用于干细胞的培养基的制作方法

用于干细胞的培养基的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于储存、保存、培养和/或分化干细胞的培养基。培养基采用分散在水性媒介物中的合成的热响应共聚物，其允许培养基通过简单地调整温度跨过培养基的胶凝温度容易地在非凝胶状(流体)形式和凝胶状形式之间“转换”。如此，干细胞可以通过以下被容易地捕获在3D凝胶基质中：将干细胞与非凝胶状/流体形式的培养基简单混合、并且然后通过调整温度跨过培养基的胶凝温度使培养基胶凝。被包封在凝胶状形式的培养基内的干细胞然后可在直接使用培养基中的干细胞之前(例如，在治疗中或在培养、分化等中)、或在所述干细胞从培养基提取之后的使用之前被保存很长一段时间。
【专利说明】用于干细胞的培养基
[0001] 引言
[0002] 本发明涉及用于储存、保存、培养和/或分化干细胞的培养基。本发明还涉及使用 本发明的培养基储存、保存、培养和/或分化干细胞的方法，以及用于形成本发明的培养基 的试剂盒，和包含分散在本发明的培养基中的干细胞的组合物（例如，药物组合物）。
[0003] 背景
[0004] 干细胞是多年来密集研究的焦点。对干细胞的生物学和功能存在固有的兴趣以及 对其潜在的治疗用途存在浓厚的兴趣。
[0005] 在医学领域中，研究者认为干细胞具有彻底改变某些人类疾病的治疗的潜能。事 实上，很多成体干细胞治疗已经存在，诸如在治疗白血病中使用的骨髓移植物。在将来，医 学研究者期望能够使用源自干细胞研究的技术以治疗广泛范围的疾病，除了一些其他损害 和状况之外包括癌症、帕金森氏疾病、脊髓损伤、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症 和肌肉损伤。
[0006] 对于正在进行的干细胞研究和将来基于干细胞的治疗的开发，对培养干细胞的有 效且有成本效益的方法存在需求。特别是对能够在储存、运输和培养期间维持干细胞的活 力和表型的培养基存在需求。还对可以：（i)被容易地被灭菌；（ii)消除或最小化生物材料 的存在；并且（iii)当期望时允许干细胞从培养基容易地收集并分离的干细胞培养基存在 需求。
[0007] 目前在市场上的干细胞培养基产品使用动物来源的材料，由于其组成中批次间的 变化性，其是次佳的。
[0008] 因此，本发明的目的是提供满足一些或所有前述需求的用于干细胞的培养基。
[0009] 发明概述
[0010] 根据本发明的第一方面，提供了用于干细胞的培养基，所述培养基包含分散在水 性媒介物中的合成的热响应共聚物的颗粒；
[0011] 其中培养基能够响应温度变化经受非凝胶状形式和凝胶状形式之间的变化，并且 在非凝胶状形式中，培养基包含合成的热响应共聚物的颗粒的胶状稳定的水性分散体，并 且在凝胶状形式中，培养基是提供能够容纳干细胞的支架或基质的凝胶形式；
[0012] 并且其中水性媒介物还包含用于维持干细胞的活力的营养物。
[0013] 根据本发明的第二方面，提供了一种干细胞组合物，所述干细胞组合物包含分散 在根据本发明第一方面的培养基中的一种或更多种干细胞。
[0014] 根据本发明的第三方面，提供了制备根据本发明第二方面的干细胞组合物的方 法，所述方法包括：
[0015] (i)使非凝胶状形式的根据本发明第一方面的培养基与一种或更多种干细胞接触 以产生流体干细胞组合物（即，干细胞在培养基中的流体分散体）；以及
[0016] (ii)任选地改变培养基的温度使得培养基从非凝胶状形式改变为凝胶状形式，从 而产生胶凝的干细胞组合物，其中干细胞被分散在胶凝的培养基中。
[0017] 根据本发明的第四方面，提供了储存或保存一种或更多种干细胞的方法，所述方 法包括：
[0018] (i)使非凝胶状形式的根据本发明第一方面的培养基与一种或更多种干细胞接触 以产生流体干细胞组合物；
[0019] (ii)改变培养基的温度使得培养基从非凝胶状形式改变为凝胶状形式并且从而 产生胶凝的干细胞组合物；以及
[0020] (iii)储存胶凝的干细胞组合物。
[0021] 根据本发明的第五方面，提供了培养干细胞的方法，所述方法包括：
[0022] (i)使非凝胶状形式的根据本发明第一方面的培养基与一种或更多种干细胞接触 以产生流体干细胞组合物；
[0023] (ii)改变培养基的温度使得培养基从非凝胶状形式改变成凝胶状形式并且从而 产生胶凝的干细胞组合物；以及
[0024] (iii)在胶凝的干细胞组合物内培养干细胞。
[0025] 根据本发明的第六方面，提供了分化干细胞的方法，所述方法包括：
[0026] (i)使非凝胶状形式的根据本发明第一方面的培养基与一种或更多种干细胞接触 以产生流体干细胞组合物；
[0027] (ii)改变培养基的温度使得培养基从非凝胶状形式改变成凝胶状形式并且从而 产生胶凝的干细胞组合物；以及
[0028] (iii)在促进干细胞的分化的条件下培养干细胞。
[0029] 根据本发明的第七方面，提供了从如本文定义的胶凝的干细胞组合物释放一种或 更多种干细胞的方法，所述方法包括：
[0030] (i)提供胶凝的干细胞组合物，所述胶凝的干细胞组合物包含分散在凝胶状形式 的根据第一方面的培养基中的一种或更多种干细胞；
[0031] (ii)改变干细胞培养基的温度使得培养基从凝胶状形式改变成非凝胶状形式，从 而产生流体干细胞组合物；以及
[0032] (iii)任选地其后从流体干细胞组合物分离所述干细胞。
[0033] 根据本发明的第八方面，提供了制备根据本发明第一方面的培养基的方法，所述 方法包括使所述合成的热响应共聚物的颗粒分散在水性媒介物中，所述水性媒介物还包含 用于维持干细胞的活力的营养物。
[0034] 根据本发明的第九方面，提供了用于制备根据本发明第一方面的培养基的试剂 盒，所述试剂盒包括：
[0035] (i)合成的热响应共聚物的颗粒，如本文定义的；以及
[0036] (ii)水性媒介物，所述水性媒介物还包含用于维持干细胞的活力的营养物。
[0037] 根据本发明的第十方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明第 二方面的干细胞组合物和任选地一种或更多种药学上可接受的赋形剂。
[0038] 根据本发明的第十一方面，提供了根据第十方面的药物组合物，用于在治疗中使 用。
[0039] 根据本发明的第十一方面，提供了根据第十方面的药物组合物，用于在细胞治疗 中使用。
[0040] 根据本发明的第十二方面，提供了如本文定义的培养基用于储存、保存、培养和/ 或分化一种或更多种干细胞的用途。
[0041] 本领域技术人员将理解的是，除非另有声明，包括本发明的任何特定方面的任选 的、合适的和优选的特征的特征可以适用于包括本发明的任何其他方面的任选的、合适的 和优选的特征的特征。
[0042] 附图简述
[0043] 本发明的实施方案在下文中参考附图被进一步描述，其中：
[0044] 图1是d4-甲醇中记录的PGMA45-PHPMA n。和PGMA 45的虫NMR光谱。
[0045] 图2显示了 10 % w/w PGMA45-PHPMAn。双嵌段共聚物分散体的损耗模量和储能模量 的温度依赖性。临界凝胶化温度（CGT)被估计为17°C。
[0046] 图 3 是 d4-甲醇中记录的粗 PGMA55-P (HPMAS4-stat-DEGMA36)的1H NMR 光谱。
[0047] 图 4 显示了 10% w/w PGMA55 - P(HPMAS4-stat-DEGMA36)双嵌段共聚物的损耗模量 和储能模量的温度依赖性。临界凝胶化温度（CGT)被估计为26°C。
[0048] 图5显示了凝胶内（培养4天后）的胚胎干细胞聚集物。直至培养期的结束存在 少的聚集物扩展。
[0049] 图6显示了 21天之后从凝胶恢复的胚胎干细胞聚集物。聚集物显示出相对少的 分化的形态学指示。
[0050] 图7显示了培养21天之后从凝胶恢复的并且传代进入标准胚胎干细胞培养的胚 胎干细胞聚集物。在48h之后，形成胚胎干细胞的集落并且从聚集物扩展（标有箭头的）。
[0051] 图8显示了之前在蠕虫凝胶（worm gel)/细胞复合培养基中孵育21天的胚胎干 细胞聚集物的用抗体表面标志物Tra-1-60 (多能性（pluripotency))、SSEA-4 (多能性）、 SSEA1 (分化）标记的细胞的比例的FACS分析的直方图。
[0052] 图9显示了培养21天之后从凝胶恢复并且传代进入标准胚胎干细胞培养的胚胎 干细胞聚集物。在培养14天之后，聚集物显示出形态分化为多种细胞类型。
[0053] 图10显示了被平铺至具有单独的培养基（对照-无凝胶）的孔的胚胎干细胞凝 聚物的用抗体表面标志物Tra-1-60 (多能性）、SSEA-4 (多能性）、SSEA1 (分化）标记的细 胞的比例的FACS分析的直方图。
[0054] 图11显示了取决于温度形成不同形态的PGMA-HPMA嵌段共聚物。
[0055] 图12显示了 MTS测定。在组织培养塑制品（2D)中和PGMA-PHPMA共聚物凝胶（3D) 中培养NTERA2克隆D1细胞直至7天。
[0056] 图13显示了 NTERA克隆D1 EC细胞的肌动蛋白/DAPI染色。蠕虫凝胶和2D平面 基底（组织培养塑制品）之间的比较显示了细胞的增殖直至7天。
[0057] 图14显示了通过免疫荧光分析的标志物表达。在3D(蠕虫凝胶）和2D(组织培 养塑制品）中，用视黄酸培养NTERA2克隆D1 EC细胞7、14、21天之后，TRA 1-60多能性标 志物表达（红色）和DAPI核酸染色（蓝色）。在3D (蠕虫凝胶）和2D (组织培养塑制品） 中，用视黄酸培养NTERA2克隆D1 EC细胞7、14、21天之后，Vin2Pb22分化标志物表达（红 色）和DAPI核酸染色（蓝色）。
[0058] 图15显示了通过qPCR分析的标志物表达。Nanog、0ct_04和β 3微管蛋白、h-ASHl 分别为在用视黄酸培养14天之后对NTERA2克隆D1 EC细胞分析的多能性和分化标志物。 值表示为Δ/ACt值。
[0059] 图16显示了 HDF细胞活力针对PGMA55-PHPMA135共聚物蠕虫凝胶的优化。针对在细 胞培养基中产生共聚物蠕虫凝胶，三种方案被评价。方案1 (在150mM PBS中制备20% w/ v共聚物凝胶，稀释两倍并且对PBS透析两天），方案2 (与方案1相同，但透析7天），方案 3 (与方案2相同，随后冷冻干燥过夜并且再分散在纯细胞培养基（DMEM)中）。利用与细胞 单层的直接接触测定以及使用ThinCert插入物的间接测定两者来评价HDF细胞活力。MTT 测定被用来评价在37°C下的细胞活力。实验以一式三份（N = 3)来实施Γρ〈0. 0l/p〈0. 05。
[0060] 图17显示了使用PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶，用于hES细胞集落的凝胶化/去凝胶 化过程。A)机械地收获在t25容器内的Nutristem中生长的集落并且在8孔ibidi载玻片 上立即凝胶化。使含有细胞集落的凝胶在增湿的培养箱（5% C02/95%空气）中于37°C维持 超过7、14或21天。B)在每一个时间点之后，将ibidi孔置于冰上5分钟以引起凝胶化。然 后将含有细胞集落的自由流动的冷的共聚物分散体在含有Nutristem培养基的Cellstart 处理的6孔板中稀释约10倍以释放集落。
[0061] 图18显示了使用共聚焦显微术对浸入PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶内的hES细胞集 落的存活/死亡成像。在37°C使用Syto 9和碘化丙啶（PI)染料对浸入蠕虫凝胶（根据 方案3制备的）内7、14或21天的细胞集落存活/死亡染色之后记录的代表性荧光显微图 像。细胞可渗透的染料Syto-9报告细胞膜完整性（活细胞），而细胞不可渗透的染料PI仅 染色死细胞。Hoechst 33342被用作核复染剂。
[0062] 图19显示了 hES细胞集落在其于37°C在使用Nutristem制备的PGMA55-PHPMA135 蠕虫凝胶中长期储存之后的恢复。集落恢复％被计算为每个时间点的平均集落恢复（在去 凝胶化之前将SEM对集落的初始数目归一化）。集落损耗％也被相似地评价。内部对照组 也被包含在该研究中，其中将集落浸入蠕虫凝胶中约l〇min，冷却至5°C以引起去凝胶化并 且随后通过离心分离。实验在一式三份的孔的样品中执行，η = 3次独立实验。
[0063] 图20显示了原始hES集落大小对在37°C于蠕虫凝胶中长期储存14天之后、随 后经由冷却至5°C的去凝胶化的分离的集落恢复的影响。将hES集落机械地分散在包含 Nutristem细胞培养基的水性PGMA-PHPMA蠕虫凝胶中并且在37°C储存14天。然后将集落 通过冷却至5°C的去凝胶化分离并且随后将集落平铺在Cellstart和Nutristem液体培养 基上。（A)-(E)培养5天后多种hES细胞集落的光学显微图像。小集落（〈100 μπι)表现出 (Α)随时间推移最小的生长和分化或（Β)在去凝胶化之后未能旺盛生长。（C)对于尺寸大 于100 μ m的集落，获得了改进的附着和生长并且（D)对于100-200 μ m的集落，获得了最佳 生长，其还表现出典型的ES细胞形态。（E)在高密度培养物中，在相对大的（》200 μπι)集 落的边缘观察到分化的神经元细胞。痕迹线表示初始去凝胶化后原始集落大小。
[0064] 图21显示了在37°C浸入6% w/v PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶内直至21天的hES细 胞的增殖曲线。集落通过在相关时间点（〇、7、14和21天）的去凝胶化而被收获并且收获 并定量总DNA，如在实施例9中描述的。将数据对从在第0天接种的集落获得的初始DNA量 归一化（作为100% )。数据代表一式两份的孔中执行的η = 3次实验的平均值。光学显 微图像（参见插图）表明集落大小随时间推移的非常小的变化，其与非增殖的观察结果是 一致的。
[0065] 图22显示了免疫标记实验，其如在实施例9中描述的被实施。（Α)在液体培养基 和Cellstart基质中正常增殖期间hES细胞集落针对ki-67被阳性染色。然后将集落机 械地移除并且在37°C浸入含有Nutristem培养基的PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶内持续（B) 7 天、（D) 14天和（F) 21天。尽管浸入蠕虫凝胶内，对任何细胞集落（B、D和F)都未检测到 ki-67蛋白质。在（C)7天、（E) 14天和（G)21天之后通过去凝胶化分离集落，再平铺至用 Cellstart包被的孔上并且在Nutristem培养基中生长5天，然后实施另外的ki-67的免疫 标记实验。在所有情况（参见C、E和G)中，ki-67的存在通过阳性染色（Cy3,红色）来确 认。核复染剂（Hoechst 33342,蓝色）。实验在一式三份的孔中执行，η = 3次独立实验。
