siRNA及其在用于抑制PDK1基因表达的方法和组合物中的应用

siRNA及其在用于抑制PDK1基因表达的方法和组合物中的应用
【专利摘要】本发明涉及siRNA分子及其在用于抑制PDK1基因表达的方法和药物组合物中的应用。本发明还涉及所述siRNAs分子在治疗和/或预防以增加的PDK1基因表达和/或活性为特征的眼病中的应用，优选地，所述眼病是结膜炎和/或眼睛变态反应，诸如季节性变应性结膜炎、常年性变应性结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎和巨乳头状结膜炎。
【专利说明】s i RNA及其在用于抑制PDK1基因表达的方法和组合物中的 应用 发明领域
[0001] 本发明涉及这样的领域:siRNA产品及其在用于治疗和/或预防眼病的方法和组合 物中的用途，所述方法和组合物更具体地用于治疗和/或预防诸如结膜炎和/或眼睛变态反 应的眼病，所述眼病与高水平的PDK1表达和或活性相关。
[0002] 发明背景
[0003] RNA干扰(RNAi)是存在于大多数真核细胞中的天然存在的转录后调控机制，其使 用小双链RNA(dsRNA)分子以指引依赖于同源性的基因沉默。Fire和Mel 1〇在蠕虫线虫 (C.elegans)中的该发现{Fire，1998}获得了2006年的诺贝尔奖。在对其首次描述后不久， 也显示RNAi发生在哺乳动物细胞中，不是通过长的dsRNAs而是通过21个核苷酸长的双链小 干扰RNA(siRNAs)进行{Elbashir，2001} 〇
[0004] 据信RNA干扰的过程是在进化上保守的细胞防御机制，用于防止外源基因的表达， 并且为不同门（phyla)和区系（flora)所共有，其中它被称为转录后基因沉默。自从发现 RNAi机制，已经进行了大量研究，用于发现能够选择性地改变基因表达的新的化合物，其通 过处理这样的靶标而作为治疗人类疾病的新途径，所述靶标是利用涉及小分子或蛋白质的 常规药物方法"不能用药"的。
[0005] 根据现有知识，RNAi的机制始于由称为切酶(Dicer)的RNA酶III样蛋白质处理长 的双链R N A s之时。蛋白质切酶通常包含N端R N A解旋酶结构域，结合R N A的所谓P i w i / Argonaute/Zwi 11 e(PAZ)结构域，两个RNA酶III结构域和双链RNA结合结构域（dsRBD) {0〇11丨118,2005}，并且它的活性导致长的双链1?^8被加工为21-24个核苷酸的双链8丨1?^8， 该双链s iRNAs具有2个碱基的3 '突出端和5 '磷酸和3 '羟基。所得的s iRNA双链体然后结合到 称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的效应物复合物中，其中在双链s iRNA分子通过RNA解旋 酶活性的三磷酸腺苷(ATP)依赖性解旋时{Nykanen，2001 }，siRNA的反义或导引链指导RISC 识别并切割目标mRNA序列{Elbashir，2001}。导致mRNA降解的RISC的催化活性由核酸内切 酶Argonaute 2(AG02)介导{Liu，2004; Song，2004} DAG02属于高度保守的Argonaute蛋白质 家族。Argonaute蛋白质是~lOOKDa的高碱性蛋白质，其包含两个共同的结构域，即PIWI和 PAZ结构域{Cerutti，2000：KPIWI结构域对于与切酶的相互作用是关键的，并且包含负责切 害JmRNAs的核酸酶活性{Song，2004：KAG02使用siRNA双链体中的一条链作为指导去找到含 互补序列的信使RNAs并在相对于指导链的5'端的第10和第11个碱基之间切割磷酸二酯骨 架{Elbashir，2001} AISC活化期间的一个重要步骤是由AG02切割正义或信使链，将此链从 复合物中去除{Rand，2005}。分析siRNA指导链和PIWI结构域之间相互作用的晶体学研究表 明仅第2至第8个核苷酸构成指导RISC识别目标mRNA的"种子序列（seed sequence)"，并且 此序列中单个核苷酸的错匹配可以显著影响所述分子的沉默能力{Doench 2004;LeWiS， 2003}。一旦mRNA已经被切割，由于片段中不受保护的RNA末端的出现，mRNA被细胞内的核酸 酶进一步切割和降解，并且将不再被翻译为蛋白质{0rban，2005}，同时RISC将再循环用于 随后的若干轮{Hutvagner，2002}。这构成了导致特定mRNA分子及相应的蛋白质的选择性减 少的催化过程。可能利用基因沉默的这种天然机制从而通过直接将siRNA效应物递送到细 胞或组织中来调控任何所选的基因，在所述细胞或组织中它们将活化RISC并且产生被靶向 的mRNA的有效且特异性的沉默。RNAi已经用于生物医学研究，诸如HIV、病毒性肝炎、心血管 病和脑血管病、代谢病、神经变性病症和癌症的治疗{Angaji SA等2010}。
[0006] 已经发表了许多研究，其描述了为获得最大有效性siRNA应当具有的理想特征， BP，有关长度、结构、化学组成和序列。siRNA设计的初始参数由Tuschl及同事在W002/44321 中阐述，但是自此之后已经发表了许多后续研究、算法和/或改进。随着机制详细信息的出 现，siRNA选择方法已经变得更加精细，除此之外，对现有和新的数据进一步分析可以提供 关于进一步精细这些方法的另外的了解{Walton SP等2010}。备选地，一些最近的研究报道 了新型RNAi-引发结构的设计与分析与经典的19+2siRNA结构不同，并且其在突出端、长度 或对称性方面不符合经典siRNA的关键特征，这讨论了RNAi机制在哺乳动物细胞中的灵活 性{Chang CI等2011}〇
[0007] 此外，已经投入了大量努力来增强SiRNA的稳定性，原因在于，考虑到RNA酶在生物 流体中的普遍存在的性质，这被认为是基于siRNA的治疗的主要障碍之一。siRNA分子的另 一个固有的问题是其免疫原性，由此已发现siRNAs诱导先天性免疫系统的非特异性的激 活。非目标基因（mRNAs)的敲减是siRNA-介导的基因沉默的公知的副作用。其由于siRNA与 不同于目的靶标的mRNAs之间的部分互补性引起，并且由与任一 siRNA链具有序列互补性的 基因引起脱靶效应(OTEs)。用于稳定性增强和0ΤΕ减少所遵循的主要策略之一是使用修饰 的核苷酸，如2 ' -0-甲基核苷酸，2 氨基核苷酸，或含有2 ' -0或4 ' -C亚甲基键的核苷酸。此 外，已经描述了对连接相邻的核苷酸的核糖核苷酸骨架的修饰，即，主要通过引入硫代磷酸 酯修饰的核苷酸进行。似乎增强的稳定性和/或免疫原性降低通常与功效成反比{Parrish， 2000}，并且仅有特定数量的、位置和/或修饰的核苷酸的组合才能导致稳定的和/或无免疫 原性的沉默化合物。由于这是基于siRNA的治疗的主要障碍，所以已经公开了不同的研究， 其描述了表现出良好的结果的特定的修饰模式，这些的实例包括EP1527176，W02008/ 050329，W02008/104978或W02009/044392,尽管在参考文献中可以找到许多更多实例 {Sanghvi YS.2〇ll;Deleavey等2〇12}〇
[0008] 变应性疾病的特征在于人免疫系统对食用、吸入肺中、注射或接触到的外源蛋白 质物质（"变应原"）的过度反应。变态反应(allergy)具有遗传成分。如果父母亲中仅有一方 具有任意类型的变态反应，那么，每个孩子将具有变态反应的机会是1/3。如果父母双方都 具有变态反应，那么他们的孩子具有变态反应的可能性要大得多（7/10)。对于变态反应无 法治愈;然而，可以用正确的预防和治疗来管理它们。
[0009] 全世界大约有30 %的人患有变态反应症状，并且他们中有40-80 %具有眼部症状 {Key B.2001}。影响眼睛的变应性疾病或眼睛变态反应组成异质(heterogenic)疾病组，其 具有非常广谱的临床表现。眼睛变态反应通常在结膜(覆盖眼睛的膜和眼睑的内层)与变应 原反应时发生。眼睛变态反应可以独立发生或与其他变态反应症状(诸如鼻炎或哮喘)联合 发生。
[0010]基本和临床研究已经提供了对细胞、介质和眼睛变态反应中发生的免疫学事件的 更好的理解。眼睛，特别是结膜，具有相对多数量的肥大细胞。当存在变应原时，它们可以以 在这些肥大细胞表面上的FceRI受体结合免疫球蛋白IgE，并且引发它们的激活和变态反应 介质的释放(称为脱粒化(degranulation)的过程）。脱粒化将肥大细胞成分(包括组胺，前 列腺素，类胰蛋白酶和白三烯)释放到肥大细胞外的环境中。通过多种机制，这些成分产生 眼睛变态反应的迹象和症状。变应性炎症的肥大细胞的激活通常称为眼睛变态反应的急性 期反应或早期。急性期反应可以进展为晚期反应，其特征在于将炎症细胞招募到变应性炎 症部位，例如，作为进入结膜的嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞流入。
[0011] 眼睛变态反应代表变态反应学家和眼科医师遇到的最常见的病况之一。眼睛变态 反应通常与下述症状和迹象相关:结膜炎(conjunctivitis)，眼睑炎(blepharitis)，睑缘 结膜炎(1316口1^1'0(301^11111：；^；[1^8)或角膜结膜炎(1^瓜1：0(3011加11(31：；^；[1^8)。眼睛变红和发 痒，并且存在流泪和轻微的分泌物（slight discharge)。严重的病例还可能表现为眼睛烧 灼感、疼痛和畏光。
