通过基于结构的探针切割实现的多路化核酸靶标鉴定的制作方法

通过基于结构的探针切割实现的多路化核酸靶标鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于核酸序列检测的新方法和组合物。通过聚合酶的5'?核酸酶活性在PCR过程中产生与靶核酸结合的、来自探针的独特的鉴定性切割片段。通过鉴定所述独特的切割片段，可以确定靶标的身份。
【专利说明】
通过基于结构的探针切割实现的多路化核酸靶标鉴定
技术领域
[0001] 本发明涉及核酸检测的领域。具体地，本发明提供了执行靶核酸的高通量多路检 测的方法。
【背景技术】
[0002] 许多用于检测靶核酸的方法是已知的。目前可获得的用于核酸检测的同质测定包 括TaqMan?、Ampliflour?、染料结合、等位基因选择性的动态PCR和Scorpion?引物测定。 由于需要不同染料用于待检测的每种靶核酸，这些测定操作不容易多路化，并且因此在其 改善潜力方面有限。为了克服这样的局限性，几项近期研究已公开了含有可切割的"标签" 部分的寡核苷酸探针的应用，所述"标签"部分可以容易地分离和检测（例如美国专利公开 号2005/0053939;美国专利号8,133，701)。但是，来自这些研究的结果表明，存在能够准确 地使检测标签与靶核酸关联的问题，并且仍需要执行靶核酸的高通量多路检测的准确方 法。
[0003] 发明概述 本发明提供了用于核酸序列检测的新方法。在该方法中，在PCR期间通过DNA聚合酶的 5'-核酸酶活性产生与扩增区内的靶核酸结合的、来自寡核苷酸探针的独特的鉴定性切割 片段。这通过具有附着至探针的5'末端的非互补"翼(flap)"区来实现。通过基于长度的分 离、基于电荷的分离或通过质量鉴定独特的切割片段，可以确定靶核酸的身份。例如，这可 以容易地通过质谱法来完成。由于极大数目的具有独特的且可容易分辨的质量的可能切割 片段，由此使得使用条形码探针和质谱法的核酸靶标的快速高通量多路检测成为可能。
[0004] 因此，在一个方面，本发明提供了检测靶核酸序列在样品中的存在或不存在的方 法，所述方法包括下述步骤： (a) 使包含靶核酸的样品与下述物质接触：（i) 一对寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸 引物包含与靶核酸序列的一条链中的一个区域互补的序列且引发第一延伸产物的合成，并 且其中第二寡核苷酸引物包含与所述第一延伸产物中的一个区域互补的序列且引发与所 述第一延伸产物互补的核酸链的合成，和(ii)寡核苷酸探针，其包含至少两个不同部分，第 一部分包含标准核苷酸，具有或不具有核苷酸类似物，所述第一部分包含与靶核酸序列的 一个区域至少部分互补的序列，其中所述第一部分在所述寡核苷酸引物所结合的靶核酸序 列内对合，并且其中所述第一部分在3 '端处被封闭以阻止通过核酸聚合酶进行的延伸;并 且附着至所述第一部分的5'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸 两者，且包含与靶核酸序列非互补的序列；其中所述第二部分与所述第一部分被非核苷酸 接头隔开，所述接头衍生自单个单元或被磷酸酯键隔开的多个单元，其中所述接头在所述 第一部分和所述第二部分的连接部处建立失稳区域； (b) 在特定条件下用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶扩增靶核酸序列，所述特定 条件允许所述寡核苷酸引物对和所述寡核苷酸探针与所述靶核酸序列对合以及从所述寡 核苷酸引物对合成引物延伸产物，同时所述核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性能够切割对合 的寡核苷酸探针并从其释放优势片段，所述优势片段包含所述寡核苷酸探针的第二部分、 所述非核苷酸接头和在所述寡核苷酸探针的第一部分的5 '末端处的单个核苷酸;和 (c)通过质谱法检测所述优势片段的存在或不存在，由此检测所述靶核酸序列在所述 样品中的存在或不存在。
[0005] 在某些实施方案中，在单个多路化反应中检测两种或更多种靶核酸。在某些实施 方案中，使用两种或更多种寡核苷酸探针在单个多路化反应中检测两种或更多种靶核酸。 在某些实施方案中，所述非核苷酸接头选自丙二醇、六甘醇(HEG)、三甘醇(TEG)、间隔物亚 磷酰胺9(Spacer Phosphoramidite 9)、间隔物C12 CE亚磷酰胺（Spacer C12 CE Phosphoramidite)和dSpacer CE亚磷酰胺（dSpacer CE Phosphoramidite)或它们的组合。 在某些实施方案中，所述非核苷酸接头选自丙二醇和HEG。在某些实施方案中，通过质谱仪 完成检测，所述质谱仪选自基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF) MS、串联MS、电 喷射电离-飞行时间(ESI-T0F)、ESI-离子阱、液相层析(LC)-MS)、气相层析(GC)-MS)和离子 迀移率(頂)-MS。在某些实施方案中，所述核酸聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。
[0006] 在另一个方面，本发明提供了一种包含寡核苷酸探针的组合物，其中所述寡核苷 酸探针包含至少两个不同部分，其中第一部分包含标准核苷酸，具有或不具有核苷酸类似 物，所述第一部分包含与靶核酸序列的一个区域至少部分互补的序列，使得所述第一部分 能够结合至所述靶核酸序列的该区域，且其中所述第一部分在3'端处被封闭以阻止DNA聚 合酶对所述寡核苷酸探针的延伸;并且附着至所述第一部分的5 '末端的第二部分包含核苷 酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，且包含与靶核酸序列非互补的序列；其中所述第 一部分和所述第二部分被非核苷酸接头隔开，所述接头衍生自单个单元或被磷酸酯键隔开 的多个单元，其中所述接头在所述寡核苷酸探针的所述第一部分和所述第二部分的连接部 处建立失稳区域。