[0066] 图23显示了在18-22°C储存直至72h之后hES细胞集落的恢复。在每一个时间点 (即24h、48h或72h)之后，将储存在液体Nutristem中的hES细胞集落返回至正常细胞培 养条件（37°C，于增湿的培养箱（5% C02/95%空气）中），而将储存在6% PGMA55-PHPMA135 蠕虫凝胶内的hES细胞集落通过去凝胶化分离，如之前描述的。将细胞集落留置在细胞培 养箱中过夜以恢复。光学显微图像表明在16h的恢复时间段之后细胞集落的典型外观。
[0067] 图24显示了于37°C在传统的液体3i细胞培养基或使用相同的3i培养基制备的 6% PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶内储存24h之后的hES细胞恢复。（A)将于37°C在传统的液 体3i培养基内储存24h的个体hES细胞的悬浮液在Cellstart包被的6孔板上培养。（B) 于37°C在增湿的培养箱（5% C02/95%空气）中储存24h之后将浸入6% PGMA55-PHPMA135蠕 虫凝胶内的hES细胞通过去凝胶化分离并且平铺在Cellstart包被的6孔板上。允许细胞 培养物粘附至Cellstart包被的6孔板上16h并且然后通过光学显微术检查。不考虑其储 存条件，观察到与多能性干细胞有关的典型形态。
[0068] 图25显示了（a)在1. 0%的应用的应变和1. Orad s 1的固定的角频率下，凝胶强 度（G<、G")对将6%w/v PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶（根据方案3通过将冷冻干燥的共聚 物粉末在4°C分散入多种水性培养基中制备；详细请参见标记）从37°C冷却至2°C的温度 依赖性。（b)凝胶强度（G<、G")在lrads 1的角频率、37°C下随应用的应变的变化。（C) 对于多种细胞培养基中的6%w/v PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶，凝胶强度（G<、G")随角频 率（在1. 0%的固定的应用应变下）的变化。
[0069] 发明详述
[0070] 定义
[0071] 除非有相反的特别声明，根据1巴的一般大气压的推定给出所有温度、温度范围、 和对应所述温度的材料的任何特征/特性。
[0072] 本文中，术语"干细胞"指的是可以分裂并分化为广泛范围的特定细胞类型的细 胞，并且还可以自我更新/复制以产生呈其未分化状态的更多干细胞。尽管干细胞现在可 以人工生长，但是哺乳动物干细胞包括从囊胚的内细胞团分离的"胚胎干细胞"，以及在包 括以下的多种组织中发现的"成体干细胞"：
[0073] -骨髓，其需要通过钻入骨骼（例如股骨或髂骨）中提取；
[0074] -脂肪组织（脂质细胞），其需要通过抽脂术提取；
[0075] -血液，其需要通过单采术（pheresis)提取，其中血液从供体提取，通过提取干细 胞的机器并且将血液的其他部分返回至供体；以及
[0076] -刚出生后的脐带血。
[0077] 本文中，"干细胞"包括全能性（totipotent)和多能性（pluripotent)干细胞（其 可以成熟为任何细胞类型），以及多能（multipotent)或单能（unipotent)祖细胞（在其 能变成的细胞类型方面其是更局限的）。最合适地，用于本发明的"干细胞"包括全能性和 /或多能性干细胞，特别是多能性干细胞。
[0078] 本文中，术语"全能性"指的是可以分化为胚胎和胚外细胞类型并且可以导致完整 的活的生物体的构建的干细胞。此类细胞通过融合卵细胞和精细胞来产生，并且通过受精 卵的最初几个循环的分裂来进一步产生。
[0079] 本文中，术语"多能性"指的是已经从全能性干细胞传代的干细胞，并且其可分化 为来自以下三个胚层的任何一种的基本上所有细胞类型：即内胚层（内部胃黏膜、胃肠道、 肺）、中胚层（肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器）或外胚层（表皮组织和神经系统）。尽管多 能性细胞可以导致任何胎儿或成体细胞类型，但是其自身不能发育成胎儿或成体生物体， 因为其缺少促成胚外组织（例如，胎盘）的能力。多能性干细胞（诸如卵裂球）可以从哺 乳动物胚胎的内细胞团（ICM)获得。
[0080] 本文中，术语"多能"或"多能祖细胞"指的是仍可以分化为许多细胞类型，但仅是 密切相关家族的那些的干细胞。如此，多能细胞具有比全能性或多能性干细胞更局限的命 运。多能祖细胞可以长时间自我更新，但不同于多能性干细胞，并不是无限期地。多能祖细 胞也已经被称为"成体干细胞"或"间充质基质细胞"以表示存在于非胚胎生物体的组织中 的细胞。例如，多能祖细胞可以从骨髓、脐带血、外周血、乳房、肝脏、皮肤、胃肠道、胎盘和子 宫获得。多能祖细胞可以包括能够分化为神经元细胞的神经元干细胞、能够分化为血细胞 的造血干细胞、能够分化为骨骼、软骨、脂肪和肌肉的间充质干细胞、以及能够分化为肝细 胞的肝干细胞。
[0081] 本文中，术语"分化的细胞"指的是注定成为特定细胞类型且通常不能够分化为其 他细胞类型的细胞。例如，分化的细胞的实例包括内皮细胞、平滑肌细胞、横纹肌、皮肤和间 质成纤维细胞、神经元细胞（例如，星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞）、心肌细胞、肝 细胞和胰腺细胞。
[0082] 本文中，"未分化的细胞"是还没有变为特定细胞类型的干细胞。
[0083] 本文中，提及"分化后的干细胞"意指根据本发明即使用本文描述的干细胞培养基 已经分化的干细胞，并且除非另外声明不意图包括已经通过任何其他方法分化的干细胞。
[0084] 本文中，分化的细胞和多能祖细胞包括来源于任何动物不论是人、猴、猪、马、牛、 绵羊、狗、猫、小鼠或大鼠的那些，优选地来源于人的那些。
[0085] 本文中，术语"水性媒介物"指的是合成的热响应的共聚物分散遍布其中以形成本 发明的培养基的培养基。水性媒介物必要地包括延长储存于其中的干细胞的活力的营养 物。如此，水性媒介物可以简单地允许干细胞存活。但是，水性媒介物可以是或可以包含促 进干细胞生长（即复制）和存活的培养基。此外，水性媒介物可以是、可以包含或可在其中 加入其他分化剂的生长因子，以促进干细胞的原位（in situ)分化。
[0086] 本文中，术语"培养基"，特别是"标准培养基"指的是使哺乳动物细胞能够体外 生长和存活的培养基。用于本发明的培养基可包括本领域中通常使用的所有有关的培养 基。培养基可以是细胞培养最低培养基（CCMM)，其通常包含碳源、氮源和微量元素 。CCMM 的实例包括，但不限于DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基）、MEM(最低必需培养基）、 BME (Eagle 基本培养基）、RPMI1640、F-10、F-12、α ΜΕΜ(α 最低必需培养基）、GMEM(Glasgow 最低必需培养基）、和IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基）。用于本发明的培养基还可 以包含许多不同添加剂的一种或更多种，如本领域中已知的，例如抗生素诸如青霉素、链霉 素、庆大霉素或其组合、氨基酸、维生素、胎牛血清或其替代物。
[0087] 本文中，关于细胞的术语"培养的（caltured) "意指在受控制的环境条件下，通常 维持在37°C并且含有用于哺乳动物细胞的约21 %的氧和约5-10%的0)2的环境中，在定义 的培养基存在下生长的细胞群体。相似地，术语"培养（culturing)"指的是通过在受控制 的环境条件下，通常维持在设定的温度并提供定义的氧和C0 2的浓度以及任选地其它参数 诸如湿度的培养箱中，并且以设定的速率以受控制的方式搅动使感兴趣的一种细胞或多种 细胞生长，来产生细胞的扩大的群体的过程。
[0088] 本文中，术语"有活力的"，当关于细胞使用时，指活细胞。
[0089] 本文中，术语"细胞活力"指的是在给定的样品中活细胞的比例，其可以通过本领 域中熟知的方法来评价。
[0090] 本文中，术语诸如"保存的活力"、"持续的活力"、"延长的活力"、"持续的储存寿 命"、"延长的维持"和"延长的存活"可交换地使用，并且指的是与未被本发明的处理方法 (例如，储存/保存的方法）之一处理的细胞群体或其样品相比，在经受如此处理的细胞群 体中存活的活细胞的较大比例。
[0091] 本文中，术语"室温"指的是在20°C至26°C范围内的温度。
[0092] 本文中，术语"环境温度"指的是在约18°C至约32°C范围内的温度。
[0093] 在低于其或高于其干细胞培养基变成或开始变成凝胶状的温度在本文中被称作 "胶凝温度（gelling tempreture)"。本文中，调整温度"跨过"胶凝温度意指降低温度低于 胶凝温度（在其中当从某点降低温度之后培养基变成凝胶状的实施方案中）或升高温度高 于胶凝温度（在其中当从某点升高温度之后培养基变成凝胶状的实施方案中）。
[0094] 本文中，术语"凝胶状"被用来描述物质（例如干细胞培养基）的凝胶（即胶状的） 形式。尽管凝胶可以是硬的或软的，但是通常本发明的培养基的凝胶形式是软的。此类凝 胶是非流体的并且通常以其稳定的状态不会流动。
[0095] 本文中，术语"非凝胶状"被用来描述物质诸如干细胞培养基的（大体上）的流体 形式。此类流体形式通常表现出可流动的特性。
[0096] 一般描述
[0097] 本发明本质上提供了用于干细胞的培养基（即干细胞培养基），所述培养基能够 经受可逆凝胶化。因此，该培养基可以通过简单地调整温度跨过培养基的凝胶化温度在非 凝胶状（流体）形式和凝胶状形式之间容易地"转换"。如此，干细胞可以通过以下被容易 地捕获在3D凝胶基质中：将干细胞与非凝胶状/流体形式的培养基简单地混合、并且然后 通过调整温度跨过培养基的胶凝温度来使培养基胶凝。被包封在凝胶状形式的培养基内的 干细胞然后可在直接使用培养基内的干细胞之前（例如，在治疗中或在培养、分化等中）、 或在所述干细胞从培养基提取之后的使用之前被保存很长时间段。
[0098] 另外，胶凝的培养基可以被用作用于干细胞的3D培养和/或分化的培养基。培养 基内的营养物可以被改变以促进干细胞的培养。另外的营养物、生长因子或孵育条件可以 被用来促进干细胞分化。如此，本发明的培养基用途极其广泛。
[0099] 由于本发明的培养基可以适用于在环境温度或室温下干细胞的相对长期储存，提 供了更便利、有成本效益且节能的干细胞储存系统。特别是，本发明的培养基可以缓解对用 于干细胞的长期储存和/或运输的昂贵的冷却系统的需求。
[0100] 用以产生本发明的培养基的材料是相对便宜的并且可以使用稳健的且可扩展的 合成化学技术来容易地产生。
[0101] 考虑到本发明的培养基是完全合成的，待储存的干细胞不存在生物污染或干扰的 风险（不同于当动物来源的产品被用来形成此类培养基时）。此外，本发明的培养基的合成 性质有助于更好的批次间再现性并且从而降低不期望的变化性，所述不期望的变化性通常 与生物来源的产品诸如动物蛋白质的使用相关。本发明共聚物的合成性质还允许培养基的 合理调整以优化特性，如需要的。
[0102] 本发明的培养基与干细胞生物相容并且对其无毒。凝胶状形式的培养基的相对柔 软性和渗透性使营养物能够容易地扩散遍及培养基以确保其中包含的干细胞被合适地滋 养并且从而被保存。
[0103] 本发明的培养基易于灭菌，因为其非凝胶状形式可以通过过滤容易地灭菌（热响 应共聚物的颗粒的小的尺寸和呈该形式的培养基的流体性质）。
[0104] 在优选的实施方案中，本发明的培养基还是透明的，其使干细胞能够例如使用光 学显微镜在培养基自身中被研究。当培养基另外被用于培养被研究的干细胞和/或使其分 化时，这是特别地有用的。
[0105] 培养基的可转换形式使干细胞能够在容器之间灵巧地转移，并且还可以有助于干 细胞的准确的体积测量和分配。
[0106] 本发明的培养基的可逆凝胶化使能够灵巧操作储存于其中的干细胞，因为其可以 在被释放入非凝胶状流体形式之前在凝胶状形式的培养基内储存一段时间以使干细胞在 被重新捕获到凝胶状形式的培养基内之前能够接收另外的营养物。
[0107] 本发明的培养基还是生物相容的，所以培养基自身可以用作用于干细胞的治疗性 施用的药物载体（carrier)或媒介物（vehicle)，无论是作为植入物的部分、贴剂或干细胞 的其他合适的施用形式。此外，培养基可以被调整使得胶凝温度对于设想的任何一种治疗 用途是合适的。
[0108] 本发明的培养基的许多其他优势将从以下的描述是明显的。
[0109] 培养基
[0110] 本发明提供了用于干细胞的培养基，所述培养基包含分散在水性媒介物中的合成 的热响应共聚物的颗粒；
[0111] 其中培养基能够响应温度变化经受非凝胶状形式和凝胶状形式之间的变化，并且 在非凝胶状形式中，培养基包含合成的热响应共聚物的颗粒的胶状稳定的水性分散体，并 且在凝胶状形式中，培养基提供能够容纳干细胞的支架或基质；
[0112] 并且其中水性媒介物还包括用于维持干细胞的活力的营养物。
[0113] 合适地，培养基是干细胞培养基。
[0114] 由于合成的热响应共聚物的颗粒的存在，培养基合适地是热响应的。
[0115] 培养基合适地能够响应温度变化经受非凝胶状形式和凝胶状形式之间的可逆变 化。这意味着可逆凝胶化的至少一个循环可以被实施，即凝胶化和随后的去凝胶化（即流 体化）的至少一个循环可（通过合适的温度变化）被选择性地引起。在特定的实施方案中， 培养基能够经过多于一个循环可逆凝胶化，并且合适地可逆凝胶化经过多个凝胶化和去凝 胶化的循环被保持。此类可逆凝胶化允许干细胞重复地被捕获/包封入本发明的胶凝的干 细胞组合物中并且然后从其释放。
[0116] 培养基的非凝胶状形式和凝胶状形式之间的转变（并且反之亦然），合适地通过 培养基的相变或状态改变来表征。相变合适地是由于热响应共聚物的颗粒的形态的温度依 赖性改变。在宏观尺度上，培养基的相变通过培养基的粘度的改变来表征。培养基的非凝 胶状形式是相对地自由流动的流体并且因此具有相对低的粘度，而凝胶状形式是基本上无 需支撑的（free-standing)凝胶，其不能自由流动并且因此具有相对高的粘度。