[0012] 影响眼睛的变应性疾病包括轻微形式，诸如季节性变应性结膜炎（seasonal allergic conjunctivitis，SAC)和常年性变应性结膜炎（perennial allergic con j unctivitis，PAC);以及更严重的表现，诸如春季角膜结膜炎（vernal keratoconjunctivitis，VKC);特应性角膜结膜炎(atopic keratoconjunctivitis，AKC)和 巨乳头状结膜炎(giant papillary conjunctivitis，GPC)。后者可以与诸如角膜损伤的并 发症相关，并且可以引起视力丧失。SAC和PAC是常见的IgE-肥大细胞介导的针对外源变应 原的超敏性反应;而AKC和VKC特征在于涉及数种免疫细胞类型的慢性炎症。SAC和PAC变应 原在抗原呈递细胞(APCs)的帮助下引发Th2_主导性免疫应答(Th2_predominant immune response)，其诱导B细胞释放IgE。变态反应应答的激活通常涉及肥大细胞的浸润和脱粒 化。
[0013] SAC是最常见的眼睛变应性疾病，通常由如空气传播的花粉、粉尘和动物毛肩引 起。迹象和症状通常在春季和夏季发生，并且通常在冬季月份减轻。结膜发痒、发红和肿胀 是最特征性的症状，还有流泪、烧灼感和畏光。在大部分情形中，SAC不严重。然而，由于其可 以影响患者的生活质量，并且可能具有严重的社会经济影响，其对于患者其可能是非常烦 扰的{Kari 0·和Saari KM 2010}。
[0014] PAC是第二常见的眼睛变应性疾病，通常由动物和螨虫引起。症状和迹象与SAC在 很大程度是相同的，不同在于患者变态反应的特定变应原和PAC可以一年到头地发生，暴露 于常年性的变应原。PAC影响所有年龄组，但是主要是两种性别的年轻人和中年人。另外， PAC通常与干眼综合征联系在一起。
[0015] SAC和PAC是最常见形式的眼睛变态反应。估计值变化，但是据说这些类型的变态 反应影响总人口的至少15-20 %。SAC和PAC通常被漏诊，并且因此未被治疗。在SAC和PAC中， 变应原诱导的IgE局部释放以Ca2+依赖性机制促进肥大细胞的脱粒化。IgE-激活的肥大细 胞释放预先形成的炎性介质，诸如组胺和白三烯4,它们是变应性反应的最先的介质。这些 介质吸引浸润到区域的嗜酸性粒细胞，扩大了变应性反应。
[0016] VKC是相对罕见的眼睛表面的慢性变应性炎症，其主要影响儿童和青少年。主要的 症状是发痒、发红、肿胀、流泪和畏光。最有特征性的迹象是上睑板部结膜中的巨乳头。
[0017] AKC是眼睛表面和眼睑的双侧慢性炎症疾病。最有特征的迹象是眼睑上的湿疹性 损伤，其是发痒的。对于AKC患者常见的是在幼小的年纪进行白内障手术{Kari 0.和Saari KM 2010}〇
[0018] GPC是以上睑板部结膜的乳头状肥大为特征的炎性疾病。GPC由惰性物质而不是变 应原引起。当去除这些刺激性的刺激物时，结膜乳头变化消退。在隐形眼镜表面上的蛋白沉 积可能变成变应性的，并且刺激IgE产生{La Rosa M.等2013}。
[0019] 目前用于眼睛变态反应的治疗包括非药理学和药理学策略。避免抗原是用于所有 类型的眼睛变态反应的主要行为修正。人工泪液替代品提供屏障功能，并且帮助改善在结 膜粘膜水平上的第一线防御。当非药理学策略不能提供充分的症状缓解时，可以使用药理 学治疗。
[0020] 管理眼睛变态反应的主要依靠包括使用抗变态反应治疗剂，诸如抗组胺，双重作 用或联合治疗以及肥大细胞稳定剂。局部用的抗组胺(诸如依美斯汀(Emedastine)和左卡 巴斯汀(Levocabastine))竞争性且可逆地阻断组胺受体，并且缓解发痒和发红，但是仅是 短时间的。抗组胺不影响其他的促炎症介质，它们保持被抑制。有限的作用持续时间使得必 须频繁给药，并且局部用抗组胺对眼睛可能是刺激性的，尤其是长期使用时。
[0021 ] 使用解充血药(诸如轻甲唑啉(oxymetazoline)，四氢唑啉（tetrahydrozoline)和 萘甲唑啉(naphazonline))联合抗组胺的联合治疗作为血管收缩药起作用，但是已知在滴 注时是刺痛或烧灼的。其他不利事件包括瞳孔扩大和反弹的充血，使得这些联合治疗更适 合短期缓解。另外，这些药物不被推荐用于患有狭角性青光眼(narrow-angle glaucoma)的 患者。肥大细胞稳定剂(诸如色甘酸盐(cromoglycate)，洛度沙胺（lodoxamide)，奈多罗米 (nedocromil))具有尚不清楚的作用机制。它们不缓解现有的症状，并且仅可以基于预防基 础使用，以预防肥大细胞在后续暴露于变应原时脱粒化。它们需要一个装载期（loading period)，在该期间，它们必须在抗原暴露之前使用{La Rosa Μ.等2013}。
[0022] 当上文提及的抗变态反应药物不允许对变应性炎症过程的充分控制时，使用抗炎 症药剂。皮质类固醇是用于眼睛变态反应的更严重的变型的最有效的药剂之一{La Rosa Μ.等2013}。然而，留体药物可能具有威胁患者的整体健康的副作用。长期施用皮质类固醇 可能通过抑制肠1丐吸收和抑制骨形成而导致药物诱导的骨质疏松症(osteoporosis)。由于 这些药物对身体代谢过程的影响，长期施用皮质类固醇的其他不利副作用包括高血压 (hypertension)，高血糖(hyperglycemia)，高脂血(hyperlipidemia)(增加水平的甘油三 酯）和高胆固醇血症(hypercholesterolemia)(增加水平的胆固醇）。还已知某些皮质类固 醇具有比该种类的其他化合物更大的升高眼内压ΓΙ0Ρ")的潜力。例如，已知泼尼松龙 (prednisolone)(其是一种非常有效的眼睛抗炎剂)具有比氟米龙(fluorometholone)(其 具有中等眼睛抗炎活性)更大的升高Ι0Ρ的趋势。还已知与皮质类固醇的局部眼科应用相关 的Ι0Ρ升高的危险随时间增加。换言之，这些药剂的长期使用（即，长时间的）增加显著的Ι0Ρ 升高的危险。因此，皮质类固醇可能不适合用于长期的眼睛变态反应治疗。另外，由于增加 的发展白内障和青光眼的危险，长期使用皮质类固醇是禁忌的{〇no SJ，和Abelson MB， 2005}〇
[0023] 变态反应的免疫疗法可用于减少针对变应原的反应，但是其在变应性结膜炎中的 作用还未得到证实。这种治疗的主要目的是诱导针对特定变应原的临床耐受性。该疗法以 递增的剂量皮下施用，以保持低于临床反应的阈值。认为舌下免疫疗法(SLIT)是皮下变态 反应免疫疗法的备选方案，并且在舌下口服，但是使用SLIT的长期结果还没有获得。使用这 种形式的疗法的大部分试验是用于变应性鼻炎(allergic rhinitis)。通常，针对变应原施 用的免疫反应不能预测疗法的功效，并且疗法本身可以产生系统性反应，其发生率和严重 性取决于施用的变应原的类型而不同{La Rosa M.等2013}。
[0024]另外，大部分较新的眼科抗变态反应药剂具有有限的作用持续时间，并且需要每 天两次给药。由于具有更久的作用持续时间的局部用制剂可以每天滴注一次，因此，其将是 有利的。因此，需要新的疗法，所述疗法可以在诸如功效和作用持续时间方面提供益处，同 时提供与传统眼科抗变态反应剂相似的安全模式。
[0025]已经指出基于RNA干扰的疗法具有满足变态反应治疗中未满足的需求的潜力 {Popescu FD.2005}。已经证明，在用变应原致敏的小鼠中系统施用⑶40siRNA能够通过抑 制树突细胞和B细胞功能并且产生调控T细胞而减轻鼻变态反应症状{Suzuki M.等2009}。 另外，通过使用⑶40-沉默的和变应原刺激的(allergen-pulsed)树突细胞还开发了用于变 应性鼻炎的基于siRNA的变应原特异性疗法{Suzuki Μ等2010}。
[0026]变应性反应的起始是始于变应原与肥大细胞的FceRI受体中的IgE分子的结合。Fc eRI的激活引起肥大细胞中的变化，这允许钙从胞外区室进入。Ca2+进入到肥大细胞中激活 磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K) 1I3K途径的激活包括激活磷酸肌醇依赖性激酶(PDK1)的激活， 其又将PI3K的下游靶标(诸如PKB/Akt，SGK和PKC)磷酸化。这些激酶负责钙通道的激活，从 而动员胞内钙存储并且激活肥大细胞脱粒化{Shumilina E，等2010}。
[0027] roKi也称为roPKi或roHKUDKi的结构可以分成两个结构域:激酶或催化结构域 和血小板-白细胞C激酶底物(Pleckstrin)同源性结构域(PH结构域hPH结构域是约120个 氨基酸的蛋白结构域，其存在于宽泛的参与胞内信号传导或作为细胞骨架成分的蛋白中。 激酶结构域具有三个配体结合位点:底物结合位点，ATP结合位点和停靠位点（也称为PIF 口 袋）1DK1是组成型活性的，并且发现其存在于细胞质和线粒体基质中。
[0028] EP1513947(MEDICAL RES⑶UNCIL)描述了选择或设计用于调节TOK1活性的化合 物的方法。
[0029] US2009/0275570(ASTRAZENECAAB)描述了用于治疗癌症的具有Η)Κ1抑制性活性的 化合物。
[0030] 发明概述
[0031] 本发明提供用于减少PDK1表达并且因此减轻眼睛变态反应中的眼睛炎症的改善 的产品。相对于传统抗变态反应治疗剂和变态反应免疫治疗药，使用siRNA产品治疗眼睛变 态反应的优点在于基于siRNA的治疗将具有持续更久的效果。该结果是由于这样的事实导 致的：一旦不再存在效应分子，则细胞将必须从头合成新的蛋白；而传统的治疗将使得所述 蛋白水平不受影响。
