470330)DNA 原始浓度为 57.9叫/^1^、01?(470316)0财原始浓度161^/^1^〇1? (470324)DNA原始浓度56.6ngAiL等体积混匀后按10倍梯度稀释，取各梯度混合DNA作为模 板进行五重检测，其结果见表7,可见011、011\01^、《1、01^五重液相悬浮芯片检测体系能 检测到CMT、CMM和CMN祀标菌稀释倍数为10- 4的DNA，以及CMI和CMS靶标菌稀释倍数为10_5的 DNA，其对应的微球荧光强度仍大于空白荧光值的3倍，判定为阳性，即CMI、CMT、CMS、CMM、 CMN 靶标菌 DNA 最低浓度值分别为 148f g/yL、1 · 7pg/yL、579f g/yL、1 · 6pg/yL、5 · 66pg/yL。当 混合DNA稀释倍数为1(T6时，该五种微球荧光值均显阴性。表明该五重检测体系能够检测到 靶标菌DNA的阀值为148f g/yL。
[0198] 表7五重滚环扩增液相芯片检测体系DNA检测灵敏度
[0199]
[0200] 表7中10°表示原始浓度，10-1表示10倍稀释，以此类推，Blank为水空白对照。
[0201 ]将菌株CMI(470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)和CMN(470324)混 合配制成l(T2-l(T8CFU/mL的不同梯度菌悬液，然后分别进行连接消化、滚环扩增以及后续 的五重液相悬浮芯片检测，结果如表8所示，结果可见，当混合菌悬液的浓度为l(T 4Cfu/mL 时，33#、35#、51#、45#和52#五个偶联微球的荧光中位值分别为93、151.5、141.5、124、142， 均大于3倍空白对照的荧光值，即检测结果为阳性;当混合菌悬液的浓度为l(T 3CFU/mL时，仅 35#、45#和52#微球的荧光中位值分别为129.5、140和94，并大于3倍的空白对照样品的荧光 值，即检测结果都为阳性，而33#和51#微球的荧光中位值都不能大于3倍的空白对照样品的 荧光值，即检测结果都为阴性；当混合菌悬液的浓度为l(T 2CFU/mL时，五者的荧光中位值都 不能大于3倍的空白对照样品的荧光值，即检测结果都为阴性，表明该五重检测体系能够检 测到CMT、CMM和CMN的菌悬液浓度阈值为10_ 4CFU/mL，以及CMI和CMS的菌悬液浓度阈值为10 -3CFU/mL〇
[0202] 表8五重滚环扩增液相芯片检测体系菌悬液检测灵敏度
[0203]
[0204] 6.密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系重复性
[0205] 通过提取 CMI(470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316#PCMN(470324) 的DNA进行连接消化以及滚环扩增，然后通过五重液相悬浮芯片体系进行三次重复性检测， 并通过计算各批次间检测的平均荧光值的变异系数，以判断检测方法的重复性，结果如表9 所示。
[0206]表9密执安棒状杆菌五重滚环扩增液相芯片检测体系重复性
[0208] 表9的结果显示，检测CMI的33#号微球、检测CMT的35#号微球、检测CMS的51#号微 球、检测CMM的45#号微球和CMN的52#号微球的荧光中位值都在300以上，三次重复试验的平 均荧光值变异系数分别为6.7%、3.7%、8.3%、9.0%和7.3%，以及空白对照的背景荧光值 变异系数也为2.8%，均在10%以内，表明该方法具有良好的可重复性。
[0209]以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申 请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护 范围。
【主权项】
1. 一种密执安棒状杆菌多重检测试剂，其特征在于:所述多重检测试剂中含有五条锁 式探针，五条锁式探针分别为Seq ID No. 1所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis 特异性锁式探针、Seq ID Νο·2所不;序列的 Clavibacter michiganensis sub sp .mi chi ganen s is特异性锁式探针、Seq ID Νο·3所;^ 序列的 Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针、Seq ID Νο·4所;^序列 的Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针、Seq ID Νο·5所;^序 列的Clavibacter michiganensis subsp·tessellarius特异性锁式探针。2. 根据权利要求1所述的密执安棒状杆菌多重检测试剂在密执安棒状杆菌滚环扩增检 测、滚环扩增液相芯片检测中的应用。3. -种密执安棒状杆菌的滚环扩增检测方法，其特征在于:包括采用权利要求1所述的 多重检测试剂，对待测样品进行滚环扩增，通过五条锁式探针的扩增情况判断待测样品中 是否含有 Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis^Clavibacter michiganensis subsp·insidiosus、 Clavibacter michiganensis subsp·sepedonicus和/或Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius〇4. 一种密执安棒状杆菌的滚环扩增液相芯片检测方法，其特征在于:包括以下步骤， (1) 提取待测样品的DNA样本； (2) 采用权利要求1所述的多重检测试剂，对提取的DNA样本进行滚环扩增； (3) 将五种偶联微球对滚环扩增产物进行杂交和液相芯片分析，获得检测结果； 所述五种偶联微球分别为偶联有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis 特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp . ins id io sus特异性锁式探针Z ip序列的液相芯片微球、偶联有 Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微 球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp·tessellarius特异性锁式探针Zip序列的 液相芯片微球。5. 根据权利要求4所述的滚环扩增液相芯片检测方法，其特征在于:所述Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip序列为Seq ID Νο·6所;^序列，所 述Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No. 7所;^序列，所述Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus特异性锁式探针Zip 序列为Seq ID No .8所;^序列，所述Clavibacter michiganensis subsp .sepedonicus特异 性锁式探针Zip序列为Seq ID No. 9所示序列，所述Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针Zip序列为Seq ID No. 10所示序列D6. -种密执安棒状杆菌多重检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中含有权利要求1所 述的密执安棒状杆菌多重检测试剂。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还含有所述五条锁式探针 的通用引物，所述通用引物包括第一引物，所述第一引物为Seq ID No. 11所示序列。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述通用引物还包括第二引物，所述第 二引物为Seq ID No. 12所示序列。9. 根据权利要求6-8任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还含有所述五条 锁式探针的五条捕获探针，所述五条捕获探针分别为Seq ID No.6所示序列或其反向互补 序列、Seq ID No.7所示序列或其反向互补序列、Seq ID No.8所示序列或其反向互补序列、 Seq ID No.9所示序列或其反向互补序列、Seq ID No. 10所示序列或其反向互补序列。10. 根据权利要求6-8任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还含有用于液 相芯片检测的，五条锁式探针的五种偶联微球，所述五种偶联微球分别为偶联有 Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微 球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis特异性锁式探针Zip序列的 液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus特异性锁式探针 Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus特异性 锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp. tessel Iarius特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球。
【文档编号】C12Q1/04GK105886644SQ201610355680
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】冯建军, 王忠文, 吴绍精, 龙海, 陈枝楠
【申请人】深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心, 深圳市检验检疫科学研究院