[0117] 培养基的凝胶状形式合适地是相对软的凝胶。
[0118] 在优选的实施方案中，培养基在低于胶凝温度的温度下以非凝胶状形式存在并且 在高于培养基的胶凝温度的温度下以凝胶状形式存在。
[0119] 在优选的实施方案中，培养基在环境温度和/或在室温下是凝胶状形式。合适地， 在大于或等于15°C、合适地大于或等于20°C、合适地大于或等于30°C的温度下是凝胶状 形式。合适地，培养基在35°C和40°C之间的温度下是凝胶状形式。合适地，培养基在直至 45°C、合适地直至60°C的温度下保持凝胶状形式。
[0120] 在优选的实施方案中，培养基在小于或等于10°C、合适地小于或等于5°C的温度 下是非凝胶状形式。合适地，培养基在低至〇°C、合适地低至-5°C的温度下保持非凝胶状形 式。
[0121] 合适地，干细胞培养基的"胶凝温度"在5°C和30°C之间、合适地在10°C和25°C之 间、合适地在15°C和20°C之间。培养基的胶凝温度和特性可以通过调整某种关键参数诸如 热响应共聚物或其部分的聚合度、热响应共聚物的亲水性/疏水性平衡、存在于热响应共 聚物中的特定单体等来改变。如此，本发明提供了调整用于关注的特定应用的培养基的胶 凝温度的方法。
[0122] 培养基合适地是生物相容的。特别地，培养基自身合适地是对细胞无毒的，特别是 对干细胞无毒的。合适地，在其中存在合适的营养物的培养基中储存干细胞将保存所述干 细胞的活力。
[0123] 培养基合适地是与哺乳动物细胞特别是人细胞生物相容的（例如，当并入用于治 疗应用的组合物诸如药物组合物中时），并且合适地以治疗有效量对哺乳动物物种和/或 细胞是无毒的。这允许培养基用作用于施用干细胞治疗（或来源于干细胞的分化的细胞的 治疗）的媒介物或药物载体。
[0124] 培养基合适地以凝胶状形式是透明的，或至少足够透明以允许用裸眼和/或通过 合适的放大倍数（例如使用光学或共聚焦显微镜）观察凝胶状培养基内捕获的任何细胞。 培养基合适地以非凝胶状形式是透明的，或至少足够透明以允许分散于其中的任何细胞通 过裸眼和/或通过合适的放大倍数（例如使用光学或共聚焦显微镜）是可视的。这样的透 明度允许原位分析培养基内的细胞。
[0125] 培养基（任何干细胞/分化后的细胞除外）合适地不含动物来源的产品。合适地， 本发明的培养基无任何热响应蛋白质、肽或从生物（例如动物）来源获得的其他生物聚合 物。例如，热响应共聚物合适地是完全合成的。培养基内使用的热响应共聚物的合成性质 允许最小化批次间变化（与使用生物体来源的热响应共聚物的培养基截然不同）并且从而 改进本发明的干细胞培养基的可靠性。
[0126] 在凝胶形式中，培养基提供了特别地适于储存、保存、培养和/分化干细胞的3D支 架或基质。合适地，支架有效地模拟体内（in vivo)发现的三维（3D)细胞外基质（ECM)。
[0127] 本发明的培养基被合适地配置以允许在凝胶状形式的培养基中选择性捕获或包 封干细胞。然后，干细胞随后可以被释放并且通过将培养基转换回非凝胶状形式来分离。例 如，干细胞可通过以下被合适地包封在凝胶状培养基内：首先将所述干细胞与非凝胶状形 式的培养基混合并且然后通过调整温度跨过胶凝温度使得培养基改变为其凝胶状形式，从 而将干细胞包封在凝胶状形式的培养基内。这提供了胶凝的干细胞组合物。然后干细胞可 在胶凝的干细胞组合物内被储存、保存、培养和/或分化。干细胞可通过以下从胶凝的干细 胞组合物/基质合适地释放：再次通过调整温度跨过胶凝温度，使得培养基改变为其非凝 胶状形式。任选地，然后干细胞可以通过重复整个过程而被捕获在凝胶状培养基内。
[0128] 当干细胞从凝胶状形式的培养基被释放时（例如通过使得干细胞培养基改变为 其非凝胶状形式），其可通过本领域中熟知的方法（诸如超滤法和/或离心）合适地从非凝 胶状形式的培养基提取。
[0129] 已经发现的是，以上概述的过程不会影响干细胞的活力。因此，本发明的培养基是 用于储存/保存、培养和/或分化干细胞的有用的工具，并且为使用干细胞的研究者、制造 者、治疗专家和临床医生提供了明显的益处。
[0130] 本发明的培养基合适地包含1%和30% w/w之间的合成的热响应共聚物，合适地 2%和20% w/w之间的合成的热响应共聚物，合适地3%和12% w/w之间的合成的热响应共 聚物。在特定的实施方案中，本发明的培养基包含3%和7% w/w之间的合成的热响应共聚 物。在特定的实施方案中，本发明的培养基包含8%和12% w/w之间的合成的热响应共聚 物。在特定的实施方案中，本发明的培养基包含5%和12% w/w之间的合成的热响应共聚 物。
[0131] 本发明的培养基包含用于维持干细胞的活力的营养物。可以将此类营养物直接添 加至合成的热响应共聚物或其分散体以便稀释合成的热响应共聚物。可选地，可通过透析 将此类营养物引入合成的热响应共聚物的分散体。可选地，可通过透析方法和直接添加的 组合将此类营养物引入培养基。
[0132] 合适地，干细胞培养基（基本上）不含表面活性剂，合适地包含小于或等于lwt% 表面活性剂、合适地小于或等于0. 5wt%表面活性剂、合适地小于或等于0. lwt%表面活性 剂、合适地包含零表面活性剂。
[0133] 合适地，干细胞培养基（基本上）不含十二烷基磺酸钠（即有时在RAFT聚合反应 中使用的一种类型的表面活性剂），合适地包含小于或等于lwt%十二烷基磺酸钠、合适地 小于或等于〇. 5wt %十二烷基磺酸钠、合适地小于或等于0. lwt %十二烷基磺酸钠、合适地 包含零十二烷基磺酸钠。
[0134] 合成的热响应共聚物的颗粒
[0135] 合成的热响应共聚物合适地是合成的，即，其通过合成化学技术形成而不是生物 来源的。
[0136] 热响应共聚物合适地是生物相容的，并且合适地对干细胞是无毒的。合适地，热响 应共聚物（基本上）不含表面活性剂。合适地，热响应共聚物（基本上）不含十二烷基磺 酸钠。
[0137] 热响应共聚物合适地在水性媒介物中形成胶束颗粒。这些颗粒合适地经受形态 方面的温度依赖的改变并且该形态方面的改变被理解为使得培养基从非胶凝的状态改 变成胶凝的状态。合适地，形成核心的链（即P 2)是热响应的，其合适地是（基本上）水 (aqueous)/水（water)不溶性的或合适地否则是疏水性的（至少相对于稳定剂链（即 PJ)。合适地，稳定剂链（即PJ相比形成核心的链（即P2)是较不热响应的并且最合适地 稳定剂链（基本上）是非热响应的，其合适地是（基本上）水溶性的/可溶于水的或合适 地否则是亲水性的（至少相对于形成核心的链（即P 2))。因此，合适地，形成核心的链是共 聚物的热响应行为的原因。这合适地通过经由以下形成热响应共聚物的颗粒来实现：以包 括式A的部分（参见以下-这涉及Pi部分）的预形成的水溶性聚合物开始，并且在（基本 上）水溶性的/可溶于水的单体％的存在下（因为这促进最佳颗粒的形成）通过经由RAFT 聚合的链延伸在所述聚合物基础上构建另外的（基本上）水不溶性的/不可溶于水的嵌段 (P2)。合理地改变各共聚单体和聚合物的相对溶解度可以有助于形成这种性质的热响应共 聚物。对于本领域技术人员而言辨别个体聚合物嵌段是否是水溶性的/可溶于水的和/或 热响应的是简单的。
[0138] 颗粒经受形态改变的温度对应于培养基的胶凝温度。因此，在一些实施方案中，形 态改变发生在15°C和30°C之间、合适地10°C和30°C之间、合适地6°C和36°C之间。
[0139] 在培养基的"非凝胶状形式"中，热响应共聚物的颗粒是聚合物颗粒的胶状稳定的 分散体。合适地，颗粒是大小小于500nm、并且更合适地小于100nm的纳米颗粒。合适地，颗 粒基本上是球形（例如球体或类球体颗粒），合适地为胶束的形式。该非凝胶状形式天然地 比对应的干细胞培养基的凝胶状形式更具流动性且粘性较小。培养基的非凝胶状形式是自 由流动的并且适于将干细胞混合在其中。
[0140] 在培养基的"凝胶状形式"中，热响应共聚物的颗粒合适地是具有与非凝胶状形式 中存在的颗粒不同形态的胶状稳定的聚合物颗粒。合适地，在培养基的"凝胶状形式"中， 热响应共聚物的颗粒合适地是各向异性的"懦虫（worm) "或"懦虫状（worm like) "颗粒。 这些细长的颗粒彼此相互作用以形成培养基的凝胶状形式。不希望被任何特定的理论所束 缚，认为这些"蠕虫状"颗粒彼此相互作用并且该相互作用被认为引起培养基的"凝胶状形 式"。干细胞培养基的凝胶状形式虽然不能自由流动但合适地是相对软的，其促进营养物的 分散并且有助于容纳活的干细胞并且从而延长其活力。弹性模数（G'）通常是20-1000Pa、 合适地10-200Pa。
[0141] 此类颗粒的形状可以使用本领域中已知的合适的电子显微镜技术（例如SEM、 TEM)来适当地验证。
[0142] 热响应共聚物合适地具有1，000g/mol和100, 000g/mol之间、合适地5, 000g/mol 和 80, 000g/mol 之间、更合适地 7, 000g/mol 和 70, 000g/mol 之间、最合适地 10, 000g/mol 和60, 000g/mol之间的数均摩尔质量（Mn)。
[0143] 热响应共聚物合适地具有数均摩尔质量（Mn)和重均摩尔质量（Mw)使得1/^在 1. 05和1. 50之间。
[0144] 无论在干细胞培养基的凝胶状形式或非凝胶状形式中，热响应共聚物的颗粒的性 质取决于存在的温度（即其决定共聚物形态）和共聚物自身的性质（即在所研究的温度下 其是否形成"球形"颗粒或"蠕虫状"颗粒）。
[0145] 热响应共聚物合适地是两性共聚物（即包括亲水性和疏水性特性两者）。在许 多实施方案中，热响应共聚物包含至少一种亲水性聚合物嵌段和至少一种疏水性聚合物嵌 段。
[0146] 合适地，热响应共聚物包含热响应聚合物嵌段。在特定的实施方案中，热响应共聚 物包含热响应聚合物嵌段和非热响应嵌段，其中非热响应聚合物嵌段合适地在〇°C和45°C 之间的温度范围中（基本上）是非热响应的。在特定的实施方案中，热响应共聚物包含热 响应的第一聚合物嵌段和相比第一聚合物嵌段是较不热响应的第二聚合物嵌段。
[0147] 在某些实施方案中，热响应共聚物可由式B来定义：
[0148]
[0149] 其中Pi表示源自单体M i的聚合物组分并且P 2表示源自水溶性单体Μ 2的基本上水 不溶性的聚合物组分。
[0150] 在一定程度上，Pi JpPjP Μ2可以由W0 2011/110841 Α2(谢菲尔德大学，2011年 3月8日提交）中给予其的含义的任一种来定义，这提供了根据本发明的热响应共聚物（即 适当地排除了非热响应共聚物）。同样地，在一定程度上，由式Β定义的热响应共聚物可以 通过W0 2011/110841 Α2(谢菲尔德大学，2011年3月8日提交）中定义的方法的任一种 来制备，这提供了根据本发明的热响应共聚物（即适当地排除了非热响应共聚物）。如此， TO 2011/110841 Α2通过引用被并入本文。期望的热响应特性可以通过根据本发明将共聚 物分散在水或甚至水性媒介物内并且检查经过"非凝胶状"和"凝胶状"形式之间转换或反 之亦然的温度范围获得的分散体来适当地验证。
[0151] 合适地，？1是至少部分水分溶性的/可溶于水的。合适地，P 1是（基本上上）水 溶性的/可溶于水的。合适地，Pi是比P 2更具水溶性/更加溶于水。
[0152]
[0153] 合适地，每一个单体吣选自式M1A、M1B和/或M 1C的单体：
[0154]
[0155] 其中R1、Rw和R 11表示允许P i是至少部分水溶性的M 1AS M i。的取代基，
[0156] R2代表 H、CH 3或 CN，
[0157] Rs代表有效允许Pi是至少部分水溶性的芳环的一个或更多个取代基，并且
[0158] 每一个单体M2选自式Μ 2A和/或Μ 2B的单体：
[0159]
[0160] 其中R3是允许P 2是基本上水不溶性的Μ 2的取代基，并且R4和R6独立地表示Η或 甲基；
[0161] 或Pi是包括单体M i和单体Μ 2的共聚物，条件是聚合物P i保持水溶性。
[0162] 在本发明的实施方案中，？1是共聚物，其包括以上定义的式M1A、M 1B和M1C的两个或 更多个单体吣。
[0163] 在可选的实施方案中，？1是包括选自以上定义的Μ 1A、M1B和M 1C的单体的单一单体 Mi的均聚物。
[0164] 在一个实施方案中，包括式Μ 1A或Μ 1B的单体的均聚物或共聚物。
[0165] 在一个实施方案中，？1是包括式Μ 1A的单体的均聚物或共聚物。
[0166] 在一个实施方案中，Pi是包括单体I和单体Μ 2A的共聚物，条件是聚合物Pi保持 水溶性。
[0167] 在本发明的另外的实施方案中，匕是共聚物，其中单体M2选自以上定义的式M 2A和 M2B的两个或更多个单体。
[0168] 在可选的实施方案中，P2是包括选自式Μ 2A和Μ 2B的单体的单一单体Μ 2的均聚物。
[0169] 合适地，Ρ2是包括选自式Μ2Α的单体的单体Μ2的聚合物或共聚物。因此，在特定的 实施方案中，？ 2是包括式Μ 2Α的单体的聚合物或共聚物。
[0170] 在某些实施方案中，无论Ρ2是共聚物或均聚物，？2可以另外地包括交联的单体单 元（诸如，例如EGDMA)。在其他实施方案中，？ 2不包括任何交联的单体单元。
[0171] 在本发明的优选的实施方案中，PJP Ρ2两者均是如以上定义的均聚物。
[0172] 在一个实施方案中，热响应共聚物由式Β来定义，并且Pig身是包含单甲基丙烯 酸甘油酯（GMA)单体单元的聚合物或共聚物，并且匕自身是包含甲基丙烯酸2-羟基丙酯 (HPMA)单体单元的聚合物或共聚物。PJP/SP2可以是均聚体，例如分别是聚（单甲基丙 烯酸甘油酯）（PGMA)和聚（甲基丙烯酸2-羟基丙酯）（PHPMA)。可选地P 2或P JP P 2 二者可以是共聚物或基本上是掺杂其他单体单元的均聚物。例如，鉴于？:可以是均聚物聚 (单甲基丙烯酸甘油酯）（PGMA)嵌段，P2可以是包括GMA和HPMA单体单元两者的共聚物嵌 段或P 2可以是包括甲基丙烯酸二甘醇酯（DEGMA)和HPMA单体单元两者的共聚物嵌段。
[0173] 在特定的实施方案中，热响应共聚物是选自包括以下的组的式BtPfPj的嵌段共 聚物：
[0174] 1. PGMA-PHPMA。PGMA嵌段可以合适地具有在10和200之间、合适地在25和100 之间、合适地在30和80之间的聚合度（DP)。PHPMA嵌段可以合适地具有在50和300之间、 合适地在60和280之间、合适地在70和250之间的聚合度（DP)。