[0032] 在世界范围内，眼睛变态反应似乎增多。特别是在工业化国家中，普遍认为环境污 染是变应性个体增加的敏感性的主要贡献因素。除了恶化的排放污染，研究还指出空气传 播的变态反应原的全球增加。还有另一个考虑是较贫穷国家的居民不太可能为眼睛变态反 应寻求治疗，这是可能使不发达国家中报告的疾病发病率人为保持较低的因素。
[0033] 美国哮喘和变态反应基金会（Asthma and Allergy Foundation in America， AAFA)指出美国每年的变态反应花费估计为将近145亿美元。他们估计5000万美国人患有所 有类型的变态反应(5名美国人中有1人），包括室内/室外、食品和药物、胶乳、昆虫、皮肤和 眼睛变态反应。自从20世纪八十年代早期以来，美国变态反应流行性整体上增加，贯穿了所 有年龄、性别和种族。
[0034] 尽管具有地理独特性，但是来自全世界的医师发现了他们用于选择适当的治疗疗 程的标准的共同基础。按照来自数个国家的专家说法，这些标准包括功效、安全性和给药的 便利性以及对患者施用的舒适性。因此，随着全世界抱怨各种眼睛变态反应症状的患者人 数的增加，发现最佳的治疗每天都是更加复杂且更加有趣的。
[0035] 附图描述
[0036]图1:显示选择作为本发明的siRNAs的靶序列的靶基因序列PDK1的短片段。
[0037]图2:显示用于靶向本发明包括的PDK1的本发明的siRNA分子的寡核苷酸序列。该 附图中提供的SEQ ID NOs是指有义(5 ' ->3 '）链;典型地，siRNAs作为dsRNAs施用，因此将包 括有义链及其互补反义链二者。SEQIDN0.688-SEQIDN0.1374是分别靶向SEQIDN0.1-SEQ ID N0.687的siRNAs。通常，siRNA包含有义链和反义链，并且还可以包含3'二核苷酸突 出端(例如，dTdT)。然而，这不是必需的。
[0038] 图3:在人细胞系A204中转染靶向PDK1的siRNAs后的体外PDK1表达水平。
[0039] 图4:在鼠细胞系C2C12中转染靶向PDK1的siRNAs后的体外PDK1表达水平。
[0040]图5:转染SEQ ID N0.688后，不同细胞系的体外毒性。
[00411图6:转染SEQ ID N0.688后，人巨噬细胞HMC-1细胞中体外诱导的脱粒化作用。 [0042]图7:在用离子霉素（lonomycin)脱粒化的人巨噬细胞HMC-1细胞中转染SEQ ID NO. 688后的体外PDK1表达水平。
[0043]图8:体内测定的时间表。
[0044] 图9:在诱导眼睛变态反应后的不同时间在小鼠完整眼睛中的PDK ImRNA水平。
[0045] 图10:指示眼睛变态反应的眼睛临床迹象。在诱导眼睛变态反应后0.5,1，3,6和24 小时观察小鼠。通过以等级0-3分级下述参数来评估临床迹象：结膜水肿和充血 (conjunctival chemosis and in jection)，充血(hyperemia)，目艮险水月中（lid edema)，分 泌物和流泪。数据表示为在PBS处理组诱导变态反应后0.5小时的临床评分的百分数，并且 表示PBS处理组16只动物的平均值土 s. e.m和SEQ ID N0.688(SYL116021)处理组24只动物 的平均值土s.e.m。
[0046] 发明详述
[0047] 在第一方面，本发明涉及提供siRNA分子，其作为药物，优选用于治疗和/或预防以 增加的PDK1表达和/或活性为特征的眼病，其中所述分子特异性靶向选自由SEQIDN0.1-SEQ ID N0.687组成的组的序列，并且当引入到细胞中时减少PDK 1基因的表达。优选地，所 述靶序列选自由SEQIDN0.1-SEQIDN0.24组成的组，更优选地，由SEQIDN0.1-SEQID N0.6组成的组，并且甚至更优选地，所述靶序列包含SEQ ID NO. 1或由SEQ ID NO. 1组成。
[0048] 例如，当siRNA分子选择性减少或抑制基因的表达时，该基因被本发明所述的 siRNA"祀向"。短语"选择性减少或抑制"用在本文中包括影响一种基因（在这种情形中，是 PDK 1)的表达的siRNAs。备选地，当siRNA(的一条链）在严格条件下与基因转录物（即，其 mRNA)杂交时，所述siRNA靶向该基因。"在严格条件下"杂交意指在趋向于不利于杂交的标 准条件下，例如，高温和/或低盐含量，与靶标mRNA区域退火。适当的流程(包括0.1 X SSC，68 °C2小时）记述在Maniatis，T·等，Molecular Cloning: ALaboratory Manual(分子克隆：实 验室手册），Cold Spring Harbor Laboratory,1982,第387-389页中。
[0049] 除非另外指明，本文所引用的核酸序列以5'至3'方向书写。术语"核酸"是指DNA或 RNA或其修饰的形式，其包含在DNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤"A"，胞嘧啶"C"，鸟嘌 呤"G"，胸腺嘧啶"T"）或在RNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基（腺嘌呤"A"，胞嘧啶"C"，鸟嘌呤 "G"，尿嘧啶"U"）。例如，本文提供的干扰RNAs可以在3 '端包含"T"碱基，即使"T"碱基在RNA 中不是天然存在的。在一些情形中，这些碱基可以作为"dT"出现，以区分在核糖核苷酸链中 存在的脱氧核糖核苷酸。
[0050] 上文定义的靶序列记述为靶DNA序列，用于定义在用于设计siRNAs的目的的数据 库中的转录变体，而要用的特定的化合物将是按原样定义的RNA序列。
[0051 ]本领域专家可以通过公共数据库访问任意靶基因序列。例如，对应人roKlmRNA的 GenBank 登记号为 NM_001261816(Gene 10:5170)。对应小鼠？01(11111?熟的同源6611831^登记号 为NM_001080773(Gene ID: 18607)。此外，ENSEMBL(MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)具有下述PDK1人和小鼠登记号：分别为ENSG00000140992和 ENSMUSG00000024122。
[0052] 对应由交替剪接产生的三种roKl转录物的GenBank登记号为NP_001248745.1(登 记号：ΝΜ_001261816· 1，GI :387849238)，ΝΡ_002604· 1(登记号：NM_002613.4，GI: 387849236)，和NP_112558 · 2(登记号：NM_031268 · 5，GI: 387849237)。此外，ENSEMBL(MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)公布了10种另外的PDK1 公共转录物：
[0053] ENSP00000344220，ENSP00000455492，ENSP00000395357，ENSP00000268673， ENSP0000045 50 25，ENSP00000455684，ENSP0000037 3876，ENSP00000455 551， ENSP00000455438和ENSP00000346895。
[0054] 本发明鉴定的所述优选的靶标区域包含选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.687组成 的组的至少一种序列或由选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.687组成的组的至少一种序列组 成。
[0055] 在一个优选的实施方案中，所述优选的靶标区域包含选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.24组成的组的至少一种序列或由选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.24组成的组的至少一 种序列组成。在下述物种之间，SEQ ID NO. 1具有100%的同源性：智人(Homo sapiens)，小 家鼠（Musmusculus)，家犬（Canis lupus familiaris)和褐家鼠 （Rattus norvegicus) 〇在 下述物种之间，SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.6具有100%的同源性：智人，小家鼠，和家犬。 [0056]在另一个优选的实施方案中，所述优选的靶标区域包含选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.6组成的组的至少一种序列或由选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.6组成的组的至少 一种序列组成。
[0057]在RNAi领域中，当体外研究证明人siRNA不能诱导动物模型基因的敲减时，合成替 代化合物(动物活性的类似物），从而分析该s iRNA在相关动物模型中的功效。该替代物针对 人siRNA的相同区域设计，由此两种siRNAs除少数核苷酸外具有相同的序列，这取决于人和 兔靶基因之间的同源性。该方法已经广泛用于开发其他的寡核苷酸，特别是用于毒物学研 究{Kornbrust D.等.2013}。