[0007] 在某些实施方案中，在所述寡核苷酸探针的所述第一部分和所述第二部分的连接 部处的非核苷酸接头选自丙二醇、六甘醇（HEG)、三甘醇（TEG)、间隔物亚磷酰胺9 (Glen Research，目录号 10-1909-90)、间隔物C12 CE亚磷酰胺（Glen Research 目录号 10-1928-90)和dSpacer CE亚磷酰胺(Glen Research目录号10-1914-90)或多个单元或这些的组合。
【附图说明】
[0008] 图1描绘了本发明的方法的示例性描述。
[0009] 图2显示了在实施例1中描述的实验的质谱图。
【具体实施方式】
[0010] 定义 本文用的术语"样品"包括包含核酸的样本或培养物(例如，微生物培养物）。术语 "样品"还意图包括生物样品和环境样品。样品可以包括合成起源的样本。生物样品包括全 血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、洗出液(例如，支气管肺泡的、胃 的、腹膜的、管的、耳的、关节镜的洗出液）、活组织检查样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前 列腺液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、乳汁、乳房流体、胚胎细胞和胎儿细胞。在一个优选 的实施方案中，所述生物样品是血液，并且更优选地是血浆。本文中使用的术语"血液"包括 全血或任何血液级分，诸如如常规地定义的血清和血浆。血浆表示由用抗凝剂处理过的血 液的离心产生的全血级分。血清表示血液样品已经凝固后剩下的流体的水样部分。环境样 品包括环境材料诸如表面物质、土壤、水和工业样品，以及得自食物和乳制品加工器械、仪 器、设备、器皿、一次用弃的和非一次用弃的物品的样品。这些例子不应解释为限制可应用 于本发明的样品类型。
[0011]本文中使用的术语"靶标"或"靶核酸"意图指要检测或测量其存在、或者要研究其 功能、相互作用或特性的任何分子。因此，靶标包括用于它的可检测探针(例如，寡核苷酸探 针)或测定存在或可以由本领域技术人员生产的基本上任意的分子。例如，靶标可以是生物 分子，诸如核酸分子、多肽、脂质或碳水化合物，其能够与可检测探针(例如抗体)结合或以 其它方式发生接触，其中所述可检测探针还包含能够通过本发明的方法检测的核酸。本文 中使用的"可检测探针"表示能够与目标靶生物分子杂交或对合且允许如本文中所述的靶 生物分子的特异性检测的任何分子或试剂。在本发明的一个方面，所述靶标是核酸，且所述 可检测探针是寡核苷酸。术语"核酸"和"核酸分子"可以贯穿本公开内容互换使用。所述术 语表示寡核苷酸、寡物、多核苷酸、脱氧核糖核苷酸(DNA)、基因组DNA、线粒体DNA(mtDNA)、 互补DNA(cDNA)、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工 染色体(YAC)、扩增的核酸、扩增子、PCR产物及其它类型的扩增的核酸、RNA/DNA杂交体和聚 酰胺核酸(PNA)，所有这些可以呈单链或双链形式，并且除非另有限制，否则将包括天然核 苷酸的已知类似物，其可以以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用，及其组合和/或混合 物。因而，术语"核苷酸"表示天然存在的和经修饰的/非天然存在的核苷酸，包括三、二和单 磷酸核苷，以及在聚核酸或寡核苷酸内存在的单磷酸单体。核苷酸还可以是核糖核苷酸、 2'_脱氧核苷酸、2'，3'_脱氧核苷酸以及本领域众所周知的广泛多样的其它核苷酸模仿物。 模仿物包括链终止核苷酸，诸如3'-0_甲基、卤代碱基或糖取代；替代性的糖结构，包括非 糖、烷基环结构;替代性的碱基，包括肌苷;脱氮修饰的;接头修饰的X和Φ;质量标记修饰的； 磷酸二酯修饰或替换，包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼代磷酸酯、酰胺、酯、醚;和碱基或完 全核苷酸间替换，包括切割键诸如光可切割的硝基苯基部分。
[0012]可以定量地或定性地测量靶标的存在或不存在。靶标可以以多种不同形式出现， 包括例如简单或复杂混合物，或基本上纯化的形式。例如，靶标可以是含有其它组分的样品 的组成部分，或可以是样品的唯一或主要组分。因此，靶标可以是全细胞或组织的组分、细 胞或组织提取物、其分级分离的裂解物或基本上纯化的分子。另外，靶标可以具有已知的或 未知的序列或结构。
[0013]术语"扩增反应"表示用于增加革巴核酸序列的拷贝的任何体外方式。
[0014] "扩增"表示使溶液处于足以允许扩增的条件的步骤。扩增反应的组分可以包括、 但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语"扩增"通常表示靶核酸的 "指数"增加。但是，本文中使用的"扩增"还可以表示选定的靶核酸序列的数目的线性增加， 但是不同于一次性的、单引物延伸步骤。
[0015] "聚合酶链式反应"或"PCR"表示用于以等比数列扩增靶双链DNA的特定区段或子 序列的方法。PCR是本领域技术人员众所周知的；参见，例如，美国专利号4，683,195和4， 683,202;和 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis 等人编， 1990ο