[0175] 2. PGMA-P(GMA-HPMA)。PGMA嵌段可以合适地具有10至120的聚合度（DP)。 P(GMA-HPMA)嵌段可以合适地具有在20和200之间、合适地在50和150之间、合适地在70 和120之间的聚合度（DP)。在P(GMA-HPMA)嵌段内的GMA与HPMA单体单元的比合适地在 10:1和1:10之间、合适地在1:1和1:5之间、合适地在1:2和1:3之间。
[0176] 3. PGMA-P(DEGMA-HPMA)。PGMA嵌段可以合适地具有在10和200之间、合适地在 30和100之间、合适地在40和60之间的聚合度（DP)。P(DEGMA-HPMA)嵌段可以合适地具 有在20和200之间、合适地在50和150之间、合适地在70和120之间的聚合度（DP)。在 P (DEGMA-HPMA)嵌段内的DEGMA与HPMA单体单元的比合适地在10:1和1:10之间、合适地 在1:1和1:5之间、合适地在1:2和1:3之间。
[0177] 热响应共聚物的颗粒在其包括在本发明的干细胞培养基内之前使用合适的合成 过程合适地预形成。但是，在某些实施方案中，热响应共聚物的颗粒可以在水性培养基内原 位形成，该水性培养基是或（在加入合适的营养物之后）成为干细胞培养基的水性媒介物。 尽管从处理的角度来说，在产生干细胞培养基之前以其"非凝胶状"形式（即胶状分散的流 体样形式）初始地形成颗粒或至少将其转化成其"非凝胶状"形式是更加便利的，颗粒可以 以其"凝胶状"或"非凝胶状"形式（例如，作为分别地为蠕虫或球形）被初始形成。
[0178] 在优选的实施方案中，热响应共聚物的颗粒被预形成并且然后在其用于干细胞培 养基之前被超滤。最合适地，在所述颗粒以其"非凝胶状"形式的同时将所述颗粒超滤（即 超滤作为胶状稳定的聚合物颗粒的水性分散体，优选地基本上是"球形"颗粒）。合适地，这 样的超滤在低温下执行，合适地其中当其被超滤时，胶状稳定的共聚物颗粒的预过滤的水 性分散体是在10°c或低于10°C、更合适地在5°C或低于5°C的温度下。颗粒在其包括在干 细胞培养基内之前以这种方式合适地超滤以将颗粒灭菌。但是，这样的超滤也可以便利地 移除颗粒的形成中涉及的试剂和副产物。然后将颗粒合适地分散在水性媒介物中或水性培 养基中，其随后被调整以形成本发明的水性媒介物。
[0179] 在本发明的特定实施方案中，热响应共聚物的颗粒通过受控的合成聚合方法、最 优选地通过聚合诱导的自组装法（即从而颗粒在水性聚合反应介质中原位形成）来预形 成。在特定的实施方案中，热响应共聚物的颗粒使用在水性分散体聚合条件下执行的可逆 加成-断裂链转移（RAFT)类型聚合过程来制备。在特别优选的实施方案中，在一定程度上， 热响应共聚物的颗粒通过W0 2011/110841 A2(谢菲尔德大学，2011年3月8日提交）中定 义的方法的任一种来制备，这提供了根据本发明的热响应共聚物（即合适地排除非热响应 共聚物）。此类技术对于以受控制的和可再生的方式制备双嵌段共聚物的胶体颗粒是理想 的。如此，W0 2011/110841 A2通过引用被并入本文。期望的热响应特性可以通过根据本 发明将共聚物分散在水或甚至水性媒介物内并且检查在经过"非凝胶状"和"凝胶状"形式 之间的转换或反之亦然的温度范围内获得的分散体来合适地验证。
[0180] 在特定的实施方案中，热响应共聚物的颗粒通过在水基培养基中形成如以上定义 的式B的嵌段共聚物来形成，所述式B的嵌段共聚物通过以下形成：将以下（a)与（b)混 合，并且启动在水性分散体聚合条件下执行的可逆加成-断裂链转移（RAFT)聚合以提供式 B的嵌段共聚物：
[0181] (a)包括式A的部分的水溶性聚合物
[0182]
[0183] 其中X表示Pi的末端基团，至少一些基团X是链转移剂（CTA)末端基团，
[0184] (b)如以上定义的单体M2。
[0185] 合适地，形成式B的嵌段共聚物的可逆加成-断裂链转移（RAFT)聚合（基本上） 在不存在表面活性剂的情况下被执行。合适地，形成式B的嵌段共聚物的可逆加成-断裂 链转移（RAFT)聚合（基本上）在不存在十二烷基磺酸钠的情况下被执行。合适地，形成式 B的嵌段共聚物的可逆加成-断裂链转移（RAFT)聚合被执行，使得如果任何表面活性剂存 在，总表面活性剂与包括式A的部分的水溶性聚合物的重量比是1:25或更小（即更少的表 面活性剂）、合适地1:100或更小、合适地1:200或更小。合适地，形成式B的嵌段共聚物的 可逆加成-断裂链转移（RAFT)聚合被执行，使得如果任何表面活性剂存在，总表面活性剂 与单体M 2的重量比是1:25或更小（即更少的表面活性剂）、合适地1:100或更小、合适地 1:200或更小、合适地1:1000或更小。
[0186] 在特定的实施方案中，热响应共聚物由式B来定义：
[0187]
[0188] 其中，Pi表示来源于单体M i (其也合适地是基本上水溶性的/可溶于水的）的基 本上水溶性的（或可溶于水的）聚合物组分并且匕表示来源于水溶性（或可溶于水的）单 体％的基本上水不溶性的（或不可溶于水的）聚合物组分；
[0189] 其中：
[0190] i)形成核心的链（即P2)是热响应的并且稳定剂链（即PJ是非热响应的；或者
[0191] ii)稳定剂链（即PJ比形成核心的链（即P2)较不热响应并且最合适地稳定剂 链是（基本上）非热响应的。
[0192] 如前述的，在一定程度上，？1為、？2和12可以通过冊2011/110841八2(谢菲尔德 大学，2011年3月8日提交）中给予其的含义的任一种来定义，这提供了根据本发明的热响 应共聚物（即合适地排除了非热响应共聚物）。
[0193] 水件媒介物
[0194] 水性媒介物包含水和用于干细胞的合适的营养物。水性媒介物合适地包含 80-9 5wt %的水。营养物可以是本领域中已知的任何合适的细胞培养营养物。
[0195] 水性媒介物合适地包含缓冲盐水，诸如磷酸盐缓冲盐水。
[0196] 在一个实施方案中，水性媒介物可以是或可以包括本领域中已知的水性培养基。
[0197] 水性媒介物合适地包含干细胞培养基、合适地人干细胞培养基、最合适地人胚胎 干细胞培养基（例如来自Invitrogen的K0-DMEM培养基）作为营养物。此类干细胞培养 基自身合适地被提供作为相关营养物的水性溶液或分散体。合适地，水性媒介物包含至少 20% w/w的干细胞培养基、合适地至少40% w/w的干细胞培养基。合适地，水性媒介物包含 至多97% w/w的干细胞培养基、合适地至多95% w/w的干细胞培养基、合适地至多80% w/ w的干细胞培养基、合适地至多60% w/w的干细胞培养基。
[0198] 培养基还可以包含促进干细胞分化为期望的细胞类型的生长因子或其他营养物。
[0199] 干细朐
[0200] 任何干细胞都可以被用于本发明的培养基。
[0201 ] 在某些实施方案中，用于与本发明的方法和培养基一起使用的干细胞是哺乳动物 干细胞，最合适地人干细胞。在特定的实施方案中，干细胞是胚胎干细胞（例如人胚胎干细 胞）。然而，此类胚胎干细胞合适地是干细胞而不是通过涉及破坏人胚胎和/或人胚胎干细 胞的方法产生或获得的那些。在可选的实施方案中，干细胞是非胚胎（例如成体）干细胞。
[0202] 合适地，干细胞基本上是未分化的。合适地，干细胞是多能性干细胞。
[0203] 胚胎干细胞合适地从囊胚的内细胞团分离。
[0204] 非胚胎干细胞可以从多种组织获得和分离，所述组织包括：
[0205] -骨髓，其需要通过钻入骨骼（例如股骨或髂骨）中提取；
[0206] -脂肪组织（脂质细胞），其需要通过抽脂术提取；
[0207] -血液，其需要通过单采术提取，其中血液从供体提取，通过提取干细胞的机器并 且将血液的其他部分返回至供体；
[0208] -刚出生后的脐带血。
[0209] 根据本发明使用的干细胞合适地是全能性干细胞或多能性干细胞、最合适地多能 性干细胞。此类多能性干细胞合适地可以分化为来自三个胚层即内胚层（内部胃黏膜、胃 肠道、肺）、中胚层（肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器）或外胚层（表皮组织和神经系统）的任 何一个的细胞类型。可选地，干细胞可以是多能干细胞。
[0210] 本发明的干细胞培养基合适地被配置以将一种或更多种干细胞捕获/包封在凝 胶基质内，同时干细胞培养基是凝胶状形式。此类干细胞合适地与相关营养物一起被包封 在3D支架内，所述相关营养物允许干细胞在凝胶中存活并且甚至生长。
[0211] 合适的分离的细胞制品可以是富含多能祖细胞的制品，所述多能祖细胞通常从诸 如骨髓、外周全血、白细胞单采术产物或单采术产物、脐带血和从组织或器官制备的细胞悬 浮液的来源获得的。
[0212] 多能祖细胞可以使用本领域中已知的细胞培养、增殖和分离的方法，例如使用如 由本发明的发明人在美国专利号6, 737, 074和6, 503, 731中公开的纤维蛋白微珠来分离。 可选的方法除了其他的以外包括在美国专利号7, 592, 174、5, 908, 782、5, 486, 359和美国 专利申请公布号2010/006819U2009/0124007和2010/0297233中公开的那些。
[0213] 用于细胞富集和/或分离的典型方法包括密度梯度法（例如，Ficoll (R)、胶状二 氧化硅）、淘洗法、离心、通过低渗休克裂解红细胞和此类方法的多种组合。例如，从骨髓纯 化干细胞需要移除红细胞和粒细胞，其通常通过Ficoll (R)密度梯度离心、随后为通过传 统离心的重复洗涤步骤来完成。
[0214] 用于细胞富集和/或分离的方法还可以包括本领域中已知的用于细胞分离的在 多种类型的过滤器上的过滤。例如，正切流动过滤（还称为错流过滤）可以被用于从骨髓 或血液成分的非均匀混合物富集干细胞，如在美国专利号7, 790, 039中公开的。
[0215] 从混合物分离多能细胞还可以并入吸附至合适的基底诸如塑料培养容器的步骤。
[0216] 用于本发明的分离的多能祖细胞包括称为"间充质干细胞"（本文还称为"MSC"） 的那些，诸如从骨髓基质和脐带血获得的那些，其具有在体外分化为不同细胞类型特别是 软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和肌细胞的能力。体外研究已经证实了 MSC分化为肌细胞、 神经元样前体、心肌细胞和可能的其他细胞类型的能力。另外，MSC已经被公开提供用于造 血干细胞扩增的有效饲养层。
[0217] 在特定的实施方案中，干细胞是多能性干细胞、特别地多能性人胚胎干细胞。干细 胞合适地在转移至本发明的培养基之前被机械地收获（例如通过移液管）。合适地，干细胞 聚集物被添加至干细胞培养基。合适地，干细胞（或干细胞聚集物）与培养基的体积比在 1:1000和1:5之间、更合适地在1:100和1:10之间、最合适地在1:50和1:20之间。例如， 将约20 μ L的干细胞聚集物（通常每一个聚集物大小为20-200 μ m)添加至约600 μ L的培 养基。
[0218] 将干细朐容纳在培养基内
[0219] 当为凝胶状形式时，培养基能够容纳活的干细胞。此外，培养基中的干细胞维持其 活力经过延长的时间段并且没有任何表型改变（除非存在促进分化的剂或条件）。
[0220] 合适地，凝胶状培养基能够维持干细胞的活力至少7天、合适地至少14天、更合适 地至少21天、更合适地至少28天、最合适地至少56天。假设没有分化剂（例如生长因子） 被添加至培养基，容纳的干细胞被维持在未分化的形式，并且保持有活力的。此类容纳的干 细胞合适地可以在从培养基提取之后自我更新/复制。
[0221] 合适地，凝胶状形式的干细胞培养基能够取决于干细胞是否被储存、培养和/或 分化而在环境温度和/或最佳培养温度（即30-42Γ )和/或分化温度下容纳活的干细胞。 合适地，凝胶状形式的干细胞培养基能够在15°C和42°C之间的温度下容纳活的干细胞。此 类干细胞可以以休眠状态或停滞态（即其中基本上没有分化和/或增殖发生）被储存。
[0222] 制备干细朐培养基的方法
[0223] 本发明提供了制备根据本发明第一方面的培养基的方法，所述方法包括将所述合 成的生物相容的热响应共聚物的颗粒分散在水性媒介物中，所述水性媒介物还包含用于维 持干细胞的活力的营养物。
[0224] 可分别制备/提供热响应共聚物的颗粒和水性媒介物并且然后混合在一起。然 后，合成的热响应共聚物的颗粒合适地在所得培养基藉以以其非凝胶状形式存在的温度下 分散在水性媒介物中。
[0225] 热响应共聚物的颗粒可以通过本文描述的方法中的任何一种被提供，特别是通过 在TO 2011/110841 A2(谢菲尔德大学，2011年3月8日提交）中公开的方法被提供。如 此，所述颗粒合适地通过受控的自由基聚合诸如RAFT聚合被原位形成。合适地，此类颗粒 通过以下形成：
[0226] ⑴提供溶解在聚合介质/溶剂（例如水）中的预形成的聚合物嵌段（比如，PGMA 的嵌段）；以及
[0227] (ii)从所述预形成的聚合物嵌段生长第二聚合物嵌段（例如通过使用合适的单 体启动另外的聚合例如RAFT聚合），其中所述第二聚合物嵌段致使所得双嵌段共聚物（基 本上）不可溶于聚合介质/溶剂，并且从而原位形成胶体颗粒。
[0228] 热响应共聚物的颗粒合适地在并入干细胞培养基之前被灭菌。这样的灭菌可以通 过超滤来执行。最合适地，颗粒以其非凝胶状形式被超滤（即当相关胶体颗粒是最小的并 且因此流体粘度被最小化时）。如此，颗粒可以在提供非凝胶状形式的颗粒（或其对应的分 散体）的合适温度下被超滤。
[0229] 合适地，热响应共聚物的颗粒的超滤可通过0. 01-1 μ m过滤器、合适地 0. 3-0. 6 μ m过滤器来执行。在一些实施方案中，过滤器可以是0. 22 μ m或0. 45 μ m的过滤 器。
[0230] 合适地，热响应共聚物的颗粒待分散入其中的水性媒介物在将热响应共聚物的颗 粒分散至其中之前被单独地预形成。然而，水性媒介物可以可选地例如在颗粒已经被初始 地分散在部分形成的水性媒介物（例如水）中之后原位制备。在此类情况下，相关的营养 物可以在颗粒已经合适地分散之后被添加至部分形成的水性媒介物。
[0231] 形成之后，将培养基合适地储存并与干细胞一起直接使用。
[0232] 干细朐组合物
[0233] 本发明提供了干细胞组合物，所述干细胞组合物包含分散在如本文定义的干细胞 培养基内的一种或更多种干细胞。
[0234] 水性媒介物，特别是其中的干细胞营养物，可以容易地分散遍及凝胶状形式的培 养基。合适地，取决于干细胞培养基和/或水性媒介物的含量，水性媒介物和/或其中包 含的营养物容易的分散遍及凝胶状形式的干细胞基质允许包封在其中的干细胞被储存、保 存、培养和/或分化。
[0235] 干细胞组合物基质可以包含直至10% v/v的干细胞。干细胞基质可以包含至少 0. 5% v/v的干细胞。
[0236] 形成干细朐组合物的方法
[0237] 本发明还提供了制备根据本发明第二方面的干细胞组合物的方法，所述方法包 括：