[0058]在一个更优选的实施方案中，本发明所述优选的靶标区域包含SEQ ID N0.1(5'-CUAUCACAUGGUGUUUGAACU-3 '）或由其组成。
[0059]因此，本发明各个方面所述的siRNA优选地将包含双链RNA分子，其反义链将包含 基本上与选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.687组成的组的至少一种序列互补的RNA序列，并 且其有义链将包含与所述反义链互补的RNA序列，其中两条链通过核苷酸之间的标准碱基 配对而杂交。更优选地，本发明各个方面所述的siRNA优选地包含双链RNA分子，其反义链将 包含基本上与选自由SEQIDN0.1-SEQIDN0.6组成（并且甚至更优选地由SEQIDN0.1组 成）的组的(序列)互补的RNA序列。
[0060] 在本发明的意思内，与靶标mRNA序列"基本上互补"也可以理解为与所述靶序列 "基本上相同"。如本领域普通技术人员已知的，"同一性"是通过匹配序列之间的核苷酸的 顺序和相同性所确定的核苷酸序列之间的序列相关性的程度。在一个实施方案中，与靶标 mRNA序列具有85% ,86% ,87% ,88% ,89% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97%， 98 %或99 %互补性的siRNA的反义链被认为是基本上互补的，并且可以用于本发明。互补性 百分数描述在第一核酸分子中可以与第二核酸分子中一组连续的核苷酸在沃森-克里克意 义(Watson-Crick sense)上碱基配对的连续的核苷酸的百分数。在一个优选的实施方案 中，反义siRNA链与靶标mRNA序列100%互补，并且有义链与siRNA双链部分的反义链100% 互补。siRNA还可以包含未配对的突出端，例如，3 '二核苷酸突出端，优选是dTdT。
[0061] 在一个优选的实施方案中，本发明鉴定的所述眼病是眼睛变态反应和/或眼睛结 膜炎。更优选地，所述眼病选自季节性变应性结膜炎，常年性变应性结膜炎，春季角膜结膜 炎，特应性角膜结膜炎，巨乳头状结膜炎，干眼综合征和它们的组合。
[0062]如从现有技术中已知的，已经提议了多种不同的结构来实现RNA干扰。一般地，这 些双链分子在长度上约为19至约25个核苷酸，并且包括平端结构以及具有突出端的那些。 已经记载突出端是有利的，并且可以存在于每条链的5'端或3'端，原因在于它们减少被RNA 酶的识别并且模拟切酶的天然底物。一些作者推荐在分子的两个3'端包含突出端，而其他 人认为一个突出端是足够的。其他人已经描述了使用具有特定的修饰模式的平端结构(EP 1527176,W0 2005/062937,W0 2008/104978,ΕΡ 2322617,ΕΡ 2348133,US 2013/0130377, 以及许多其他的）。
[0063]突出端可以由1-5个核苷酸构成;典型地，突出端由二核苷酸组成。本领域中所用 的经典的分子包含19个核苷酸的双链分子，其进一步包含3 '二核苷酸突出端，优选地包含 脱氧核苷酸，如Tuschl的最初的研究所教导的(W002/44321)。这些突出端被认为进一步增 加对核酸酶(RNA酶)降解的耐受性。后来，Kim等2005记述了21-mer产物(含有二核苷酸突出 端)是装载到RISC上所必需的。此外，Bramsen等2009记述了向突出端引入可能的去稳定化 修饰以进一步增加沉默效率。
[0064]由此，本发明的各个方面的优选实施方案是指包含至少一个突出端的靶向选自由 SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.687组成的组的至少一种序列的siRNA分子。更优选地，所述siRNA 分子靶向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.6组成（甚至更优选地由SEQ ID NO. 1组成）的组 的至少一种序列。当本发明涉及靶向选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.687的至少一种序列的 siRNA分子时，所述siRNA将包含与靶标相等长度且互补的反义链和与反义链相等长度且互 补的有义链。反义链和有义链可以进一步包含不与另一条链或靶标互补和/或在siRNA的双 链部分不配对的另外的碱基。例如，SEQ ID NO 1是19个核苷酸的序列；siRNA可以包含关于 该序列同一性部分的19bp的双链区和二核苷酸突出端。
[0065] 本发明各个方面的优选实施方案是指靶向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.687组 成的组的至少一种序列的siRNA分子，其中所述双链siRNA分子的每条链为约18至约28个或 更多个(例如，约18，19,20,21，22,23,24,25,26,27,或28个或更多个)核苷酸长。
[0066] 本发明各个方面的另一个优选实施方案是指包含选自由SEQ ID NO.688-SEQ ID NO. 1374组成的组的核苷酸序列的18-28个核苷酸长或更长的siRNA分子。更优选地，所述双 链siRNA分子为至少19个核苷酸长，并且选自由SEQ ID NO.688-SEQ ID N0.1374组成的组。 [0067]本发明的各个方面的另一个备选的实施方案提供平端分子。
[0068]此外，本发明的优选实施方案涉及包含或由靶向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 687组成的组的至少一种序列的19个核苷酸的双链结构组成的siRNA。更优选地，所述 siRNA包含或由靶向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.6组成的组的至少一种序列的19个核 苷酸的双链结构组成，并且甚至更优选地由SEQ ID NO. 1组成。
[0069] 本发明的具体的实施方案涉及靶向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.687组成的组 的至少一种序列的19个核苷酸的双链平端siRNA。更优选地，所述siRNA靶向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.6(并且甚至更优选地由SEQ ID NO. 1组成）的组的至少一种序列。在另一 个具体的实施方案中，该化合物包含或由选自由SEQ ID NO.688-SEQ ID N0.1374组成的组 的至少一种序列组成。在另一个优选实施方案中，该siRNA的反义链与选自由SEQ ID NO.688-SEQ ID NO. 1374组成的组的至少一种序列至少80%、优选至少90%互补。
[0070] 在一个优选的实施方案中，该化合物包含或由选自由SEQ ID NO.688-SEQ ID NO. 693组成的组的至少一种序列组成。
[0071] 在更优选的实施方案中，该化合物包含或由SEQIDN0.688 ( 5'-AUGCGUACCCCACUUUCXU-3 '）组成，其对应于我们命名为SYL116021的参比化合物的有义链。 [0072]此外，如称为本领域背景的部分中所述，关于siRNA分子的重要的问题是由于RNA 酶的普遍存在的性质导致其在生物流体中的不稳定性。由此，为增强化合物稳定性的目的， 已经记述了对核苷酸的多种不同的化学修饰的应用。
[0073] siRNA分子的另一种固有的问题是其免疫原性，由此已经发现siRNAs诱导先天性 免疫系统的非特异性的激活，包括某些细胞因子的上调，例如，I型和/或II型干扰素以及 IL-12、IL-6和/或TNF-α的产生。认为这些作用的起源是siRNA对Toll样受体(如TLR7、TLR8 和/或TLR3)的激活。
[0074]这些作用，即被RNA酶识别和免疫原性，二者都已经被记述为是序列依赖性的。
[0075] 通过减少对RNA酶的敏感性而增强化合物稳定性的一些化学修饰还能够减少后续 应答的免疫识别的诱导。然而，在siRNA中插入化学修饰的核苷酸还可能导致减少的沉默功 效，如在前部分中所述，并且因此必须仔细考虑。
[0076] 由此，在本发明的各个方面的优选的实施方案中，siRNA进一步包含至少一个具有 化学修饰的核苷酸。
[0077]增强稳定性并且减少免疫原性作用的优选的化学修饰包括2'-0_甲基核苷酸，2'-氟核苷酸，2 氨基核苷酸，2 脱氧核苷酸，或含有2 ' -0或4 ' -C亚甲基键的核苷酸。用于核 酸外切酶保护的其他优选的化学修饰包括ExoEndoLight(EEL):将有义链中的所有嘧啶修 饰为2 ' -0-甲基残基，并且修饰反义链中5 ' -UA-3 '或5 ' -CA-3 '基序中所有的嘧啶。另外，有 义链的位置1也可以变成2'-0_甲基，防止有义链的5'-磷酸化，并且因此通过进一步使有义 链失活而增加 siRNA的特异性。另外，有义链还可以包含在位置14的2'-0_修饰，原因在于在 该位置的2'-0_Me进一步使有义链失活，并且因此增加 siRNAs的特异性。用于核酸外切酶保 护的其他优选的化学修饰包括甲基-氟(MEF):在有义链上以2'-F起始(5'_端)和在反义链 上以2'-Ο-Me起始的交替2'-氟和2'-0-甲基修饰的外保护(exo-protection)。另外，有义链 的位置1还可以变为2'-0-Me，并且反义链的位置1变为2'-F(由于这可以有效地被5'-磷酸 化）。此外，通过引入硫代磷酸酯修饰的核苷酸能够修饰连接相邻的核苷酸的核糖核苷酸骨 架。在本发明的意思内的更优选的化学修饰涉及用脱氧胸腺嘧啶核苷(脱氧核糖核苷酸)替 代尿嘧啶核糖核苷酸。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述至少一个化学修饰的核 苷酸是在siRNA的有义链上、在反义链上或在两条链上。