[0016] 本文中使用的"寡核苷酸"表示通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或经修饰 的核苷单体的线性寡聚体。寡核苷酸包括能够特异性地结合靶核酸的脱氧核糖核苷、核糖 核苷、其端基异构形式、肽核酸(ΡΝΑ)等。通常，单体通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成 寡核苷酸，所述寡核苷酸的大小范围从几个单体单元(例如3-4个)至几十个单体单元(例如 40-60个）。每当寡核苷酸通过字母的序列诸如"ATGCCTG"表示时，应该理解，核苷酸从左到 右是5'-3'次序，并且除非另外指出，否则"Α"表示脱氧腺苷，"C"表示脱氧胞苷，"G"表示脱 氧鸟苷，"Τ"表示脱氧胸苷，并且"U"表示核糖核苷，尿苷。通常，寡核苷酸包含四种天然脱氧 核苷酸;但是，它们还可以包含核糖核苷或非天然核苷酸类似物。当酶由于活性具有特定寡 核苷酸或多核苷酸底物要求时，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，则关于寡核苷酸或多核苷 酸底物的适当组成的选择完全是在普通技术人员的知识内。
[0017] 本文中使用的"寡核苷酸引物"或简称"引物"表示这样的多核苷酸序列:其与靶核 酸模板上的序列杂交并且促进寡核苷酸探针的检测。在本发明的扩增实施方案中，寡核苷 酸引物充当核酸合成的起始点。在非扩增实施方案中，寡核苷酸引物可以用于建立能够被 切割试剂切割的结构。引物可以具有多种长度，并且通常是小于50个核苷酸的长度，例如 12-25个核苷酸的长度。可以基于本领域技术人员已知的原则来设计用于PCR中的引物的长 度和序列。
[0018] 本文中使用的术语"寡核苷酸探针"表示这样的多核苷酸序列：其能够与目标靶核 酸杂交或对合并且允许所述靶核酸的特异性检测。
[0019] "错配核苷酸"或"错配"表示在所述一个或多个位置处与靶序列不互补的核苷酸。 寡核苷酸探针可以具有至少一个错配，但还可以具有2、3、4、5、6或7个或更多个错配核苷 酸。
[0020] 本文中使用的术语"多态性"表示等位基因变体。多态性可以包括单核苷酸多态性 (SNP)以及简单序列长度多态性。多态性可以是由于与另一个等位基因相比在一个等位基 因处的一个或多个核苷酸置换，或可以是由于本领域已知的插入或缺失、复制、倒转及其它 改变。
[0021] 本文中使用的术语"质量可区分的大小"可以与"切割产物大小"、"降解产物大小" 或"探针片段大小"互换使用，并且表示如通过本文方法描述的由寡核苷酸探针的切割和释 放产生的一种优势降解产物的大小。具有质量可区分的大小(MDF)的片段可以包括、但不限 于寡核苷酸探针片段、核苷酸寡核苷酸探针片段、非核苷酸寡核苷酸探针片段、含有修饰标 签(例如疏水部分和亲和部分）以促进分离的寡核苷酸探针片段。产生具有独特的质量可区 分的大小的片段会导致显著改善的灵敏度，且允许增强执行多路反应的能力。
[0022] 本文中使用的术语"修饰"表示在分子水平（例如，碱基部分、糖部分或磷酸酯主 链)改变寡核苷酸探针。核苷修饰包括、但不限于引入切割阻断剂或裂解诱导物，引入小沟 结合剂，同位素富集，同位素耗尽，引入氘和卤素修饰。核苷修饰还可以包括增加杂交的严 谨性或增加寡核苷酸探针的解链温度的部分。例如，核苷酸分子可以用连接2'和4'碳的额 外桥进行修饰，从而产生对核酸酶切割具有抗性的锁核酸(LNA)核苷酸。
[0023]提及一种分子与另一种分子的结合的术语"特异性的"或"特异性"，诸如探针对靶 多核苷酸的特异性，表示两种分子之间的识别、接触和稳定复合物的形成，以及该分子与其 它分子的基本上更少的识别、接触或复合物形成。本文中使用的术语"对合"表示两种分子 之间的稳定复合物的形成。
[0024] 如果探针的至少一个区域与核酸序列的补体的至少一个区域共享实质序列同一 性，则所述探针"能够与核酸序列对合"。"实质序列同一性"是至少约80%、优选地至少约 85%、更优选地至少约90%、95%或99%、和最优选地100%的序列同一性。为了确定DNA序列和 RNA序列的序列同一性的目的，U和T通常视为相同核苷酸。例如，包含序列ATCAGC的探针能 够与包含序列GCUGAU的靶RNA序列杂交。
[0025] 本文中使用的术语"切割试剂"表示能够切割寡核苷酸探针以产生质量可区分的 大小的片段的任何方式，包括、但不限于酶。对于其中不发生扩增的方法，切割试剂可以仅 用于切割、降解或以其它方式释放寡核苷酸探针的第二部分或其片段。切割试剂可以是酶。 切割试剂可以是天然的、合成的、未经修饰的或经修饰的。
[0026] 对于其中发生扩增的方法，切割试剂优选地是具有合成(或聚合)活性和核酸酶活 性的酶。这样的酶通常为核酸扩增酶。核酸扩增酶的一个例子是核酸聚合酶，诸如水生栖热 菌(Thermus aquaticus) (Taq)DNA聚合酶(TaqMAN.RTM.)或大肠杆菌(E. coli)DNA聚合酶 I。所述酶可以是天然存在的、未经修饰的或经修饰的。
[0027] "核酸聚合酶"表示催化核苷酸向核酸内的掺入的酶。示例性的核酸聚合酶包括 DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒末端转移酶等。
[0028] "热稳定的DNA聚合酶"表示这样的DNA聚合酶：当遭受高温选定的时间段时，其为 稳定的（即抵抗分解或变性)且保持足够的催化活性。例如，当遭受高温使双链核酸变性所 需的时间时，热稳定的DNA聚合酶保留实现后续引物延伸反应的足够活性。核酸变性所需的 加热条件是本领域众所周知的，并且在美国专利号4,683，202和4,683,195中举例说明。本 文中使用的热稳定的聚合酶通常适用于温度循环反应诸如聚合酶链式反应（"PCR"）中。热 稳定的核酸聚合酶的例子包括水生栖热菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus)种Z05聚合 酶、黄栖热菌（Thermus flavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶诸如 TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