[0238] (i)使非凝胶状形式的根据本发明第一方面的培养基与一种或更多种干细胞接触 以产生流体干细胞组合物（即干细胞在培养基中的流体分散体）；以及
[0239] (ii)任选地改变培养基的温度使得培养基从非凝胶状形式改变为凝胶状形式，从 而产生胶凝的干细胞组合物，其中干细胞分散在胶凝的培养基中。
[0240] 合适地，在启动干细胞组合物的凝胶化之前，将流体干细胞组合物充分搅拌，合适 地以提供具有一种或更多种干细胞以（基本上）均匀的模式分散的流体干细胞组合物。
[0241] 优选地，然后通过使培养基从非凝胶状形式改变为凝胶状形式使干细胞组合物胶 凝，并且从而产生胶凝的干细胞组合物。
[0242] 储存和/或保存干细朐的方法
[0243] 本发明提供了储存或保存一种或更多种干细胞的方法，所述方法包括：
[0244] (i)使非凝胶状形式的根据本发明第一方面的培养基与一种或更多种干细胞接触 以产生流体干细胞组合物；
[0245] (ii)改变培养基的温度使得培养基从非凝胶状形式改变为凝胶状形式并且从而 产生胶凝的干细胞组合物；以及
[0246] (iii)储存胶凝的干细胞组合物。
[0247] 在优选的实施方案中，以上方法的步骤（i)合适地在10°C或低于10°C、合适地在 5°C或低于5°C的温度下用干细胞培养基来执行。
[0248] 改变温度可以包括取决于培养基的胶凝特性和与其相关的热响应共聚物，分别增 加或降低温度高于或低于胶凝温度。
[0249] 在优选的实施方案中，干细胞培养基低于胶凝温度为非凝胶状且高于胶凝温度为 凝胶状。如此，以上方法的步骤（ii)合适地包括从最初低于胶凝温度升高干细胞组合物的 温度，直至或高于胶凝温度。最合适地，步骤（ii)包括调整干细胞基质的温度从在l〇°C或 低于l〇°C直至或高于18°C、合适地直至或高于35°C、最合适地直至约37°C。
[0250] 然后可以将干细胞储存在胶凝的干细胞组合物中持续合适的时间段。特别地，可 以将干细胞成功储存在基质内持续至少7天、合适地至少14天、合适地至少21天、合适地 至少28天、合适地至少56天。然而，从业者可以选择将所述干细胞储存持续更少的时间。 合适地，在18°C或高于18°C、合适地在35°C或高于35°C、最合适地在约37°C的温度下存储 干细胞。
[0251] 干细胞储存于其中的胶凝的干细胞组合物自身可以合适地被包含于合适地容器 内、最合适地密封的容器内。在一些实施方案中，将干细胞基质储存在包括至少1% v/v的 C02、合适地至少3% v/v的C02、更合适地至少4. 5% v/v的032的密封的大气内。合适地， 密封的大气包括不多于8%的C02、合适地不多于6%的C0 2。密封的大气合适地具有至少 80%的湿度、合适地至少90%的湿度、合适地约95%的湿度。密封的大气合适地具有至多 100%的湿度、合适地至多98%的湿度。
[0252] 在将干细胞储存在本发明的培养基内期间，可以用营养物培养基覆盖胶凝的培养 基，营养物培养基诸如本文描述的干细胞培养基，特别是人胚胎干细胞培养基。可以将此类 营养物培养基定期替换和/或补充（例如至少每两天）。该过程可有助于维持干细胞的活 力。
[0253] 除了捕获和储存干细胞之外，以上的方法可以包括随后释放干细胞的步骤。通常 这包括使得培养基恢复至其非凝胶状形式以提供流体干细胞组合物（例如通过将温度调 整至在10°C或低于10°C，或在5°C或低于5°C )，并且还可包括从该流体干细胞组合物提取 干细胞。干细胞可以被机械地提取，例如通过移液管。此类干细胞可以被提取为聚集物，合 适地在引入本发明的培养基之前以相同方式将其收获。然后干细胞可以以任何合适的方式 被随后使用。
[0254] 在储存于本发明的培养基期间特别地持续21天或更少的储存时间期间，所述培 养基合适地延迟和/或阻止干细胞分化和/或增殖（特别地相比于储存在标准干细胞培养 基中）。增殖状态或减少可以通过视觉检查，例如通过显微镜来判断。分化状态或减少可以 通过检查细胞形态和经由用特定的标志物单克隆抗体通过荧光激活细胞分选术（FACS)的 分析来判断。
[0255] 培养干细朐的方法
[0256] 本发明提供了培养干细胞的方法，所述方法包括：
[0257] (i)使非凝胶状形式的根据本发明第一方面的培养基与一种或更多种干细胞接触 以产生流体干细胞组合物；
[0258] (ii)改变培养基的温度使得培养基从非凝胶状形式改变为凝胶状形式并且从而 产生胶凝的干细胞组合物；以及
[0259] (iii)在胶凝的干细胞组合物内培养干细胞。
[0260] 胶凝的干细胞组合物提供了用于培养干细胞的3D凝胶网络。这不同于标准的2D 细胞培养方法。
[0261] 在优选的实施方案中，在30°C和45°C之间、优选地在35°C至40°C、最优选地37°C 的温度下用干细胞基质进行培养。
[0262] 培养基可以是水性媒介物自身。在一些实施方案中，水性媒介物被初始地制备为 培养基。在一些实施方案中，可以将另外的成分添加至水性媒介物以产生培养基，例如然后 储存、保存或分化干细胞。
[0263] 培养基可以合适地包括促进干细胞生长的标准培养营养物。此类标准培养基可以 包括HES培养基和小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞。此类培养基合适地不同于储存干细胞期 间在本发明的培养基内使用的任何干细胞营养物/培养基。
[0264] 本文中培养干细胞的方法预期包括培养任何分化后的干细胞。
[0265] 培养的方法可以在培养之前或之后另外地包括储存和/或保存。
[0266] 与储存或保存干细胞的方法相同，该培养干细胞的方法可以包括随后的释放干细 胞的步骤。通常这包括使得干细胞培养基变为非凝胶状以形成流体干细胞基质，并且还可 以包括从流体干细胞基质提取干细胞。然后干细胞可以以任何合适的方式被使用，包括用 于本文描述的任何应用。
[0267] 分化干细朐的方法
[0268] 本发明提供了分化干细胞的方法，所述方法包括：
[0269] (i)使非凝胶状形式的根据本发明第一方面的培养基与一种或更多种干细胞接触 以产生流体干细胞组合物；
[0270] (ii)改变培养基的温度使得培养基从非凝胶状形式改变为凝胶状形式并且从而 产生胶凝的干细胞组合物；以及
[0271] (iii)在促进干细胞的分化的条件下培养干细胞。
[0272] 在优选的实施方案中，在30°C和45°C之间、优选地35°C至40°C、最优选地37°C的 温度下用干细胞基质实现培养。
[0273] 促进干细胞分化的合适的剂可以从一开始就存在于培养基中或可选地，可以在培 养期间（例如，在储存、保存或甚至培养干细胞之后）被加至胶凝的干细胞组合物。
[0274] 所述方法可以包括在干细胞分化之前或之后的细胞培养。在一些实施方案中，此 类分化和培养可以在原位进行，但是合适地是顺序地而不是同时地进行。
[0275] 分化的方法可以另外地包括在干细胞分化之前或之后储存和/或保存细胞。
[0276] 与储存或保存干细胞的方法相同，该分化干细胞的方法可以包括随后的释放干细 胞的步骤。通常这包括使得干细胞培养基变为非凝胶状以形成流体干细胞基质，并且还可 以包括从流体干细胞基质提取干细胞。然后干细胞可以以任何合适的方式被使用，包括用 于本文描述的任何应用。
[0277] 用于储存、保存、培养和/或分化干细朐的试剂倉
[0278] 本发明提供了用于制备根据本发明第一方面的培养基的试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0279] ⑴如本文定义的合成的热响应共聚物的颗粒；以及
[0280] (ii)水性媒介物，所述水性媒介物任选地还包含用于维持干细胞的活力的营养 物。
[0281] 在混合水性媒介物之前可以在水性媒介物（例如水）中预形成颗粒。可选地，可 以将共聚物提供为分散在水性媒介物中的固体，从而其自发地形成合适的胶体颗粒。
[0282] 合适地，水性媒介物还包括用于干细胞的营养物，但是在某些实施方案中这些可 以被分别添加并且形成试剂盒的不同组分。
[0283] 细朐治疗和药物组合物
[0284] 本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明第二方面的干细胞 组合物和任选地一种或更多种药学上可接受的赋形剂。
[0285] 本领域中已知的任何合适的药物赋形剂可以被使用。设想本发明的大多数药物组 合物将是包含本发明的干细胞组合物的注射剂、输注剂或植入物。
[0286] 根据本发明的第十一方面，提供了如本文定义的药物组合物，用于在治疗中使用。
[0287] 根据本发明的第十一方面，提供了如本文定义的药物组合物，用于在干细胞治疗 中使用。
[0288] 根据本发明的第十二方面，提供了如本文定义的培养基用于储存、保存、培养和/ 或分化一种或更多种干细胞的用途。
[0289] 当将如上文定义的细胞或干细胞基质以合适的剂量范围施用时，预期没有不利的 毒物学作用。
[0290] 用于在治疗中使用的本发明的细胞或干细胞组合物的有效量是足以缓解研究的 身体状况的症状、减慢所述身体状况的进展、或降低具有身体状况的患者（例如人）中的症 状恶化的风险的量。
[0291] 根据熟知的医学原则，本发明的细胞或干细胞组合物的用于治疗或预防目的的剂 量大小将根据状况的性质和严重度、动物或患者的年龄和性别以及施用途径自然地变化。
[0292] 本文定义的细胞和干细胞组合物可以被用于的治疗最合适地是细胞治疗，尤其是 干细胞治疗。预期接受此类治疗的受试者合适地是人或动物受试者。治疗可以包括用于以 下的治疗：细胞缺损（例如组织缺损、软骨缺损、骨缺损、骨疾病）、骨关节炎、骨质疏松症、 脊髓损伤、牙周病、心肌梗死、癌症、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症、 肌肉退行性紊乱和肌肉损伤。例如，治疗可以包括骨髓移植以治疗白血病。本发明的细胞 和干细胞基质可以被用于组织和/或器官的恢复、重建和/或更换。
[0293] 本发明的培养基还可以被用以维持从在某些治疗过程期间的患者获得的干细胞， 诸如维持从在密集的癌症化学治疗或放射治疗过程期间的患者的骨髓获得的干细胞。然 后，在医学治疗后，可以将干细胞重新引入至患者。 实施例
[0294] 材料和方法
[0295] 所有试剂购自Sigma-Aldrich并且直接使用，除非另外注明。GMA单体由GE0 Specialty Chemicals (Hythe, UK)提供并且 HPMA 单体购自 Alfa-Aesar (Heysham, UK) 〇
[0296] 使用DMF作为洗脱液通过凝胶渗透色谱法（GPC)评价分子量分布。GPC装置包括 两个Polymer Laboratories PL凝胶5 μ m混合C柱和一个维持在60°C的PL极性凝胶5 μ m 保护柱，与Varian 390LC折光率检测器联用。DMF流动相包含10mM LiBr并且流速是1. OmL min ^十种近似单分散的聚（甲基丙烯酸甲酯）标准物（Mp= 625 - 618, 000g mol 4被用 于校准。使用近似单分散的聚（甲基丙烯酸甲酯）校准标准物从GPC曲线计算数均分子量 (Mn)和 Mw/Mn。
[0297] 使用Bruker AVl-400MHz分光仪在d4-甲醇中记录1H NMR光谱。
[0298] 使用在100kV下运行的配备Gatan lk CCD相机的Philips CM 100设备实施透射 电子显微术（TEM)研究。碳包被的铜载网被辉光放电20-30秒以创建亲水性表面。然后将 载网浸入水性嵌段共聚物分散体（0. 5w/w% )中lmin并且然后浸入甲酸铀酰溶液（0. 75% w/v)中20s用于负染色。然后用滤纸将每一个载网印迹并且使用真空管干燥。
[0299] 实施例1 :通讨在磷酸盐缓冲盐水中的RAFT水件分散体聚合合成聚（单甲基丙燔 酸甘油醅）-聚（甲基丙燔酸2-羟基丙醅）（PGMA-PHPMA)蠕虫凝胶伸用2-氰丙基二硫代 苯甲酸醅（CPDB)合成聚（单甲基丙燔酸甘油醅）macro-CTA
[0300] 将 CPDB(0.576g，80%纯度，0.00208mol)和 GMA(20.00g，125.0mol，60 当量）称重 进入 250ml 圆底烧瓶并且用 N2净化 20min。添加 ACVA(0. 117g，0. 416mmol，[CPDB]/[ACVA] =5. 0)并且将烧瓶脱气持续另外的5min。添加脱气的无水乙醇（30ml)并且将烧瓶脱气持 续另外的5min，然后浸入设定在70°C的油浴。在115min之后，粗产物的 1H NMR分析表明 单体转化率为71%。通过从甲醇重复沉淀入过量二氯甲烷两次，将获得的？6獻!^(^〇-〇^ 纯化，然后溶解在水中并且冷冻干燥过夜以产生粉红色粉末，其通过 1H NMR光谱法被鉴定 为纯度>99%。
[0301] 通过1H NMR确定的平均聚合度为45 (参见图1)。
[0302] DMF GPC 分析（相对 ΡΜΜΑ 标准物）：Mn= 13,800g mol 1 Mw/Mn= 1. 13〇
[0303] 合成PGMA^ - PHPMA^双嵌段共聚物蠕虫
[0304] 将 PGMA45(4. 904g，0. 63mmol)和 ΗΡΜΑ(1(λ 0g，69. 4mmol)称重进入 50ml 圆底烧瓶 并且用N2净化20min。添加 ACVA(59. 0mg，0. 21mmol)并且将烧瓶脱气持续另外的5min。 然后添加预先用队净化30min的磷酸盐缓冲盐水溶液（59ml)并且将溶液脱气持续另外的 5min，然后将烧瓶浸入设定在70°C的油浴。在3h之后，基于5. 5ppm和6. 5ppm之间的乙稀 基信号的消失，粗产物的1H NMR分析表明HPMA单体转化率>99%。将获得的双嵌段共聚物 对磷酸盐缓冲盐水溶液透析过夜以产生无单体的20% w/w共聚物分散体，其在室温形成无 需支撑的凝胶。通过4 NMR和DMF GPC分析干燥的共聚物样品。
[0305] 通过1H NMR光谱法确定的双嵌段组成为PGMA45-PHPMAn。（参见图1)。
[0306] DMF GPC 分析（相对 PMMA 标准物）：Mn= 31，600g mol 1 Mw/Mn= 1. 09。
[0307] 流变学测量表明临界凝胶化温度（CGT)为17°C (参见图2)。
[0308] 实施例2 :通讨在磷酸盐缓冲盐水中的RAFT水件分散体聚合合成聚（单甲基 丙燔酸甘油醅）-嵌段-聚（甲基丙燔酸2-羟基丙醅-stat-甲基丙燔酸二甘醇醅） (PGMA-P(HPMA-DEGMA))蠕虫凝胶
[0309] 合成 PGMA^jnacro-CTA