[0078]上述s iRNA分子可以使用本领域已知的方法以其天然结构递送至细胞内部。例如， 当研究体外基因沉默时，使用标准转染试剂施用这些化合物。为了获得体内效果，这些化合 物可以裸露施用，或者使用递送增强剂，如例如脂质体，与特定的结构部分缀合等进行施 用，尽管本领域中已知多种不同的备选方案，并且取决于体内的所需要的靶向位点而不同 地使用。
[0079 ] 备选地，本发明各个方面的s iRNA分子可以由真核启动子在细胞中表达。能够表达 s iRNA分子的重组载体可以被递送至靶细胞中并且在靶细胞中永久存在。备选地，可以使用 提供核酸分子的瞬时表达的载体。需要时，所述载体可以重复施用。一旦被表达，所述siRNA 分子与祀标mRNA相互作用，并且产生RNA干扰反应。以这种方式产生的siRNA分子通常称为 shRNA(短发夹RNA)，原因在于其有义链和反义链通过小的核苷酸环连接在一起。表达siRNA 分子的载体的递送可以是系统性的，诸如通过静脉内或肌内施用，通过施用至来自受试者 的外植体的靶细胞然后重新引入到所述受试者中，或者通过允许引入到所需要的靶细胞中 的任何其他的方式。
[0080] 本发明的另一方面涉及靶向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.687组成的组的至少 一种序列的siRNA在制备用于治疗特征在于增加的PDK1表达和/或活性的眼病的方法中的 药物中的应用。更优选地，所述至少一种序列选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.6组成的组， 并且甚至更优选地所述至少一种序列由SEQ ID NO. 1组成。所述方法包括抑制患者中的 TOK1的表达。术语抑制用来表示表达或活性的下降或下调。优选地，所述眼病是眼睛变态反 应和/或结膜炎。在一个实施方案中，所述眼病选自包括下述的组:季节性变应性结膜炎，常 年性变应性结膜炎，春季角膜结膜炎，特应性角膜结膜炎，巨乳头状结膜炎，干眼综合征以 及它们的组合。
[0081] 还提供治疗以增加的PDK1表达和/活性为特征的眼病的方法。所述方法包括抑制 患者中的roKl的表达。所述方法可以包括施用靶向选自由SEQIDN0.1-SEQIDN0.687组 成的组的至少一种序列的siRNA。更优选地，所述至少一种序列选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.6组成的组，并且甚至更优选地，所述至少一种序列由SEQ ID NO. 1组成。
[0082] 在一些国家中，慢性变应性结膜炎和干眼综合征的组合是相当普遍的。增加的干 眼问题是由于常见的人工气候、室内和室外污染物和其他未知的原因导致。患有干眼综合 征的患者更倾向于患有眼睛变态反应，原因在于泪液膜是防止变应原与肥大细胞接触的重 要屏障。
[0083] 预测使用针对roKlmRNA的siRNAs的治疗性治疗比小分子局部滴眼剂有益，其通过 增加所观察到的作用的时间的长度，由此允许较不频繁的给药和更大的患者依从性。在诸 如眼睛变态反应的情形中，包括但不限于春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎和巨乳头状 结膜炎，由于它们通常是慢性病症，这是特别重要的。另外，基于siRNA的治疗允许使用所谓 的"不能用药的靶标"（诸如胞内蛋白，如PDK1)作为治疗性靶标。
[0084] 记得所述药物的制备，可以将本发明各个方面的siRNA配制为药物组合物。优选 地，所述siRNAs的组合物和制剂可以局部施用至目的器官。在甚至更优选的实施方案中，它 们可以配制用于局部施用至眼睛，优选地施用至眼睛的角膜表面。例如，应用至角膜表面可 以以滴眼液、凝胶剂、洗液、乳膏或眼部插入物的形式进行。对眼睛的其他施用形式可以包 括注射到眼睛中。
[0085] 本发明各个方面的更优选的实施方案涉及前述段落中所述的特异性靶向选自由 SEQ ID NO: 1-SEQ ID N0.687组成的组的至少一种序列的siRNA，其用作用于治疗以增加的 PDK1的表达和/或活性为特征的眼病的药物。更优选地，所述至少一种序列选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.6组成的组，并且甚至更优选地，所述至少一种序列由SEQ ID NO. 1组成。 如前文所述，其可以是包含或由靶向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.687组成的组的至少 一种序列的19个核苷酸双链结构组成的siRNA。该siRNA可以是平端的。优选地，所述siRNA 包含或由选自由SEQ ID NO.688-SEQ ID NO. 1374组成的组的至少一种序列组成。
[0086] 在本发明的上下文中，为了"特异性靶向"某种序列，本发明的siRNA优选地包含至 少相同的种子序列。因此，本发明所述的特异性靶向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.687组 成的组的至少一种序列的任意序列优选地在反义链的位置2-8是相同的。更优选地，所述至 少一种序列选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.6组成的组，并且甚至更优选地，所述至少一种 序列由SEQ ID N0.1组成。
[0087]尽管如上文所述，本发明各个方面的siRNAs可以用于沉默眼部之外的组织中的 PDK1表达。由此，所述s iRNAs应该被相应地配制。
[0088] 例如，siRNA分子可以包含递送载体(delivery vehicle)，包括脂质体，用于施用 给受试者。载体和稀释剂及其盐可以存在于药用制剂中。核酸分子可以通过本领域技术人 员已知的多种方法施用至细胞中，所述方法包括，但不限于，包封在脂质体中，通过离子电 渗法，或通过结合在其他载体中，如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精聚(乳酸-共-乙醇 酸）(PLGA)和PLCA微球体、可生物降解的纳米胶囊以及生物粘附性微球体，或通过蛋白质样 载体进行。在本发明的一个实施方案中，所述siRNA分子可以通过细胞特异性siRNA载体递 送，所述细胞特异性siRNA载体组合了乙型肝炎病毒的成分和脂质体。在另一个实施方案 中，本发明的核酸分子还可以与聚乙烯亚胺及其衍生物一起配制或与聚乙烯亚胺及其衍生 物复合，所述聚乙烯亚胺衍生物如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL) 或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-三GAL)衍生物。本发明的优选的组 合物是水溶液，特别是盐水溶液，如pH范围在约7.0-约7.4、优选pH为7.2+0.5的磷酸缓冲盐 水(PBS)。
[0089] 本发明的siRNA分子可以与膜分解剂和/或阳离子脂质或辅助脂质分子复合。
[0090] 可以用于本发明的递送系统包括，例如，水性和非水性凝胶、乳膏、复合型乳剂、微 乳剂、脂质体、油膏、水溶液和非水性溶液、洗液、气溶胶、经类基质和粉剂，并且可以包含赋 形剂(excipients)，如增溶剂、渗透促进剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸）、和 亲水聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮）。在一个实施方案中，药用载体是脂质体或 透皮增强剂。
[0091] 本发明的药物制剂以适于施用(例如，系统或局部施用)至细胞或受试者中的形式 存在，所述受试者包括，例如，人。适当的形式部分取决于应用或进入途径，例如，口服、经皮 或通过注射的途径。其他因素在本领域中是已知的，并且包括这样的考虑，如毒性和防止所 述组合物或制剂发挥其效果的形式。
[0092] 本发明还包括制备的用于存储或施用的组合物，其包含在药用载体或稀释剂中的 药物有效量的需要的化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域中是公知 的。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对-羟基苯 甲酸的酯。另外，还可以使用抗氧化剂和混悬剂。
[0093] 药物有效剂量是预防、抑制发生或治疗(在某种程度上减轻症状，优选地减轻所有 的症状)疾病状态所需要的剂量。药物有效剂量通常取决于疾病的类型、所用的组合物、施 用的途径、治疗的哺乳动物的类型、所考虑的具体的哺乳动物的体格特征、同时使用的药物 和医学领域技术人员所认识到的其他因素。