[0029] "经修饰的"聚合酶表示其中至少一个单体不同于参照序列的聚合酶，所述参照序 列是例如所述聚合酶的天然或野生型形式或所述聚合酶的另一种修饰形式。示例性修饰包 括单体插入、缺失和置换。经修饰的聚合酶还包括嵌合聚合酶，其具有衍生自两个或更多个 亲本的可鉴定的组分序列（例如，结构或功能结构域等）。在经修饰的聚合酶的定义内还包 括包含参照序列的化学修饰的那些。经修饰的聚合酶的例子包括G46E E678G CS5 DNA聚合 酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、 ΔΖ05聚合酶、AZ05-Gold聚合酶、AZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚 合酶、E678G TMA-30聚合酶等。
[0030] 术语"5 '至3 '核酸酶活性"或"5 ' -3 '核酸酶活性"表示通常与核酸链合成相关的核 酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5 '末端除去。例如，大肠杆菌DNA聚合酶I具有该活 性，而克列诺片段没有。一些具有5'至3'核酸酶活性的酶是5'至3'外切核酸酶。这样的5'至 3'外切核酸酶的例子包括:得自枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的外切核酸酶，得自脾的磷 酸二酯酶，λ外切核酸酶，得自酵母的外切核酸酶II，得自酵母的外切核酸酶V，和得自粗糙 链抱霉(Neurospora crassa)的外切核酸酶。
[0031]术语"优势片段"表示占所有片段的超过90%的片段，其可以通过任何给定的检测 方法来检测。
[0032]术语"丙二醇"或"丙二醇间隔物"表示1，3_丙二醇，并且与丙烷-1，3-二醇、1，3_二 羟基丙烷和亚丙基二醇同义。术语"HEG"或"HEG间隔物"表示六甘醇，其与3,6,9，12，15-五 氧杂十七烧-1，17-二醇同义。
[0033]本发明的多个方面基于核酸聚合酶的特殊性质。核酸聚合酶可以具有几种活性， 其中包括5'至3'核酸酶活性，由此核酸聚合酶可以从寡核苷酸切割单核苷酸或小寡核苷 酸，所述寡核苷酸与它的较大互补多核苷酸对合。为了使切割有效地发生，上游寡核苷酸还 必须与相同的较大多核苷酸对合。
[0034]利用5 '至3 '核酸酶活性的靶核酸的检测可以通过如以下文献所述的"TaqMan ? " 或"5~核酸酶测定"来执行:美国专利号5，210，015、5，487，972和5，804，375;和Hoi land等 人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280。在TaqMan? 测定中，在扩增区 内杂交的标记的检测探针在扩增反应期间存在。探针如此进行修饰，以阻止探针充当DNA合 成的引物。所述扩增使用具有5'至3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶执行。在扩增的每个合成 步骤期间，与来自待延伸引物下游的靶核酸杂交的任何探针通过DNA聚合酶的5'至3'外切 核酸酶活性降解。因而，新靶链的合成也导致探针的降解，并且降解产物的积累会提供靶序 列合成的量度。
[0035] 适合用于检测降解产物的任何方法均可用在5'核酸酶测定中。通常，检测探针用 两种荧光染料进行标记，其中之一能够淬灭另一种染料的荧光。所述染料附着至探针，通常 报道或检测染料附着至5'末端，且淬灭染料附着至内部位点，使得当探针处于非杂交状态 时，淬灭发生，并且使得通过DNA聚合酶的5 '至3 '外切核酸酶活性实现的探针切割发生在两 种染料之间。扩增导致染料之间的探针切割，伴随淬灭的消除和来自最初淬灭的染料的可 观察的荧光的增加。通过测量反应荧光的增加，监测降解产物的积累。美国专利号5,491， 063和5,571，673描述了用于检测与扩增伴随发生的探针降解的替代方法。
[0036] 用于检测靶核酸的5'核酸酶测定可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的任何聚 合酶。因此，在某些实施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是热稳定和热活性的核酸聚合 酶。这样的热稳定的聚合酶包括、但不限于来自真细菌属栖热菌属、热袍菌属(Thermatoga) 和栖热腔菌属(Thermosipho)的多个种的天然和重组形式的聚合酶以及其嵌合形式。例如， 可以用于本发明的方法中的栖热菌属种聚合酶包括水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、嗜热栖热 菌(Thermus thermophilus) (Tth)DNA聚合酶、栖热菌属种Z05(Z05)DNA聚合酶、栖热菌属种 spsl7(spsl7)和栖热菌属种 Z05(例如在美国专利号 5,405,774、5,352,600、5,079,352、4， 889，818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和 5,795,762中所述）。可以用于本发明的方法 中的热袍菌属聚合酶包括例如海栖热袍菌DNA聚合酶和新阿波罗栖热袍菌（Thermatoga neapoli tana) DNA聚合酶，而可以使用的栖热腔菌属聚合酶的一个例子是非洲栖热腔菌 (Thermosipho africanus)DNA聚合酶。海栖热袍菌和非洲栖热腔菌DNA聚合酶的序列公开 于国际专利公开号W0 92/06200中。新阿波罗栖热袍菌的序列可以在国际专利公开号W0 97/09451中找到。