[0310] 根据以上方案合成PGMA macro-CTA。在本实施例中，在2h后实现了 88%的GMA 转化率并且通过1H NMR计算出平均聚合度（DP)为55。
[0311] DMF GPC 分析（相对 ΡΜΜΑ 标准物）：Μη= 15, 700g mol 1 Mw/Mn= 1. 17〇
[0312] 合成 PGMA= - P (HPMA^-stat-DEGMA^)双嵌段共聚物
[0313] 将 PGMA55 (0. 750g，0. 085mmol)、ΗΡΜΑ(1· 028g，7. 14mmol)、DEGMA(0. 576g， 3. 06mmol)和ACVA(8. 0mg，0. 028mmol)称重进入50ml圆底烧瓶。添加用队预先净化30min 的磷酸盐缓冲盐水溶液（20ml)然后用N2净化溶液持续另外的lh，然后将烧瓶浸入设定在 70°C的油浴。3h之后，基于4 NMR光谱中5. 5ppm和6. 5之间的单体乙烯基信号的消失，粗 产物的4 NMR分析表明总单体转化率>99% (参见图3)。将获得的双嵌段共聚物对磷酸 盐缓冲盐水溶液透析过夜以产生10% w/w共聚物分散体。通过4 NMR和DMF GPC分析干 燥的样品。
[0314] 通过1H NMR 确定的双嵌段组成=PGMA55 - P (HPMAS4-stat-DEGMA36)。
[0315] DMF GPC 分析（相对 PMMA 标准物）：Mn= 36, 000g mol 1 Mw/Mn= 1. 18〇
[0316] 流变学测量表明临界凝胶化温度为26°C (参见图4)。
[0317] 实施例3 :制备可胶凝的干细朐培养基
[0318] 在4°C使用预洗涤的Spectra/Por透析膜（分子量截留=1000)将来源于实施 例1的10ml 10% w/w蠕虫凝胶（在磷酸盐缓冲盐水中）对100ml的人胚胎干细胞培养基 (K0-DMEM培养基，Invitrogen)透析24h，并且然后使用预先在冰上冷却的0. 22 μ m过滤装 置（Sartorius Minsart)过滤灭菌。将凝胶混合物用K0-DMEM培养基按50:50稀释（最终 5% w/w)并且用移液管吸入在冰床上冷却的12孔培养板（Nunc)的孔中(600 μ 1/孔）并 且摇动板以允许混合物的均匀涂布。
[0319] 然后孔内的可胶凝的干细胞培养基被用于随后的实验。
[0320] 实施例4 :捕获、储存和恢复干细朐
[0321 ] 将胚胎干细胞（Shef 1、11和RPE1细胞系）通过移液管机械地收获并且使用塑料 Pasteur移液管将50-100聚集物（50-100 μ m直径）以小体积（~20 μ 1)转移至实施例3 中描述的凝胶孔或具有单独的细胞培养基（对照）的平板的孔。摇动平板以分布细胞聚集 物并且直接转移至37°C、空气中5% 0)2和95%湿度的培养箱。5min之后，将在温度引起 的干细胞培养基的相变之后形成的凝胶用100 μ 1的细胞培养基覆盖并放回至培养箱。将 覆盖凝胶的培养基每2天更换并且通过显微术检查孔。
[0322] 在恢复和随后的测试之前，将干细胞储存4、7、14和21天。
[0323] 实施例5 :测试储存的/恢复的干细朐
[0324] 在4、7、14和21天时，从在冰床上冷却的孔板恢复干细胞聚集物，在所述时间点使 干细胞培养基经受相变回到流体形式并且转移至具有标准培养条件（hES培养基和小鼠胚 胎成纤维细胞饲养细胞）的孔板以观察细胞活力和自发的细胞分化。
[0325] 观察封装在具有细胞和凝胶之间的小间隙的凝胶中的干细胞的聚集物是可能的 (参见图5)。如通过相差显微镜检查判断的，在培养中随着时间的推移每一个细胞聚集物 的扩展表现出很少的或没有增加。当细胞聚集物在以上指定的时间段之后进行恢复时（图 6)，它们显示出如由单层增殖表明的活力、以及由细胞形态和由用特定标志物单克隆抗体 的荧光激活细胞分选术（FACS)的分析表明的细胞分化的多能性（图7-9)。
[0326] 平铺至单独的细胞培养基的对照干细胞聚集物表现出如通过形态观察和FACS分 析表明的直接分化（图10)。
[0327] 总之，胚胎干细胞聚集物在胶凝的干细胞培养基组合物中的孵育导致相比于标准 干细胞培养物超过21天的干细胞分化和增殖两者的停滞。
[0328] 实施例6 :NTERA2克降D1怀胎癌干细朐的包封
[0329] 本实施例描述了与聚（单甲基丙烯酸甘油酯）（PGMA) -起共聚合的甲基丙烯酸 2_羟基丙酯（HPMA)作为用于细胞包封的3D支架的用途。该共聚物可以在室温下自组装为 蠕虫状胶束。这些胶束能够彼此相互作用以产生3D凝胶基质。细胞分化和多能性标志物 的评价在将NTERA2克隆D1细胞包封进入聚合物凝胶中之后被评价。
[0330] 实验过程
[0331] 共聚物 3D 懦虫凝胶如之前由 Armes 等人（Adam Blanazs, Jeppe Madsen, Giuseppe Battaglia, Anthony J. Ryan 和 Steven P.Armes J. Am. Chem. Soc.，2011，133, 16581)描述 的被制备。然后使用0.2 μπι注射器式过滤器将共聚物凝胶过滤灭菌。然后将NTERA2克隆 D1胚胎癌干细胞脱离并且然后在4°C包封在凝胶内。作为参考，它们还被平铺入2D形式的 多孔细胞培养板中。
[0332] 在24h之后，将细胞培养基更换为含有视黄酸的分化培养基。在不同时间点测 定3D (凝胶）和2D (组织培养塑制品）系统的MTS和标志物表达（例如TUJ1、TRA1-60和 Vin2Pb22)〇
[0333] 结果
[0334] 在将细胞包封在凝胶内之后（图11)，它们被保持培养持续七天。MTS测定（图 12)显示蠕虫凝胶对于这种类型的细胞培养物是无毒的。此外，细胞的肌动蛋白-DAPI染色 显示它们可以在仅72h之后分裂、增殖并形成3D球体（图13)。在七天之后，球体形成随着 大的细胞集群的形成变得更明显（图13)。
[0335] 熟知的多能性干细胞标志物TRA1-60被用以染色细胞。图14显示相比于在组织培 养塑制品上培养的细胞，包封的细胞在14和21天之后依然表达这种标志物。诸如Vin2Pb22 的分化标志物的分析显示了其中在2D系统（组织培养塑制品）中直至21天才检测到表达 的单一情形。
[0336] 免疫荧光测定数据通过使用qPCR来定量标志物表达中的实时差异被证实。图 15显示了两种多能性标志物Nanog和0CT-04的表达，其当与分化标志物β 3微管蛋白和 h-ASHl相比时明显不同。
[0337] 结果显示PGMA-PHPMA蠕虫凝胶对NTERA2克隆D1 EC细胞是无毒的。此外，细胞 增殖并且形成球体，如由肌动蛋白/DAPI染色鉴定的。这使得蠕虫凝胶是用于在模拟3D细 胞环境的系统内研究分化过程和细胞发育的良好的候选物。表达的标志物的研究表明，细 胞在视黄酸中培养超过21天保持未分化。qPCR结果证实可能因为与PGMA-HPMA蠕虫凝胶 的低的相互作用，在具有视黄酸的情况下细胞没有分化。这些观察结果表明，干细胞分化更 加依赖于细胞和支架之间的机械传导力而不是来自生物活性分子的刺激。
[0338] 实施例7 TGMAfPHPMA^双嵌段共聚物蠕虫直接在细朐培养基中制备蠕虫凝胶 的用涂
[0339] 伸用2-氰丙基二硫代苯甲酸醅（CPDB)合成PGMAtmacro-CTA
[0340] 将 CPDB(0. 80g，3. 6mmol)和单甲基丙烯酸甘油酯（GMA，40. 59g，0. 25mol)称重进 入250ml圆底烧瓶并且用N2净化20min。添加 ACVA(202. 9mg，0. 72mmol)并且将溶液脱气 持续另外的5min。添加脱气的无水乙醇（61ml，1.04mol)并且将溶液再次脱气持续另外的 5min，然后浸入设定在70°C的油浴中。2h之后，在⑶ 30D中记录的1H NMR光谱表明GMA单 体转化率为约80%。通过从甲醇重复沉淀入过量二氯甲烷两次以移除未反应的单体，将 获得的聚合物纯化。在第二次沉淀之后，将纯化的聚合物过滤并且将获得的固体溶解在水 (200mL)中。使用设定在30°C的旋转蒸发仪使残留的二氯甲烷蒸发。在所有的痕量溶剂 被去除之后，将水溶液冷冻干燥过夜以提供粉红色粉末。溶解在CD 30D中的纯聚合物的1Η NMR光谱法研究表明平均聚合度为55。DMF GPC分析（相对聚（甲基丙烯酸甲酯）校准标 准物）给出 14, 100g mol 1的 Μ "和 1. 09 的 M W/Mn。
[0341] 在0. 15M PBS中以20% w/v固体合成PGMAf - PHPMA^双嵌段共聚物蠕虫
[0342] 将 PGMA55 (3. 023g，0· 33mmol)和 HPMA (6. 240g，41. 62mmol)称重进入 100ml 圆底烧 瓶并且用N2净化20min。添加 ACVA(31. 0mg，0. llmmol)并且将烧瓶脱气持续另外的5min。 然后添加磷酸盐缓冲盐水（PBS)溶液（Dulbecco A，0xoid，Basingstoke，37ml，150mM，预先 用N2净化30min)并且将溶液脱气持续另外的5min，然后将反应烧瓶浸入设定在70°C的油 浴2h，之后，在⑶ 30D中记录的1H NMR光谱表明HPMA转化率为几乎100% (在5. 6ppm和 6. 2ppm的乙烯基信号的消失）。对于获得的PGMA55-PHPMA135双嵌段共聚物，DMF GPC分析 (相对聚（甲基丙烯酸甲酯）校准标准物）给出35, 900g mol 1的MJP Mw/Mn= 1. 10。
[0343] 对于细胞生物学研究，评价了用于纯化并制备PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶的三种方 案，参见以下。
[0344] 方案 1
[0345] 将合成的20 % w/v水性PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶在4°C对PBS透析2天，透析液 (PBS)每12h更换（MWC0 = 1，000)。将获得的冷的自由流动共聚物分散体在合适的细胞培 养基中（DMEM或Nutristem ;在混合之前预冷至4°C )稀释至期望的浓度（通常6% w/v或 者10% w/v共聚物）并且在使用之前在该温度下过滤灭菌，如以下描述的。
[0346] 方案 2
[0347] 将合成的20 % w/v PGMA55_PHPMA135凝胶在4 °C对PBS透析7天，透析液每12h 更换（MWC0 = 1，000)。将获得的冷的自由流动分散体在合适的细胞培养基中（DMEM或 Nutristem ;在混合之前预冷至4°C )稀释至期望的浓度（通常6% w/v或者10% w/v共聚 物）并且在使用之前在该温度下过滤灭菌，如以下描述的。
[0348] 方案 3
[0349] 将合成的20 % w/v PGMA55-PHPMA135凝胶在4°C对纯水透析7天，透析液每12h更 换（MWC0= 1，000)。将获得的凝胶冷冻干燥以产生干燥的共聚物蠕虫的精细粉末。将该粉 末再分散在合适的细胞培养基中（DMEM、EB (拟胚体培养基）或Nutristem ;在混合之前预 冷至4°C )以提供6% w/v或者10% w/v的共聚物分散体。使用冰浴将温度维持在约4°C 并且磁力搅拌持续至少20min直到实现完全分散。在使用之前将获得的液体过滤灭菌，如 以下描述的。
[0350] 灭菌橾作
[0351] 将分散在期望的细胞培养基中的6% w/v PGMA55-PHPMA135共聚物蠕虫凝胶冷却至 4°C以引起蠕虫至球形的转换，并且因此经受去凝胶化以提供自由流动的共聚物球体分散 体。然后使用无菌〇. 20 μ m注射器式过滤器将该冷的低粘度流体超滤入置于超净工作台内 的无菌容器中。在超滤之前将注射器和过滤器储存在_20°C持续至少lh以防止在接触时的 凝胶化。然后将获得的灭菌的共聚物分散体直接用于细胞集落包封实验，或储存在4°C或 者-20°C用于将来使用（取决于细胞培养基的规格）。
[0352] 与PGMA^-PHPMA^蠕虫凝胶直接接触中的细朐活力
[0353] 细胞活力测定使用原代人真皮成纤维细胞（HDF)来执行。
[0354] 原代人真皮成纤维细胞（HDF)从ATCC (LGC Standards，UK)分批获得。它们主要提 取自乳房缩小术和新生儿包皮。使用标准培养基（DMB1补充以10% FCS、2x 10 3 mol dm3 L_谷氨酰胺、0. 625 μ g/ml两性霉素 B、100IU/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素）在T75烧瓶 中常规地培养成纤维细胞。在传代4次和9次之间的成纤维细胞被用于测试。
[0355] 使用MTT测定对人真皮成纤维细胞（HDF)的细胞活力进行测定
[0356] 将HDF以3xl04个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并且生长直到80%汇合（通 常48h)。在与细胞的直接接触和另外地非直接接触两者中评价凝胶（转篮法）。将非接触 的ThinCert (Greiner Bio-One, UK)装置用以鉴定可能存在于懦虫凝胶中的任何毒性低分 子量化合物（比如，未处理的HPMA单体）。ThinCert是组织培养塑制品的小篮样结构，具 有安装在24孔板上的聚碳酸酯膜底部。因此将细胞通过24孔板中的细胞培养基暴露至凝 胶，但不是通过直接接触。该装置区分蠕虫凝胶的直接接触对细胞的影响和残留的小分子 杂质的影响。
[0357] 对于非直接接触的装置，将250 μ 1的10%共聚物凝胶加至每一个ThinCer篮。将 细胞置于每一个篮下并且浸入合适的细胞培养基（500 μ 1)中。对于直接接触的装置，将细 胞培养基从孔移出并且将凝胶（通常500 μ 1)直接施加至细胞单层上。将凝胶批次在80% 汇合的HDF细胞上测试超过24h。然后通过ΜΤΤ测定（3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二 苯基溴化四氮唑）（Sigma-Aldrich，St Louis，M0)来评价细胞活力。将细胞在4°C用冷的 PBS洗涤，然后与MTT溶液（20°C下的PBS中的0. 5mg/ml MTT，lml/24孔板的孔）一起在 37°C在增湿的培养箱（5%C02/95%空气）中孵育lh。对于健康的有活力的细胞，MTT通过 线粒体酶、琥珀酸脱氢酶被还原为紫色甲臜盐，其允许细胞活力的光谱定量。lh之后，将溶 液抽出并且通过加入酸化的异丙醇（0. 30ml/24孔板的孔），随后孵育10min，将不可溶的细 胞内甲臜产物溶解并且从细胞移出。然后使用读取板的可见吸收分光光度计确定在540nm 处的吸光度，在630nm处的吸光度被用作参照。将平均活力数据和SEM针对阴性对照（未 处理，100%活力）归一化并且表示为活力百分比土SEM。实验在一式两份的孔的样品中执 行，η = 3次独立实验。对于统计分析，学生配对t检验被用于原始数据以评价样品和对照 组之间的差异显著性。