[0094] 治疗有效量还可以指足以延缓或最小化与眼睛变态反应相关的眼部病症的发作 的siRNA的量。治疗有效量还可以指在与眼睛变态反应相关的眼部病症的治疗或管理中提 供治疗益处的治疗剂的量。此外，关于本发明的siRNA的治疗有效量意指单独的治疗剂的 量，或与其他治疗剂组合的量，所述量在与眼睛变态反应相关的眼部病症的治疗或管理中 提供治疗益处。与本发明的siRNA的量联系使用，该术语可以包括改善整体治疗、减少或避 免不需要的作用或增强另一种治疗剂的功效或与另一种治疗剂协同作用的量。
[0095] 在诸如眼睛变态反应的眼部病症的治疗或管理中的治疗益处是变态反应症状的 持续减少。鉴于siRNA将降低PDK1在细胞内的水平，当治疗终止时，细胞必须重新合成新的 蛋白。由此，基于siRNA治疗的疗法将具有更持久的效果。这被认为是治疗功效的显著提高。
[0096] 使用siRNA的另外的益处是由其在系统循环中的存在所导致的副作用或急性毒性 问题的最小的可能性，而这些通常与不同的基于滴眼液的治疗相关。这是由于这样的事实： 当所述化合物进入血流中时，其将迅速地被存在于血液中RNA酶降解。
[0097] 另一方面，本文所述的制剂可以以在单剂量的小瓶中市售的事实意味着可以避免 向所述制剂中加入抗微生物防腐剂。防腐剂存在于现在的市场上的大部分制剂中。这些防 腐剂在一些患者中产生不耐受性，使得其需要停止治疗。当考虑到如同眼睛变态反应的病 症（包括但不限于，春季角膜结膜炎，特应性角膜结膜炎，巨乳头状结膜炎，毒性结膜炎 (toxic conjunctivitis)(或毒性滤泡性结膜炎(toxic follicular conjunctivitis))和 接触性变态反应(contact allergy))通常是慢性的，并且因此这样进行治疗时，这两个问 题是特别重要的。
[0098] -种优选的施用途径是局部施用，直接滴到眼睛中，优选地使用滴眼液进行。如上 文所述，预计使用针对PDKlmRNA的siRNAs的治疗性治疗比小分子局部眼用滴剂有益，其增 加所观察到的效果的时间持久性，由此允许较不频繁的给药和更大的患者依从性。
[0099] 然而，如前文所解释的，还可以使用除了直接给药到眼睛之外的给药途径。用于所 述制剂的精确的剂量和给药时间表也将取决于给药途径。技术人员应该理解，要用的精确 的剂量和给药时间表也取决于病症的严重性，并且应该按照执业者的判断和每名患者的情 形来决定。还理解用于任意具体的受试者的特定的剂量水平取决于多种因素，包括所用的 具体的化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径和排泄 率、药物组合和治疗中的特定疾病的严重性。
[0100]本发明的和本文所述的制剂或siRNA可以以单位剂量制剂进行给药，所述单位剂 量制剂包含常规无毒药用载体、辅药和/或赋形剂。制剂可以以适于口服应用的形式存在， 例如，作为片剂、药片、锭剂、水性或油性混悬液、分散的粉剂或颗粒剂、乳液、硬或软胶囊、 或糖浆或酏剂。旨在口服使用的组合物可以按照本领域已知的用于制备药物组合物的任何 方法进行制备，并且所述组合物可以包含一种或多种所述的增甜剂、调味剂、着色剂或防腐 剂，以提供制药学上别致且美味的制剂。片剂包含与适于制备片剂的无毒药用赋形剂混合 的活性成分。
[0101]例如，这些赋形剂可以是惰性稀释剂;诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸 钠;粒化剂和崩解剂，例如，玉米淀粉或海藻酸;结合剂，例如，淀粉、明胶或阿拉伯树胶;和 润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包衣的，或者其可以通过已知的技术 进行包衣。在一些情形中，所述包衣可以通过已知的技术制成，以延缓在胃肠道中的崩解和 吸收，并且由此提供在较长的时间期间内的持续作用。例如，可以使用时间延迟物质，如单 硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
[0102] 用于口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固体稀释 剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或作为软明胶胶囊存在，其中活性成分与水或油 介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
[0103] 水性混悬液包含与适于制备水性混悬液的赋形剂混合的活性物质。所述赋形剂是 混悬剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷 酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶;分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂(phosphatide)，例如， 卵磷脂，或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如，聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链 脂肪醇的缩合产物，例如，十七乙烯氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与来源于脂肪酸与己糖醇的偏 酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与来源于脂肪酸与己糖醇酐的偏 酯的缩合产物，例如，聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬液还可以包含一种或多种防 腐剂，例如，乙基-或正丙基-对羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一 种或多种增甜剂，如蔗糖或糖精。
[0104] 油性混悬液可以通过将活性成分混悬在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰 子油）中或在矿物油(如液体石蜡）中而配制。油性混悬液可以包含增稠剂，例如，蜂蜡、硬石 蜡或鲸蜡醇。可以加入增甜剂和调味剂以提供可食用的口服制剂。这些组合物可以通过加 入抗氧化剂如抗坏血酸进行保存。
[0105] 适于通过加入水来制备水性混悬液的分散的粉剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿 剂、混悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或润湿剂或混悬剂例如上 文已经提及的那些。也可以存在另外的赋形剂，例如，增甜剂、调味剂和着色剂。
[0106] 本发明的药物组合物还可以以水包油乳液的形式存在。油相可以是植物油或矿物 油或这些的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如，阿拉伯树胶或黄蓍树胶， 天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和来源于脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或偏酯，例如，失 水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇单 油酸酯。乳液还可以包含增甜剂和调味剂。
[0107] 糖浆和酏剂可以用增甜剂进行配制，所述增甜剂例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄 糖或蔗糖。所述制剂还可以包含缓和剂、防腐剂和调味剂和着色剂。本发明的和本文所述的 药物组合物或siRNA可以以无菌注射用水性或油脂性混悬液的形式存在。
[0108] 这种混悬液可以按照已知技术使用上文已经提及的那些适当的分散剂或润湿剂 和混悬剂来配制。
[0109] 无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可用的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或 混悬液，例如，作为在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的赋形剂和溶剂是水、 Ringed s溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发的油常用作溶剂或混悬介质。为了这一 目的，可以使用任意温和的不挥发的油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸，如 油酸，也用于制备注射剂。
[0110] 在优选的实施方案中，本发明的组合物配制在溶液中，优选地配制在缓冲的盐水 溶液中，如PBS，或在用于局部给药到眼睛的凝胶中，如例如，以滴眼剂的形式。在此类实施 方案中，所述制剂可以是阳离子乳液和/或包含生物聚合物，包括，但不限于，聚（丙交酯-共-乙交酯），卡波普、透明质酸和聚丙烯酸。
[0111] 本发明的核酸分子还可以以栓剂的形式给药，例如，用于药物的直肠给药。这些组 合物可以通过将药物与适当的无刺激性赋形剂混合而制备，所述赋形剂在常温是固体的但 是在直肠温度是液体的，并且因此在直肠中熔融以释放药物。此类物质包括可可脂和聚乙 二醇。