[0037] 在5'核酸酶测定中，扩增检测通常与扩增同时发生（即，"实时"）。在某些实施方案 中，扩增检测是定量的，并且扩增检测是实时的。在某些实施方案中，扩增检测是定性的（例 如，靶核酸的存在或不存在的终点检测）。在某些实施方案中，扩增检测在扩增之后。在某些 实施方案中，扩增检测是定性的，并且扩增检测在扩增之后。
[0038] 在本发明中，来自寡核苷酸探针的降解产物的检测不涉及使用荧光报道染料和淬 灭染料，而是涉及具有两个不同部分的探针的合成。第一部分是与靶核酸至少部分互补的 互补部分，并且由标准核苷酸或核苷酸类似物组成，使得该部分能够与待检测的靶核酸结 合。此外，探针的该第一部分的3'末端是经修饰的或被封闭的，使得它不可被DNA聚合酶延 伸。第二部分是附着至第一部分的5'末端的非互补部分，并且形成不能与靶核酸结合的"5' 翼"区（参见图1)。该5'翼部分可以包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者。可以 存在于寡核苷酸探针的5'翼第二部分中的非核苷酸可以是任何有机部分或重复单元(例如 (CH2_CH2_0)n等）。
[0039] 寡核苷酸探针的第一部分和第二部分被非核苷酸接头隔开(参见图1)。该接头可 以包含碳、碳和氧、碳和氮、或这些的任意组合，且可以具有任意长度。此外，所述接头可以 包含线性部分或环状部分。所述接头可以衍生自单个单元或衍生自被磷酸酯键隔开的多个 相同或不同单元。接头的目的是在寡核苷酸探针的第一部分和第二部分的连接部处建立失 稳的铰链区，以便通过在连接所述寡核苷酸探针的第一部分的第一个和第二个核苷酸的磷 酸二酯键处的切割实现优势5'_核酸酶片段。因而，具有5'-核酸酶活性的酶对寡核苷酸探 针的切割会产生靶标特异性的、单一的"独特质量"片段，其由"5'_翼"区域（即寡核苷酸探 针的第二部分)与接头和来自寡核苷酸探针的靶标特异性的互补部分（即第一部分)的单个 核苷酸组成。适合用在本发明中的接头的例子包括丙二醇、六甘醇(HEG)、三甘醇(TEG)、间 隔物亚磷酰胺9 (Glen Research，目录号10-1909-90)、间隔物C12 CE亚磷酰胺（Glen Research 目录号 10-1928-90)和dSpacer CE亚磷酰胺（Glen Research 目录号 10-1914-90) 〇 接头可以是在单个单元中，在单一类型的分子的多个连续单元中，或在分子的组合的多个 连续单元中。
[0040] 如以前所述，用于给定靶核酸的寡核苷酸探针的5'-翼部分可以包含核苷酸、非核 苷酸或二者的组合，只要它具有使它与其它靶核酸的5'_翼不同且可区分开的独特质量大 小。大体而言，这可以允许来自单个反应的数百种靶核酸的多路检测。例如，仅使用标准核 苷酸A、G、C和T，由仅6个核苷酸组成的5'-翼可以产生84种可能的片段，都具有独特的质量 可区分的大小。另外，5'-翼部分可以连接用于促进片段的分离或纯化的修饰标签，诸如在 相分离层析中的荧光标签(参见例如，美国专利号5,859,247)或在生物素-抗生蛋白链菌素 亲和层析中的生物素标签。
[0041] 本发明提供了寡核苷酸引物和探针。不预期用于产生这些探针和引物的方法以任 何方式受到限制。本领域技术人员熟悉多种用于产生探针和引物的化学合成策略和试剂。 还不预期本发明的寡核苷酸探针限于天然存在的核苷酸结构或天然存在的碱基(例如，腺 嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）。除核酸中通常发现的天然存在的杂环碱基之 外，非天然核酸类似物也与本发明一起使用。
[0042] 非天然类似物包括具有非天然存在的杂环碱基或其它经修饰的碱基的那些。具体 地，许多非天然存在的碱基进一步描述在，例如，Seela等人（1991)，Helv. Chim. Acta 74: 1790，Grein等人（1994)，Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 971-976,和Seela等人 (1999)，Helv. Chim. Acta 82: 1640。为了进一步举例说明，任选地包括在核苷酸中使用 的充当解链温度(Tm)改性剂的某些碱基。例如，这些中的一些包括7-脱氮嘌呤(例如，7-脱 氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等）、吡唑并[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN (例如，丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等。参见，例如，美国专利号5，990，303。