[0358] 结果
[0359] 使用聚合诱导自组装（PISA)构想，（Blanazs等人，J Am Chem Soc，2012 年，134, 9741-9748) PGMA-PHPMA双嵌段共聚物蠕虫凝胶可以在纯水中或者在生理缓冲液 诸如PBS中直接合成。原则上，PBS应促进细胞生物相容性，因此初始构想（参见以上方案 1)包括在PBS中以20% w/v固体合成PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶，随后在4°C以其非胶凝的 形式对PBS透析2天（以确保完全去除任何低分子量杂质），然后用期望的细胞培养基稀释 以提供6% w/v蠕虫凝胶。然而，对人真皮成纤维细胞（HDF)的细胞活力测定表明，该方案 不允许实现最佳的细胞活力（图16)。事实上，直接接触和间接接触ThinCert测定二者均 表明细胞活力的明显降低（P〈〇. 01)，参见图16。因此新的方法（参见以上方案2)被开发， 其中使PGMA55-PHPMA135共聚物分散体经受持续7天而不是2天的透析。细胞活力测定证实 了性能的改进，ThinCert测定显示相比于未处理的对照组没有显著差异（参见图16)。然 而，直接接触测定仍然表明次佳的细胞活力（P〈〇. 05)。这不是出乎意料的，因为当制备此类 蠕虫凝胶时细胞培养基用PBS稀释两倍并且因此未处于其最佳浓度。为进一步优化细胞活 力，设计了第三方案（参见以上方案3)，其中在PBS中以20% w/v制备PGMA55-PHPMA135共 聚物蠕虫，对纯水透析7天并且冷冻干燥过夜以提供干燥粉末，其可以被再分散在100 %细 胞培养基中以重新形成无需支撑的透明水性蠕虫凝胶。该后面的方案产生表现出非常高的 细胞活力（图16)，同时维持细胞生物学应用期望的热可逆凝胶化行为的水凝胶。
[0360] 实施例8 :将hES细朐集落于37°C长期浔入PGMAfPHPMA^禱虫凝胶中、随后通讨 在4°C去凝胶化收获细朐之后，伸用存活/死亡测宙宙量hES细朐集落的存活
[0361] 集落恢复％实验
[0362] 除非另外声明，hES细胞通常使用Nutristem细胞培养基（Stemgent, UK)和用 Cellstart 包被的 t25 容器（Life Technologies, UK)在无异种成分（xeno-free)的条件 下生长。将细胞培养物维持在37°C在增湿的培养箱中（5% C02/95%空气）并且将培养基 每天更新。当培养物达到最佳的细胞密度（通常60-70%表面覆盖）时，将细胞培养基再 度补满并且将集落在光学显微镜的辅助下机械地收获。将集群从细胞培养基恢复并且置于 35mm皮氏培养皿上，为凝胶接种做好准备。将ibidi 8孔载玻片置于冰上并且将500 μ 1冷 的6% PGMA55-PHPMA135共聚物分散体（其在~4°C是自由流动的液体）加至每一个孔。使 用配备有'超细'吸头的无菌塑料巴斯德吸管，将个体集落置于每一个ibidi孔的中心并且 温和地搅拌以允许混合。通过将ibidi孔置于设定在37°C的增湿的培养箱（5% C02/95% 空气）中来直接引发凝胶化（图17)。将细胞集落孵育期望的时间段（即7、14或21天）， 然后收获。使用光学显微镜确定每一个胶凝的孔中的集落的数目（通常3-15个）。通过将 每一个ibidi载玻片置于冰上约5min来引发凝胶化（图17)并且将获得的冷的自由流动 的含有细胞集落的共聚物分散体在Cellstart处理的含有Nutristem(5. 0ml)的6孔板中 稀释约10倍。这导致集落释放入培养基。使用光学显微镜检查ibidi孔并且记录保持在 孔中的集落（或集落损耗）的数目。将6孔板在增湿的培养箱（5% C02/95%空气）中储 存约3h以允许有活力的细胞集落粘附至Cellstart基质。随后，将培养基每天再度补满并 且持续直至7天监控集落，记录旺盛生长的集落的数目。将集落恢复％计算为针对去凝胶 化之前的初始集落数目归一化的每个时间点的平均集落恢复土SEM。集落损耗％也被相似 地评价。将内部对照组包括在本研究内，其中将细胞集落浸入蠕虫凝胶中仅lOmin，并且然 后直接收获。这使得集落分离和集落转移方案的效率能够被评价。实验在一式三份的孔中 执行，η = 3次独立实验。
[0363] 存活/死亡测定
[0364] 使用熟知的商业化的存活/死亡测定（Life Technologies, UK)评价浸入在 PGMA55-PHPMA13蠕虫凝胶内的hES细胞集落的活力。该测定使用细胞可渗透的SYTO? 9 绿色荧光核酸染料（激发光480nm，发射光500nm)和不可渗透的红色荧光核酸染料，碘化丙 啶（PI，激发光490nm，发射光635nm)的二元混合物。具有受损的（即渗漏的）膜的细胞被 染成红色（PI)并且被指定为死的或将死的，然而具有完整膜的细胞被染成绿色（Syto-9) 并且指定为活的。当单独使用时，PI染料通常标记所有细胞；但当两种染料均存在时，PI渗 透损坏的膜并且由于Syto 9而猝灭荧光，使得其绿色信号不被检测到。简而言之，将胶凝 的集落冷却至约4°C持续5min以引发去凝胶化并且然后允许在重力下沉淀。将自由流动的 水性共聚物分散体上清液部分地移出并且用预冷至4°C的细胞培养基将集落洗涤一次。然 后将水性流体移出并且将温的（37°C )细胞培养基加至含有Syto 9(15 μ M)和PI (60 μ M) 的每一个孔。将细胞在增湿的培养箱（5% C02/95%空气）中孵育25min以允许染料摄取 发生。然后将细胞核用Hoechst 33342 (Life Technologies, UK)复染另外的5min。最终， 将集落用PBS(预冷至4°C )洗涤并且加入另外的培养基（取决于容器，通常对于6孔板为 3ml并且对于ibidi成像板为500 μ 1)，然后使用用于活细胞研究的配备有Okolab环境控 制室的Nikon A1共聚焦显微镜检测。
[0365] MM.
[0366] 基于荧光染料保留与共聚焦显微术组合的存活/死亡细胞测定使能够在细胞浸 入蠕虫凝胶内的同时监测其活力（参见图18)。在7天之后，所有细胞集落表现出高的活 力，具有非常少的碘化丙啶（PI，其选择性将死细胞染成红色）染色的证据并且观察到主要 的绿色荧光标志物（Syto 9)。在浸入14天之后，一些集落包含无活力的PI染色的细胞区 域（估计为〈总区域的10% )，但是集落中的大多数细胞表现出良好的活力，如通过由于 Syto 9的绿色荧光指示的（图18)。在浸入蠕虫凝胶内21天之后，显著比例的细胞集落仍 然表现出至少一些有活力的细胞（参见图18)。
[0367] 为进一步评价这些蠕虫凝胶内的细胞集落的活力，确定了去凝胶化之后恢复的有 活力的集落的比例（图19)。已知集落脱离的力学可损害PSC活力（Heng等人，Biotechnol Appl Biochem. 2007, 47, 33-37)，因此实施对照实验（参见图19,0周），其中将细胞集落浸 入蠕虫凝胶内仅10分钟，然后通过冷离心再次移出。约70±3%的收获的细胞集落能够粘 附至Cellstart并且增殖。在7天和14天之后，分别恢复了 57±10%和59±5%的有活力 的集落。
[0368] 因为接种用于集落恢复％实验的集落被机械地解聚，所以难以实现均一的集落大 小分布。人们发现在从蠕虫凝胶分离之后，初始集落大小对结果具有明显影响。如果集落 大小小于100μπι直径，在分离之后极少的集落粘附至CellStart并增殖并且该小的群体 完全分化或不会旺盛生长（图20A和20B)。对于超过100 μ m的集落大小观察到较好的 恢复率（图20C、20B)，具有在100μπι和200 μπι之间范围的集落表现出典型的ES细胞形 态（图20D)。当使用液体培养基时，集落大小对细胞活力的相似影响已经被其他工作者在 7??? (Thomson, J. A. , Itskovitz-Eldor, J. , Shapiro, S. S. , ffaknitz, M. A. , Swiergiel, J. J.，Marshall, V. S.和 Jones, J. M. Science, 1998, 282, 1145-1147 ;Reubinoff 等人，Nature Biotechnology 2000, 18, 399-404)。有趣地，当将相对大（》200 μ m)的集落浸入蠕虫凝胶 中时（图20E)，它们在顶部明显变得密集，而不是平展。此外，此类集落的边缘往往表现出 一定程度的神经元分化，如通过光学显微术判断的。对于分散在液体培养基中的高密度集 落，报道了相似的观察结果（Reubinoff 等人，Nature Biotechnology, 2000, 18, 399-404) 〇
[0369] 实施例9 :非增葙件停滞（假死状杰）的实验证据
[0370] DNA 提取
[0371] 将集落从t25烧瓶机械地回收并且在使用之前置于35mm皮氏培养皿上。用固定 体积（500 μ 1)的细胞集落接种每一个ibidi孔。该悬浮液允许沉淀5min并且然后将液体 培养基小心地移出。然后将6% PGMA-PHPMA共聚物分散体（500 μ 1 ;预冷至4°C )加至每一 个孔并且温和搅拌以允许混合。通过将ibidi孔在37°C置于增湿的培养箱（5% C02/95% 空气）中直接引发凝胶化。然后将细胞集落孵育7、14或21天。当需要时，通过将每一个 ibidi载玻片置于冰上约5min引发去凝胶化。然后将每一个孔的内容物置于含有冰冷的 PBS(l.Oml)的标记的1.5ml Eppendorf管中。在4°C持续5min两次离心样品（1000rcf)。 使用100 μ 1的消化缓冲液（包含TE缓冲液（10mM Tris pH 8和ImM EDTA)加0· 2% SDS) 将细胞沉淀物在37°C孵育4h。在此之后，将包含用TE缓冲液饱和的25:24:1的苯酚：氯 仿：异戊醇（100 μ 1)的溶剂混合物加至每一个Eppendorf管并且通过祸旋完全混合。将样 品在20°C离心5min(14, OOOrcf)。然后将水性上清液轻轻倒出并且与冰冷的乙醇（450 μ 1) 和3Μ乙酸钠（50 μ 1)混合。通过在20°C离心5min(14, OOOrcf)使DNA沉淀。将上清液小 心地轻轻倒出并且将DNA沉淀物在37°C烘箱中干燥。将干燥的沉淀物重悬在TE缓冲液 (20 μ 1)中。使用Nanodrop分光光度计通过确定在260nm处的吸光度来计算DNA浓度。将 数据相对于内部对照组归一化，在内部对照组中细胞集落胶凝持续约l〇min并且然后直接 收获（第〇天）。实验在一式两份的孔中执行，η = 3次独立实验。
[0372] ki67 免痔标iP,
[0373] 对胶凝的集落和恢复的集落（即在热诱导的去凝胶化之后）执行针对ki67的免 疫标记测定。将平铺的恢复的集落用PBS直接洗涤两次并且使用PBS中的4%甲醛的水 溶液（750 μ 1)固定30min。通过在冰上孵育约5min以诱导去凝胶化来从蠕虫凝胶分离 集落。然后将每一个孔收集到含有冰冷的PBS(lml)的1.5ml Eppendorf管中。将集落 在4°C持续5min(1000rcf)洗涤两次并且然后使用PBS(100 μ 1)中的4%甲醛的水溶液固 定30min。然后在PBS中将所有样品洗涤三次并且使用0. 1 % Triton X100PBS溶液渗透 20min (lmL/6孔板中的孔并且100 μ Ι/Eppendorf管）。然后将集落在PBS中洗涤三次并且 在20°C于5% BSA-PBS中封闭2h，然后在温和摇动下与一抗溶液（1:1000兔抗人ki67单 克隆抗体（Abeam)+PBS中的1% BSA) -起在4°C孵育过夜。然后将这些抗体标记的集落在 PBS中洗涤三次并且在温和摇动下与二抗溶液（1:1000山羊抗兔Cy3 IgG (abeam)+PBS中的 1% BSA) -起在20°C孵育lh。用PBS洗涤集落三次并且将细胞核用Hoechst 33342(Life Technologies，UK)复染5min。最后，使用PBS将每一个样品洗涤三次，然后使用EV0S荧光 显微成像系统检查。
[0374] MS
[0375] hES集落随时间推移的光学显微术研究显示，集落大小或数目几乎没有变化（参 见图21)。然而，存活/死亡成像和集落恢复数据表明，在集落长期储存于蠕虫凝胶中之后， 其相对高的比例保持有活力的（图18)。为评价蠕虫凝胶内的细胞增殖的程度，收获集落并 且随时间推移确定从细胞核提取的DNA的归一化的量（相对于第0天）（参见图21)。检测 到 DNA的总量没有明显变化，表明在细胞集落储存在蠕虫凝胶中期间其可忽略的增殖。免 疫标记实验（参见图22)表明浸入蠕虫凝胶中之后，hES细胞经历细胞周期在G1/S检查点 的停滞。ki-67的存在是细胞增殖的熟知的标志物并且该蛋白质存在于细胞周期的每一个 阶段期间（Scholzen和 Gerdes J Cell Physiol. 2000, 182, 311-322)。胶凝的集落中 ki-67 的不存在通过在调查的每个时间点的选择性染色实验来证实，其暗示了 hES细胞在GJ月退 出细胞周期并且进入其休眠状态或停滞态（参见图22)。与此相反，经由去凝胶化然后粘 附至合适的ECM基质（即，Cellstart)的收获使集落能够重新进入细胞周期（如通过阳 性ki-67染色判断的）并且重新恢复其增殖状态（参见图22)。PGMA 55-PHPMA135双嵌段共 聚物蠕虫凝胶不包含特异性结合基序以促进细胞粘附。事实上，它的多个羟基的功能被已 知为减少细胞粘附（Faucheux 等人，Biomaterials, 2004, 25, 2721 - 2730 ;Arima 等人，J. Mater. Chem.，2007, 17, 4079-4087)。最近，已报道hES细胞利用失巢凋亡作为（i)在细胞粘 附不存在时的细胞死亡机制（Watanabe 等人，Nature Biotechnology, 2007, 25, 681-686) 和（ii)在分化期间典型的生理事件（Coucouvanis 和 Martin Cell, 1995, 83, 279 - 287)。 因此，将hES细胞浸入如此生物惰性的、非相互作用的3D基质中是不明显的，因为这些蠕虫 凝胶应导致停滞而不是失巢凋亡。
[0376] 实施例10 :运输数据