[0112] 本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠胃外给药。取决于所用的赋形剂和浓度， 药物可以混悬或溶解在赋形剂中。有利地，辅药，如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂，可以溶解 在赋形剂中。
[0113] 由此，本发明的进一步优选的实施方案涉及药物组合物，其中所述组合物包含靶 向选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.687组成的组的至少一种序列的至少一种siRNA，如在前 述段落中所述。更优选地，所述至少一种序列选自由SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.6组成的组， 并且甚至更优选地，所述至少一种序列由SEQ ID NO. 1组成。
[0114] 本发明的核酸分子还可以与其他治疗性化合物组合施用给受试者，以增加整体治 疗效果。使用多种化合物来治疗适应证可以增加有益的效果同时减少副作用的存在。
[0115] 当用于本文时，术语"眼睛变态反应"是指由增加的PDK1表达和/或活性引起的眼 睛表面的变态反应病症。其也可以称为变应性结膜炎。眼睛变态反应包括宽泛种类的病理 病况，包括但不限于:季节性变应性结膜炎(SAC)，常年性变应性结膜炎(PAC)，春季角膜结 膜炎(VKC)，特应性角膜结膜炎(AKC)，和巨乳头状结膜炎(GPC)。
[0116] 当用于本文时，术语"结膜炎"是指结膜的炎症。在印度，其可以称为红眼或马德拉 斯眼(madras eye)。其通常是由于感染(通常是病毒性的，但有时是细菌性的）或变态反应 引起。
[0117] 眼睛变态反应的"临床症状"包括，但不限于，眼睛发痒，眼睛发红，眼睑肿胀，结膜 水肿，流泪和鼻炎，鼻塞，流鼻涕，鼻瘙痒和耳/腭瘙痒，和打喷嚏。优选地，本发明治疗或预 防至少两种临床症状，更优选地至少三种，甚至更优选地多于四种症状。
[0118] 术语"患者"用在本文中是指动物，包括哺乳动物，优选人。
[0119] 当用于本文时，术语"变态反应原"是指环境中能够引起速发型超敏反应 (immediate hypersensitivity)(变态反应)的任何抗原性物质。已知的变态反应原的列表 包括植物花粉、霉菌的孢子、动物毛肩、室内尘埃、食物、羽毛、染料、皂类、洗涤剂、化妆品、 塑料和药物。变态反应原可以通过吸入、吞入、接触或注射进入体内。空气传播的变态反应 原是足够轻足以被气流运送的变态反应原，例如，但不限于，花粉或孢子。
[0120] 术语"变应性结膜炎"在本发明中应该理解为由变态反应反应引起的结膜的炎症。 结膜是覆盖眼睛的薄膜。当变态反应原刺激结膜时，眼睛中发生的常见症状包括:发红(主 要是由于周围小血管的舒张导致），眼睛发痒，眼睑水肿，增加的流泪，畏光，水样分泌物，和 异物感(带有疼痛）。症状通常在天气温暖干燥时对患者加重，而凉爽的温度和下雨倾向于 缓和症状。
[0121] 术语"眼睑炎"在本发明中应该理解为慢性眼睑炎症。
[0122] 术语"睑缘结膜炎"在本发明中应该理解为两种独立的眼病的同时发生:眼睑炎和 结膜炎。眼睑炎影响外眼睑，而结膜炎发生在结膜中。
[0123] 术语"角膜结膜炎"在本发明中应该理解为角膜和结膜的炎症。
[0124] 在下述非限制性实施例中将进一步描述本发明。 实施例
[0125] 0.材料
[0126] ?小鼠 PDK1 探针：Taqman 基因表达测定 Mm00554306_ml。
[0127] · 18S内源性对照:Taqman基因表达测定。Hs99999901_sl。
[0128] · Multiscribe反转录酶50U/ml(Applied Biosystems P/N 4311235)。
[0129] · RNA酶抑制剂20UAU(Applied Biosystems P/N N8080119)。
[0130] · TaqMan 2X通用主混合物。
[0131] ?非放射性细胞增殖测定试剂盒(？1'01116〖3，]\&11111116；[111，德国）。
[0132] ?人肥大细胞(HMC-1)。
[0133] ?在DMS0中的离子霉素（Ionomycin)|丐盐ImM(购自 Sigma Life Science Ref# 13909-lml)。
[0134] ?膜联蛋白-V检测试剂盒Life Technologies(Ref :V13241)。
[0135] 1.体外分析
[0136] 1.1在不同细胞系中转染本发明的siRNAs后的PDK1表达水平
[0137] 为了证明本发明的s i RNAs的沉默作用，在不同细胞系中转染本发明选择的s i RNAs 之后，测量体外Η)Κ1表达水平。分别使用Transit ΤΚ0和Lipofectamine 2000作为转染剂， 将人A204和鼠 C2C12细胞转染以100nMSEQIDN0.688和SEQIDN0.692(均为19bp的平端 dsRNA结构）。所有的转染按照标准的供应商使用说明进行。在同一转染中，使用杂乱的 (scramblecOsiRNA序列作为干扰特异性的对照。在转染实验后24、48和72小时收集细胞沉 淀物，并且处理，以评估由于siRNA作用机制导致的可能的mRNA水平变化。RNA水平通过实时 PCR、利用相对定量方法（即比较阈值2-Δ Δ CT法)进行定量{Livak和Schmittgen，2001}。 所有的实时定量PCR实验一式三份进行，并且以三次独立的实验进行重复。计算平均值和标 准偏差。如图3所示，SEQIDN0.688显著地在A204细胞中降低roKlmRNA水平约50%，并且在 C2C12细胞中降低roKlmRNA水平70%。对于SEQ ID N0.688，roKlmRNA水平在72小时没有完 全恢复（图3KSEQ ID勵.692还降低六204细胞(50%)和02(：12细胞(40-50%)二者中的？01(1 基因表达水平。对于SEQ ID N0.692，PDK1基因表达水平在72小时完全恢复（图4)。
[0138] 1.2在转染本发明的siRNA后不同细胞系的细胞存活性
[0139] 为了证明本发明的siRNAs的细胞存活性，在不同细胞系中转染本发明的特定 siRNAs后，测量体外毒性水平。分别使用Transit ΤΚ0和Lipofectamine 2000作为转染剂， 将人A204和鼠 C2C12细胞和J744A.1细胞转染以100nM SEQ ID N0.688(19bp的平端dsRNA结 构）。所有的转染按照标准的供应商使用说明进行。在同一转染中，使用杂乱的siRNA序列作 为干扰特异性的对照。在转染实验后24、48和72小时收集细胞沉淀物，并且处理，以评估由 于siRNA转染导致的可能的细胞存活水平的变化。细胞存活性使用购自Promega的 CellTiter 96?水性非放射性细胞增殖测定测量。该方法是基于活细胞(脱氢酶)将MTS四 唑化合物还原为甲騰产物的能力，其通过490nm的吸光度测量。计算平均值和标准偏差。如 图5所示，对于SEQ ID N0.688,与对照和杂乱的siRNA相比，没有发现细胞存活水平siRNA的 变化。SEQ ID N0.688无毒，并且是安全的。1.3在转染本发明的siRNA后，在人巨噬细胞HMC-1细胞中诱导的脱粒化
[0140] 脱粒化测定的目的是通过转染本发明的siRNA，特别是SEQ ID N0.688(19bp的平 端dsRNA结构)敲减PDK1的表达，以评价作为变应性反应指标的从人肥大细胞系(HMC-1)脱 粒化的速率。使用浓度为4μΜ的钙离子载体离子霉素 （I onomyc in)成功地诱导了脱粒化。使 用膜联蛋白-V结合法作为参数来评价脱粒化过程，如其在Demo与同事的工作（Demo等， 1999)中所述。使用SEQ ID N0.688的基因沉默实验表明在离子霉素(4μΜ)浓度下对转染SEQ ID Ν0.688的细胞表面上的膜联蛋白-V结合的强烈减少（约50 % )。这些结果表明，施用SEQ ID N0.688如何能够防止肥大细胞脱粒化（图6)。与脱粒化测定平行的，在转染实验后24小 时，通过实时PCR、使用相对定量法-比较阈值2-Δ ACT法{Livak和Schmittgen，2001}-确定 PDKlmRNA水平的检测。如图7所示，在人HMC-1肥大细胞中，观察到PDKlmRNA水平降低20%。 考虑这些结果，其证明了转染SEQ ID N0.688后roKlmRNA水平的降低能够防止人肥大细胞 脱粒化。
[0141] 2.体内分析
[0142] 这些实施例的目的是分析本发明设计来沉默PDK1的表达的siRNAs的功效。具体 地，分析具有SEQ ID NO.688( 19bp的平端dsRNA结构，SYL116021)的siRNA减轻豚草花粉诱 导的眼睛变态反应小鼠模型中与眼睛变态反应相关的症状。
[0143] 豚草是葵花家族菊科(Asteraceae)豚草属(Ambrosia)的开花植物。豚草花粉是高 度变应性的，通常认为是世界上所有空气传播的花粉的最大的气源性变态反应原和花粉热 (hay fever)的主要原因。国家环境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Science，NIE；HS)表明，膝草和其他的杂草，诸如皱叶酸模(curly dock)，藜（lambs quarters)，猪草（pigweed)，车前属（pi an tain)，酢衆草属（sheep sorrel)和蒿属（sagebrush)，是世界上最丰富的花粉变态反应原制造者中的一些。该花粉 通常用于研究变应性结膜炎的动物模型{Bacsi A等2005}。