其它代表性的杂环碱基包括，例如，次黄嘌呤、 肌苷、黄嘌呤;2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的 8-氮杂衍生物;腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌 呤、肌苷和黄嘌呤的7-脱氮-8-氮杂衍生物;6-氮杂胞嘧啶;5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶;5-碘 胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶;5-碘尿嘧啶;5-溴尿嘧啶;5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶;5-乙炔基尿 嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-异戊烯基腺 嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2_二甲基鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲 基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧甲 基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(V)、怀丁 氧苷(wybutoxosine)、假尿啼啶、Q核苷、2硫代胞啼啶、5-甲基-2-硫尿啼啶、2-硫尿啼啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧 啶、（acp3)w、2,6-二氨基噪呤和5-丙炔基啼啶等。为了进一步举例说明，经修饰的寡核苷酸 的其它例子包括具有一个或多个锁核酸(LNA TM )单体的那些(包含LNA TM单体的寡核苷酸， 可得自例如LinkTechnologies，Ltd·，Lanarkshire，苏格兰；在来自ExiqonA/S，Vedbffi k，Denmark的许可证下）。诸如此类的核苷酸类似物也描述在例如美国专利号6，639，059、 美国专利号6，303，315和美国专利公开号2003/0092905中。
[0043]使用本领域已知的任何技术，可以制备寡核苷酸探针和引物。在某些实施方案中， 例如，使用任何核酸合成方法化学合成寡核苷酸探针和引物，所述方法包括例如根据 Beaucage和Caruthers (1981)，Tetrahedron Letts. 22(20): 1859 1862描述的固相亚 磷酰胺方法。为了进一步举例说明，还可以使用三酯法合成寡核苷酸(参见，例如，Capaldi 等人（2000)，"Highly efficient solid phase synthesis of oligonucleotide analogs containing phosphorodithioate linkages"，Nucleic Acids Res. 28(9): e40 ,和E1 drup等人（1994)，"Preparation of oligodeoxyribonucleoside phosphorodithioates by a triester method"，Nucleic Acids Res. 22(10): 1797-1804)。还可以利用本领域已知的其它合成技术，包括、例如，使用自动化的合成仪，如在 Needham VanDevanter等人（1984)，Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168中所述。多种用 于自动化寡核苷酸合成的设备是商购可得的。还任选地利用多核苷酸合成方案(例如，三_ 核苷酸合成等）。此外，引物核酸任选地包括各种修饰。在某些实施方案中，例如，引物包括 限制位点接头，例如以促进后续扩增子克隆等。为了进一步举例说明，引物还任选地经过修 饰以改善扩增反应的特异性，如例如美国专利号6,001，611中所述，且探针还可以用如本文 描述的或如本领域以其它方式已知的各种其它修饰进行合成。
[0044]在本发明的反应混合物、方法和其它方面中利用的探针可以具有核苷酸或非核苷 酸标签。这样的标签可以通过本领域已知的多种技术直接地或间接地附着至寡核苷酸。为 了举例说明，取决于使用的标签的类型，标签可以附着至末端(寡核苷酸引物和/或探针的 5'或3'末端)或非末端核苷酸，并且可以通过各种大小和组成的接头或间隔臂间接地附着。 使用商购可得的亚磷酰胺试剂，经由适当保护的亚磷酰胺，可以产生在5'或3'末端处含有 官能团（例如，硫醇或伯胺）的寡核苷酸，并且可以使用例如以下文献中所述的方案将标签 附着至这样的寡核苷酸：Innis等人（编）PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Elsevier Science & Technology Books (1990)(Innis)〇
[0045] 基本上任何核酸(标准的或非标准的，标记或未标记的）可以从多种商业来源中的 任一种定制或标准定购，诸如The Midland Certified Reagent Company (Midland, TX)、 Operon Technologies Inc. (Huntsville, AL)、Proligo LLC (Boulder, CO)及许多其它 公司。
[0046] 在使用质谱法检测PCR产物时，特别在用于检测大量靶核酸的多路场合中，存在许 多挑战。Beer等人(Analyst，2012，137: 5325-5333)描述了使用液相层析-电喷射电离质 谱法的多路PCR-基因分型测定，其用于检测来自14个基因的23种不同的SNP。来自这些SNP 位点的扩增子的长度是在从78 bp至130 bp的范围内。但是，已知的是，长扩增子不会较好 地离子化且难以通过质谱法分离。此外，由于A:T和G:C碱基对之间的小质量差异，双链PCR 产物可以使分析复杂化。因此，在PCR期间产生的短且独特的靶片段的应用将更易于检测， 导致更高的灵敏度，并且提供更好的成功多路化的机会。