[0377] 最近，胚胎干细胞库已经在全世界范围建立。这些库在将用于研究团体的高质 量的人和动物ES细胞存档和提供高质量的人和动物ES细胞中起重要作用。这些细胞库 已经有效产生大量冷藏保存的细胞系和基因工程化的（即报告物基因）细胞系并且已经 向要求其的研究者供应这些株系。冷藏保存对于储存和运输人胚胎干细胞（ES细胞）是 关键的步骤（The International Stem cell banking Initiative, Stem Cell Rev and R印，2009, 5, 301 - 314)。有效冷藏保存的方法必须提供高的解冻效率并且维持细胞的多 能性和分化潜能两者。然而，冷藏保存的细胞的运输是相对昂贵的并且具有许多相关的 问题。例如，接收设施必须具有特定冷冻和解冻方案所需的合适的技术人员和设备并且 最佳的递送时间是关键的（Shaw 和 Nakagata Methods Mol Biol, 2002, 180, 207 - 228)。 此外，次佳的冷冻解冻过程可以对细胞造成明显损伤（Shaw和Nakagata Methods Mo 1 Biol, 2002, 180, 207 - 228)。此外，液氮容器的运输由国际航空运输协会（International Air Transport Association)严格规定（ΙΑΤΑ0(ΙΑΤΑ危险物品条例手册第54版本（国际 航空运输协会），产品代码：BK-IATA13, 2013)，所以可选的较便宜的和较安全的运输选择 是高度期望的。通常，研究机构交换细胞，将它们在以液体培养基填充的C0 2充气的细胞培 养容器中运输。尽管这潜在地是有用的替代选择，但是培养中的ES细胞无法很好地应对低 温应激（Reubinoff等人Hum. Reprod. 2001，16, 2187 - 2194)。可能令人意外地，非常少的研 究者已专心于此课题，特别是考虑到生长ES细胞市场的潜在商业收益。对于可局部配送的 产品，其应该能够在运输条件下存活至少24h。如果其存活时间可以被增加至48h，这应该 使能够洲际间递送并且存活72h在原则上会允许在全世界范围的递送。
[0378] 调查了使用Nutristem制备的6% PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶作为持续24、48和72h 的储存时间的潜在运输培养基（图23)。作为对照实验，Nutristem还以其液体（即非胶凝 的）形式被用作常规细胞培养基。在本实施例中，使细胞集落粘附至单独的Cellstart包被 的35mm ibidi培养皿的底部。将浸入蠕虫凝胶或者液体Nutristem的细胞集落在37°C的 5 % C02-增湿的培养箱中平衡8h，然后储存在典型的聚苯乙烯运输盒中。在假设的储存时间 期间，将加热的（37°C)垫加至储存盒以最小化随该时间段的推移的热损失。这使得能够维 持在约18°C至22°C的温度范围而不是37°C。在每一个时间点之后，将浸入液体Nutristem 中的细胞返回至正常细胞培养条件（即37°C在增湿的培养箱中（5%C02/95%空气）），而将 蠕虫凝胶内的集落通过去凝胶化（如前述的）分离并且然后允许粘附至单独的Cellstart 包被的35mm ibidi培养皿的底部。将粘附的细胞集落留置在培养箱中过夜（约16h)以恢 复并且然后记录这些集落的光学图像（图23)。在模拟的运输储存条件下，液体Nutristem 中的细胞集落良好存活直至24h，大多数集落表现出典型的hES形态。相似地，在相同条件 下储存之后，浸入懦虫凝胶中的集落也良好恢复。但是，储存在液体Nutristem中的细胞在 48h之后表现出应激迹象。集落表现出'聚集'并且脱离的碎片的量增加，尽管一些集落仍 然保持粘附。（图23)。相反，在蠕虫凝胶内储存的细胞集落在48h之后恢复相对良好并且 保留其特征性形态，但是相比于在24h之后分离的那些，显著较少的有活力的集落被恢复。 在72h之后没有有活力的集落可以从液体Nutristem被恢复；所有集落表现出脱离和聚集 (图23)。然而，在蠕虫凝胶内储存72h之后，一些有活力的细胞集落仍然可以被恢复（图 23) 〇
[0379] 实施例11 :在蠕虫凝胶内储存个体hES细朐
[0380] 研究了蠕虫凝胶保存个体hES细胞的悬浮液（而不是hES集落）的用途。培养个 体hES细胞的悬浮液并且然后在使用3i培养基制备的6% PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶中胶 凝。该特定的培养基包含有利于个体hES细胞培养物的特定失巢凋亡抑制剂（Gafni等人， Nature. 2013, 504(7479)，282-286)。简言之，用PBS将含有培养中的hES细胞的每一个t25 容器洗涤一次并且然后加入细胞解离液（1. 50ml，Sigma-Aldrich)。在37°C于增湿的培养 箱（5% C02/95%空气）中孵育3min之后，通过加入3i细胞培养基（1.51111)、随后于201€ 在lOOOrcf离心5min收获个体细胞的悬浮液。将沉淀物在~4°C重悬在液体3i细胞培养 基（1. 5ml)中或者冷的自由流动的共聚物分散体中（使用3i培养基制备的），其在加热至 37°C后快速形成蠕虫凝胶。在Cellstart包被的6孔板上培养液体3i培养基中的细胞，而 蠕虫凝胶加3i培养基中储存的细胞在37°C于增湿的培养箱（5% C02/95%空气）中24h之 后，通过去凝胶化分离并且然后允许粘附在Cellstart包被的6孔板上。在16h之后，通过 光学显微术检查细胞（图24)。从液体3i培养基以及蠕虫凝胶加3i培养基回收的细胞，在 其恢复之后表现出相似的大小、形态和表面覆盖率。因此，6% PGMA55-PHPMA135蠕虫凝胶可 以被用以储存个体hES细胞的悬浮液而没有任何可辨别的有害影响。
[0381] 实施例11 :流夺学研究
[0382] 使用配备有可变温度Peltier板和40mm 2°铝锥体的AR-G2流变仪（TA仪器）对 多种水性培养基中的6% w/v PGMA55-PHPMA135共聚物蠕虫凝胶进行流变学研究。
[0383] 对于三种类型的细胞培养基（例如PBS、EB(拟胚体培养基， Millipore)、NS(Nutristem 培养基，Stemgent)或 3i 培养基（Gafni 等人， Nature. 2013, 504 (7479)，282-286)，在凝胶强度（G，~lOta)或者临界凝胶化温度（CGT~ 18°C )方面没有观察到显著差异。使用PBS制备的蠕虫凝胶的CGT是略低的（17°C )，但其 热可逆行为却是广泛地类似的。在所有情况中，每种凝胶的应变扫描（图25b)产生可比较 的G'值（9Pa至13Pa)，具有以约60%应用的应变存在的从线性粘弹区的偏离。角频率扫 描（图25c)也是广泛可比较的；表明改变细胞培养基对蠕虫凝胶流变学仅具有相对缓和的 影响。
【主权项】
1. 一种用于干细胞的培养基，所述培养基包含分散在水性媒介物中的合成的热响应共 聚物的颗粒； 其中所述培养基能够响应温度变化经受非凝胶状形式和凝胶状形式之间的变化，并且 在所述非凝胶状形式中，所述培养基包含所述合成的热响应共聚物的颗粒的胶状稳定的水 性分散体，并且在所述凝胶状形式中，所述培养基是提供能够容纳干细胞的支架或基质的 凝胶形式； 并且其中所述水性媒介物还包含用于维持干细胞的活力的营养物； 并且其中所述热响应共聚物由式B来定义：其中P1表示源自单体M i的聚合物组分并且P 2表示源自水溶性单体M 2的基本上水不溶 性的聚合物组分。2. 如权利要求1所述的培养基，其中所述培养基能够响应温度变化经受所述非凝胶状 形式和所述凝胶状形式之间的可逆变化。3. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中所述培养基在低于胶凝温度的温度下以 所述非凝胶状形式存在，并且在高于所述培养基的所述胶凝温度的温度下以凝胶状形式存 在，并且所述培养基在大于或等于20°C的温度下是所述凝胶状形式。4. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中所述培养基以所述凝胶状形式是透明的。5. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中所述培养基（任何干细胞/分化后的细胞 除外）不含动物来源的产品。6. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中当所述培养基是所述非凝胶状形式时，所 述合成的热响应共聚物的颗粒基本上是球形（例如，球体或类球体颗粒），并且当所述培养 基是凝胶状形式时，所述合成的热响应共聚物的颗粒基本上是各向异性的"蠕虫"或"蠕虫 状"颗粒。7. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中所述热响应共聚物包含至少一种亲水性聚 合物嵌段和至少一种疏水性聚合物嵌段。8. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中： 每个单体M1选自式M 1A、Mib和/或M i。的单体：其中R1、Rw和R 11表示允许P i是至少部分水溶性的M 1A或M 1C的取代基， R2表示 H、CH 3或 CN， Rs表示有效允许P i是至少部分水溶性的芳环的一个或更多个取代基，并且 每个单体M2选自式M 2A和/或M 2B的单体：其中R3是允许P 2是基本上水不溶性的M 2的取代基，并且R4和R6独立地表示H或甲 基； 或P1是包含单体M i与单体M 2的共聚物，条件是所述聚合物P i保持水溶性。9. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中P i自身是包含单甲基丙烯酸甘油酯（GM) 单体单元的聚合物或共聚物，并且P2g身是包含甲基丙烯酸2-羟基丙酯（HPM)单体单元 的聚合物或共聚物。10. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中所述热响应共聚物是选自包括以下的组 的式B [P1-P2]的嵌段共聚物： -PGMA-PHPMA，其中所述PGM嵌段具有在20和200之间的聚合度；并且所述PHPM嵌 段具有在50和300之间的聚合度； -PGM-P (GM-HPM)，其中所述PGM嵌段具有10至120的聚合度（DP)，并且所述 P(GM-HPM)嵌段可以合适地具有在20和200之间的聚合度（DP);以及 -PGM-P (DEGM-HPM)，其中所述PGM嵌段具有在20和200之间的聚合度；所述 P(DEGM-HPM)嵌段具有在20和200之间的聚合度（DP);并且所述P (DEGM-HPM)嵌段中 DEGMA与HPMA单体单元的摩尔比位于10:1和1:10之间。11. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中所述水性媒介物包括磷酸盐缓冲盐水。12. 如任一前述权利要求所述的培养基，其中所述培养基包含： -1-30% w/w合成的热响应共聚物的颗粒； -70-99% w/w水性媒介物。13. -种用于制备根据权利要求1至12中任一项所述的培养基的试剂盒，所述试剂盒 包括： (i) 如权利要求1至12任一项中定义的合成的热响应共聚物的颗粒；以及 (ii) 如权利要求1至12任一项中定义的水性媒介物。14. 一种形成根据权利要求1至12中任一项所述的培养基的方法，所述方法包括将所 述合成的热响应共聚物的颗粒分散在所述水性媒介物中。15. 如权利要求14所述的方法，其中所述方法包括在所述热响应共聚物的颗粒在所述 水性媒介物中的分散之前，将其预灭菌；所述预灭菌包括所述热响应共聚物的颗粒的超滤。16. -种储存或保存一种或更多种干细胞的方法，所述方法包括： (i) 使非凝胶状形式的根据权利要求1至12中任一项所述的培养基与一种或更多种干 细胞接触以产生流体干细胞组合物； (ii) 改变所述培养基的温度使得所述培养基从所述非凝胶状形式改变为所述凝胶状 形式并且从而产生胶凝的干细胞组合物；以及 (iii) 储存所述胶凝的干细胞组合物。17. 如权利要求16所述的方法，其中步骤（i)在KTC或低于KTC的温度下用所述干细 胞培养基来执行；并且步骤（ii)包括将所述干细胞基质的温度从在l〇°C或低于KTC调整 直至18°C或高于18°C。18. 如权利要求16至17中任一项所述的方法，其中步骤（iii)包括将所述胶凝的干细 胞组合物储存至少7天。19. 一种干细胞组合物，所述干细胞组合物包含分散在根据权利要求1至12中任一项 所述的培养基中的一种或更多种干细胞。20. -种从胶凝的干细胞组合物释放一种或更多种干细胞的方法，所述方法包括： (i) 提供胶凝的干细胞组合物，所述胶凝的干细胞组合物包含分散在凝胶状形式的根 据权利要求1至12中任一项所述的培养基内的一种或更多种干细胞； (ii) 改变所述干细胞培养基的温度使得所述培养基从所述凝胶状形式改变为所述非 凝胶状形式，从而产生流体干细胞组合物；以及 (iii) 任选地其后从所述流体干细胞组合物分离所述干细胞。21. 如权利要求1至12中任一项所述的培养基用于储存、保存、培养和/或分化一种或 更多种干细胞的用途。22. -种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求19所述的干细胞组合物，以 及任选地一种或更多种药学上可接受的赋形剂。23. -种如权利要求22所述的药物组合物，用于在治疗中使用。24. -种如权利要求22所述的药物组合物，用于在干细胞治疗中使用。25. 如任一前述权利要求所述的培养基、试剂盒、方法、干细胞组合物、用途或药物组合 物，其中所述干细胞是哺乳动物干细胞。26. 如任一前述权利要求所述的培养基、试剂盒、方法、干细胞组合物、用途或药物组合 物，其中所述干细胞是除了通过包括破坏人胚胎和/或人胚胎干细胞的方法产生或获得的 那些之外的干细胞。27. 如任一前述权利要求所述的培养基、试剂盒、方法、干细胞组合物、用途或药物组合 物，其中所述干细胞是未分化的。28. 如上文参考所附的实施例和附图大体上描述的培养基、试剂盒、方法、干细胞组合 物、用途或药物组合物。
【文档编号】C12N5/00GK105899656SQ201480009328
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年2月21日
【发明人】艾伦·坎顿, 史蒂文·彼得·阿姆斯, 尼古拉斯·约翰·沃伦, 哈里·摩尔, 朱塞佩·巴塔利亚, 丹尼斯·赛钦
【申请人】谢菲尔德大学