[0144] 本分析的目的是确定通过眼部滴注本发明的化合物（具体是SEQ ID N0.688 (SYL116021))下调PDK1是否减轻小鼠中由豚草花粉诱导的眼睛变态反应引起的症状。
[0145] 我们已经分析了 TOK1是否在小鼠眼睛中表达，以及其表达是否响应豚草花粉诱导 的眼睛变态反应被上调。我们还已经评估了使用局部施用的SEQ ID N0.688(SYL116021)沉 默PDK1表达对上文提及的小鼠模型中的变应性反应的作用。为了这一目的，已经分析了下 述参数：
[0146] ·响应变态反应诱导的临床迹象:变应性结膜炎的典型眼部迹象包括发痒、眼睑 肿胀、结膜肿胀(结膜水肿）和粘液沉积。与眼睛变态反应相关的粘液是量多的、粘稠的，甚 至是粘性的。结膜的变化通常引起球结膜呈现"玻璃样"外观，并且睑结膜的颜色比红色更 粉色，通常具有乳白色外观。
[0147] ·局部肥大细胞的数目：在变应性刺激后数分钟，结膜肥大细胞脱粒化;炎性介质 的释放吸引更多的从结膜深层迀移的肥大细胞。
[0148] ·嗜酸性粒细胞的局部浸润:在变态反应原暴露后数小时，发生炎性细胞向结膜 的浸润，并且作为针对变态反应原的后期反应的一部分。尽管一些不同类型的细胞迀移到 结膜，主要类型还是嗜酸性粒细胞。
[0149] ?变态反应相关的分子生物标记的表达变化:
[0150] OPDK1:肥大细胞功能严格通过离子通道活性和一些信号传导途径的变化进行调 节。肥大细胞响应变应原的激活引起膜对离子渗透性的变化。Ca2+进入细胞激活磷脂酰肌 醇3激酶(PI3KKPI3K途径的激活包括磷酸肌醇-依赖性激酶(PDK1)的激活，其又使PI3K的 下游靶标磷酸化，所述下游靶标诸如PKB/Akt，SGK和PKC。这些激酶负责激活钙通道，以动员 胞内钙存储并且激活肥大细胞脱粒化{Shumi 1 ina E，等.2010}。
[0151] 2.1方法
[0152] A.动物和动物方法
[0153] 2.1.1测试系统表征
[0154] 表1.测试系统表征
[0156] 本发明的siRNAs的另一个优点是，在不同动物序列之间，SEQ ID N0.1-SEQ ID NO. 24对应PDK1基因的高度保守区域。事实上，这些序列在人和小鼠之间是相同的，这使得 该动物模型特别适合用于眼睛变态反应的研究。
[0157] 2.1.2变态反应的诱导
[0158] 通过在第1天腹膜内注射，用50yg豚草(Rw)花粉在0.25ml明矾中的混合物免疫动 物而诱导变应性结膜炎。在施用之前立即制备免疫溶液，并且在所有时刻避光。免疫后十 天，将1.25mg Rw花粉局部滴注到每只眼睛中。施用以5μ!7眼睛的剂量体积进行。该方法由 本领域专家已知的标准的已有的公开的流程修改而成，并且在评估siRNAs的功效之前进行 了验证{Magone M.T.等 1998}〇
[0159] 2.1.3测试项目施用
[0160] 从第6天开始，在5天的期间内，每天一次将测试项目通过局部眼睛途径应用到动 物的两只眼睛（图8)。一个独立组的动物施用赋形剂(PBS)并作为对照。施用以5μ!7眼睛的 剂量体积进行。
[0161] 2.1.4临床观察和样品收集
[0162] 从第一次施用直到处死，每天监测动物的一般健康状态。在滴注局部眼睛花粉之 前，以及在花粉滴注后直到24小时的不同时间点，检查小鼠的临床超敏迹象。结膜水肿和充 血、眼睑肿胀、分泌物和流泪按等级0-3分级。由对实验条件不知情的实验观察者进行临床 评分。在变态反应攻击后3或24小时处死动物。在处死后，分离眼睛并保存用于后续RNA。 2.1.5RNA分离和反转录
[0163] 使用RNeasy RNA提取试剂盒（1]1￥；[1：1'08611，04，1]54)从完整的眼睛、脾或淋巴结分 离总RNA。使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒（Applied Biosystems，Inc.，Foster (^7^，1^)，按照供应商的使用说明和11'-8-0003-01，将4以8的总1?熟反转录。
[0164] 2.1.6qPCR
[0165] 使用Stepone plus检测系统（Applied Biosystems)进行qPCR。在下述条件下：95 °C10min，然后是40个循环:95°C15s和60°Clmin，使用TaqMan 2X通用主混合物扩增500纳克 的每种样品。所有的PCR扩增一式三份进行，并且以至少两次独立的实验重复进行，总是包 括反转录对照和无模板对照。使用相对定量的A A CT法通过qPCR分析PDKlmRNA水平，其中 使用18S基因作为内标{Livak和Schmittgen，2001} 〇
[0166] 2.3 结果
[0167] 2.3.1小鼠眼中的PDK1表达和响应眼睛变态反应的诱导。
[0168] 在如方法部分所述诱导变态反应后的不同时间点评估小鼠眼睛中的TOK1表达。图 9显示TOK1存在于眼睛中，并且其响应变应性攻击随时间上调；在施用豚草花粉后3小时观 察到PDKlmRNA水平增加约1.3倍，和施用豚草花粉后24小时，增加1.7倍。
[0169] 2.3.2SEQ ID N0.688(SYL116021)在眼睛变态反应小鼠模型中的功效
[0170] 如方法部分所述，对两组动物腹膜内（IP)注射一定剂量的吸附在明矾上的豚草花 粉。IP注射后五天，一组(A，η = 16)在五天的期间每天接受PBS的眼部滴注，另一组(B，η = 24)在相同的时间期间内接受剂量为450yg/眼睛/天（低剂量）的SEQ ID NO.688 (SYL116021)。在眼部滴注花粉后0.5，1，3，6和24小时，检查动物与眼睛变态反应相关的症 状。如在图10中所示，使用SEQ ID N0.688(SYL116021)治疗显著减少变态反应的临床迹象。 特别有趣的是，在用SEQ ID N0.688(SYL116021)治疗的动物组中，在攻击后6小时没有观察 到临床迹象;这意味着SEQ ID N0.688(SYL116021)不仅能够减轻临床迹象的强度，而且能 够减少持续时间。临床迹象的进一步分析表明，SEQ ID N0.688(SYL116021)对眼睑浮肿、流 泪和眼睛分泌物具有特别有效的作用。
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【主权项】
1. 用作药物的SiRNA分子，其中所述分子特异性靶向选自由SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 687组成的组的至少一种序列。2. 根据权利要求1所述的SiRNA分子，其用于治疗和/或预防以增加的TOKl表达和/或活 性为特征的眼病。3. 根据权利要求2所述的SiRNA分子，其中所述眼病是眼睛变态反应和/或结膜炎。4. 根据权利要求2或3所述的SiRNA分子，其中所述眼病选自季节性变应性结膜炎、常年 性变应性结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、巨乳头状结膜炎、干眼综合征和它 们的组合。5. 根据前述权利要求中任一项所述的s iRNA分子，其中所述s iRNA包含19个核苷酸的双 链区域。6. 根据权利要求5所述的SiRNA分子，其中所述SiRNA是平端的。7. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA分子，其中所述siRNA包含选自由SEQ ID N0·688-SEQIDN0·1374组成的组的至少一种序列或由选自由SEQIDN0·688-SEQID NO. 1374组成的组的至少一种序列组成。8. -种siRNA分子，其中所述分子特异性靶向选自由SEQ ID NO. I-SEQ ID NO.687组成 的组的至少一种序列，并且在引入到细胞时减少TOKl基因的表达，并且其中所述siRNA包含 19个核苷酸的平端双链结构。9. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA分子，其中至少一个核苷酸包含化学修饰。10. 根据权利要求9所述的siRNA分子，其中核苷酸的所述化学修饰选自：2'-0甲基化和 用脱氧胸腺嘧啶核苷酸置换尿嘧啶核糖核苷酸，以及它们的组合。11. 根据权利要求9或10所述的s iRNA分子，其中所述化学修饰是在有义链上、反义链上 或在两者上。12. 根据前述权利要求中任一项所述的siRNA分子在制备用于治疗眼病的药物中的用 途，所述眼病的特征为增加的PDKl表达和/或活性。13. 根据权利要求12所述的用途，其中所述眼病是眼睛变态反应和/或结膜炎。14. 根据权利要求12或13所述的用途，其中所述眼病选自季节性变应性结膜炎、常年性 变应性结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、巨乳头状结膜炎、干眼综合征和它们 的组合。15. -种药物组合物，其中所述组合物至少包含权利要求1-11中所述的一种siRNA分 子。
【文档编号】A61K31/713GK105899662SQ201480058312
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月21日
【发明人】安娜·伊莎贝尔·希门尼斯, 库瓦东加·帕内达, 塔玛拉·马丁内斯
【申请人】西伦蒂斯私人股份公司