[0047]几项最近的研究已经公开了含有可切割的"标签"部分的寡核苷酸探针的应用，所 述"标签"部分可以容易地分离和检测（例如美国专利公开号2005/0053939;美国专利号8， 133,701)。但是，由于"标签"分子的复杂性质（在美国专利公开号2005/0053939的情况下） 或给定靶核酸的多个片段的产生(在美国专利号8,133,701的情况下），这些研究在它们的 执行靶核酸的多路检测的能力方面受到限制。在任一种情况下，在多路场合内难以准确鉴 定特定靶核酸的存在或不存在。本发明解决了该问题，在本发明中，寡核苷酸探针的5'翼部 分和互补部分被接头隔开，其中在具有5'核酸酶活性的酶切割以后，将为每个单独的靶核 酸产生由5'-翼、接头和在互补部分的5'端上的一个另外核苷酸组成的单一"独特质量"片 段，所述片段然后可以通过质谱法明确地检测和分辨。
[0048]具有质量可区分的大小(MDF)的片段通过特定物理属性或检测特征(包括、但不限 于长度、质量、电荷或荷质比）来区别。在一个优选的实施方案中，所述检测特征是质量。在 另一个有关的实施方案中，MDF可以通过与物理属性相关的行为来区别，包括、但不限于质 量、在MALDI-T0F质谱法中的飞行时间。在一个有关的实施方案中，来自一种或多种寡核苷 酸探针的MDF被释放且从质谱基质选择性地解吸，使得非选择性引物和寡核苷酸探针（即不 存在靶核酸）不解吸。对于这些实施方案，与寡核苷酸探针或反应混合物中存在的其它非 MDF相比，MDF应从质谱基质更有效地解吸。优选的质谱基质包括2，5-二羟基苯甲酸、α-氰 基-4-羟基肉桂酸、3-羟基吡啶甲酸(3-ΗΡΑ)、柠檬酸二铵(DAC)和它们的组合。在另一个实 施方案中，质谱基质可以设计用于蛋白质分析。用于蛋白质分析的示例性基质包括、但不限 于DHB和CHCA。
[0049]该方法可以进一步包括使一种或多种寡核苷酸探针片段（即，MDF)与未切割的或 部分地切割的寡核苷酸探针分离的另外步骤。可以使用捕获配体(诸如生物素或其它亲和 配体)和与所述捕获配体具有特异性结合活性的捕获试剂(诸如抗生物素蛋白、抗生蛋白链 菌素、抗体、受体、与MDF互补的捕获探针或其功能片段)来完成分离。MDF可以含有对捕获试 剂具有特异性结合活性的捕获配体。捕获配体和捕获试剂还可以用于给MDF的剩余部分添 加质量，使得它可以从质谱仪中检测的MDF的质量范围中排除。在一个实施方案中，捕获探 针可以具有用于切割产物的通用扩增的通用引物。
[0050] 分离步骤还可以用于从MDF中除去盐、酶或其它缓冲液组分。本领域众所周知的几 种方法诸如层析、凝胶电泳或沉淀可以用于提纯样品。例如，尺寸排阻层析或亲和层析可以 用于从样品除去盐。分离方法的选择可以取决于样品的量。例如，当少量样品可获得或使用 小型化仪器时，可以使用微量亲和层析分离步骤。另外，是否需要分离步骤，以及分离方法 的选择，可以取决于使用的检测方法。例如，通过从样品除去盐，可以改善基质辅助的激光 解吸/电离和电喷射电离的效率。例如，盐可以吸收来自基质辅助的激光解吸/电离中的激 光的能量并且导致更低的电离效率。
[0051] 质谱法是检测本发明的具有质量可区分的大小(MDF)的片段的优选方法，并且因 此鉴定和/或定量靶核酸。MDF可以在质谱仪中离子化，并且离子基于它们的质荷比在空间 或时间中分离。质谱仪然后计算与每种离子相关的质量。因此，当提及质谱法时，术语质量 可以用于简洁描述质荷比。
[0052]质谱法是用于分离和鉴定分子的灵敏且准确的技术。通常，质谱仪具有两个主要 部件，即用于产生离子的离子源和用于测量离子的质荷比的质量选择性分析仪，其是且转 换成这些离子的质量的测量。几种电离方法是本领域已知的并且在本文中描述。MDF可以在 从寡核苷酸探针切割之前、期间或之后是带电的。结果，通过质谱法测量的MDF不总是需要 电荷，因为电荷可以通过质谱法操作来获得。在质谱法分析中，MDF的任选组分诸如电荷和 检测部分可以用于给MDF贡献质量。
[0053] 如本文中所述的不同质谱法方法例如四极质谱法、离子阱质谱法、飞行时间质谱 法、气相层析质谱法和串联质谱法可以利用离子源和质量分析仪的各种组合，其允许在设 计定制的检测方案中的灵活性。另外，质谱仪可以程序化成将来自离子源的所有离子依次 或同时传递进质谱仪。此外，质谱仪可以程序化成选择特定质量的离子用于传递进质谱仪， 同时阻断其它离子。
[0054] 精确地控制质谱仪中的离子移动的能力允许检测方案中的更多选项，当分析例如 来自多路实验的大量mMDF时，这可以是有利的。例如，在具有大量MDF的多路实验中，可以有 利的是，从一组相似报道分子中选择个别报道分子且然后分别分析该报道分子。基于控制 通过质谱仪检测的质量范围的另一个优点包括从分析中排除未切割的或部分地切割的带 标签的探针的能力，这会降低来自测定的背景噪音。
[0055] 质谱仪可以分辨具有小质量差异的离子，并且以高准确度测量离子的质量。因此， 相似质量的MDF可以一起用于相同实验中，因为质谱仪可以区分甚至紧密相关的标签的质 量。使用质谱法方法达到的高分辨程度和质量准确度允许使用带标签的探针的大集合，因 为所得到的报道标签可以彼此区别。当设计多路实验时，使用带标签的探针的大集合的能 力是一个优点。
[0056]使用质谱法用于检测MDF的质量的另一个优点是基于这类质量分析的高灵敏度。 通过利用由离子源形成的大部分离子且将这些离子通过质量分析仪有效地传递给检测器， 质谱仪实现高灵敏度。因为该高灵敏度水平，使用质谱法可以测量甚至有限量的样品。这可 以是多路实验中的一个优点，在所述多路实验中每个MDF种类的量可以很小。
[0057] 质谱法方法是本领域众所周知的（参见Burlingame等人.Anal. Chem. 70: 647R-716R (1998);Kinter和Sherman， Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience, New York (2000))。与质谱法方法相 关的基本过程是产生从样品衍生出的气相离子并测量其质量。
[0058]使用在质谱仪中产生的电磁场，可以精确地控制气相离子的移动。离子在这些电 磁场中的移动与离子的m/z成比例，并且这构成测量样品的m/z并因此测量样品的质量的基 础。离子在这些电磁场中的移动允许离子被包含和集中，这解释了质谱法的高灵敏度。在m/ z测量过程期间，离子以高效率传递给颗粒检测器，所述颗粒检测器记录这些离子的到达。 在每个m/z处的离子数量通过图上的峰来证实，在图中X轴是m/z，并且y轴是相对丰度。不同 的质谱仪具有不同的分辨水平，也就是说，分辨在质量上紧密相关的离子之间的峰的能力。 分辨率定义为R=m/S m，其中m是离子质量，并且δπι是质谱图中两个峰之间的质量差异。例如， 具有1000的分辨率的质谱仪可以将具有100.0的m/z的离子与具有100.1的m/z的离子区分 开。
[0059] 几类质谱仪是可获得的，并且可以以各种构型产生。一般而言，质谱仪具有下述主 要部件:样品入口、离子源、质量分析仪、检测器、真空系统和器械控制系统以及数据系统。 样品入口、离子源和质量分析仪中的差异一般限定器械的类型及其能力。例如，入口可以是 毛细管柱液相层析源，或可以是诸如在基质辅助的激光解吸中使用的直接探针或台 (stage)。常见的离子源是例如电喷射，包括纳米喷雾和微米喷雾或基质辅助的激光解吸。 示例性的质量分析仪包括四极质量过滤器、离子阱质量分析仪和飞行时间质量分析仪。
[0060] 离子形成过程是质谱图分析的起点。几种电离法是可获得的，并且电离法的选择 取决于待分析的样品。例如，对于多肽的分析，相对温和的电离操作诸如电喷射电离(ESI) 可以是合乎需要的。对于ESI，使含有样品的溶液在高电位穿过细针，所述高电位产生强电 场，从而产生被导向质谱仪的高度荷电的微滴的细喷雾。其它电离操作包括例如快原子轰 击(FAB)，其使用中性原子的高能束来撞击固相样品，从而造成解吸和电离。基质辅助的激 光解吸电离(MALDI)是一种其中使用激光脉冲撞击样品的方法，所述样品已经在吸收紫外 线的化合物基质中结晶。本领域已知的其它电离操作包括例如等离子体和辉光放电、等离 子体解吸电离、共振电离、和次级电离。MDF可以在从带标签的探针切割之前、期间或之后变 成尚子化。
[0061] 电喷射电离(ESI)具有可用于本文描述的发明的几种特性。例如，ESI可以用于难 以电离或蒸发的生物分子诸如多肽。另外，ESI的效率可以是极高的，这会提供用于高灵敏 度测量的基础。此外，ESI产生来自溶液的荷电分子，这对于分析溶液中的MDF是方便的。相 反，电离操作诸如MALDI要求在电离前使样品结晶。
[0062] 因为ESI可以直接从溶液产生荷电分子，所以它与来自液相层析系统的样品相容。 例如，质谱仪可以具有用于液相层析系统(诸如HPLC)的入口，使得级分从层析柱流进质谱 仪内。液相层析系统和质谱仪的这种线内排列有时被称为LC-MS。LC-MS系统可以用于例如 在质谱法分析前使未切割的或部分地切割的MDF与切割的MDF分离。另外，层析可以用于在 质谱法分析前从MDF样品除去盐或其它缓冲液组分。例如，使用线内或离线反相HPLC柱使样 品脱盐，可以用于增加电离过程的效率，且因此改善质谱法的检测灵敏度。
[0063] 多种质量分析仪是可获得的，其可以与不同离子源配对。不同的质量分析仪具有 不同的优点，如本领域技术人员已知的和如本文描述的。选择用于检测的质谱仪和方法取 决于特定测定，例如，当产生少量离子用于检测时，可以使用更灵敏的质量分析仪。在下文 描述了几类质量分析仪和质谱法方法。
[0064] 离子迀移率质量(IM)光谱测定法是一种气相分离方法，其给质谱法(MS)添加新量 纲。IM基于气相离子的碰撞横截面来分离它们，并且可以与飞行时间（T0F)质谱法偶联以产 生用于鉴定和表征蛋白质和肽的有力工具。因此，当MDF是蛋白质或肽时，IM-MS对于本发明 而言具有特殊效用。Verbeck等人在Journal of Biomolecular Techniques(第13卷，第2 期，56-61)中更详细地讨论了頂-MS。
[0065] 四极质谱法利用四极质量过滤器或分析仪。这类质量分析仪由排列为两套两个电 连接杆的四个杆组成。当离子从质量过滤器开始移动到末端时，将rf和dc电压的组合施加 于每对杆，这会产生引起离子的振荡运动的场。这些场的结果是在一对杆中产生高通质量 过滤器，并且在另一对杆中产生低通过滤器。高通和低通过滤器之间的重叠留下限定的m/ z，其可以穿过两个过滤器且穿越四极的长度。该m/z被选择且在四极质量过滤器中保持稳 定，而所有其它m/z具有不稳定的轨迹并且不保留在质量过滤器中。质谱图如下产生:使施 加的场逐渐变化，使得逐渐增加的m/z被选择穿过质量过滤器且到达检测器。另外，通过施 加仅rf场，四极还可以设置为含有且传递所有m/z的离子。这允许四极充当质谱仪的特定区 域中的透镜或聚焦系统，在所述特定区域中需要离子传递而无需质量过滤。这可用于如下 文进一步描述的串联质谱法中。
[0066] 四极质量分析仪、以及本文描述的其它质量分析仪可以程序化成分析限定的m/z 或质量范围。质谱仪的这种特性对于本文描述的发明是有用的。因为切割的MDF的质量范围 是在测定前已知的，所以质谱仪可以程序化成传递投射的正确质量范围的离子，同时排除 更高或更低质量范围的离子。选择质量范围的能力可以减小测定中的背景噪音并且因此增 加信噪比。另外，限定的质量范围可以用于排除任何未切割的寡核苷酸探针的分析，所述未 切割的寡核苷酸探针具有比MDF的质量更高的质量。因此，质谱仪可以完成固有的分离步骤 以及MDF的检测和鉴定。
[0067] 离子阱质谱法利用离子阱质量分析仪。在这些质量分析仪中，施加场使得所有m/z 的离子最初都被捕集在质量分析仪中且在其中振荡。离子从离子源穿过聚焦装置诸如八极 透镜系统进入离子阱。在激发和穿过电极射出到检测器前，离子捕集发生在捕集区中。质量 分析通过依次施加电压来完成，所述电压以将递增m/z的离子射出阱且进入检测器中的方 式增加振荡的振幅。与四极质谱法相比，所有离子都保留在质量分析仪的场内，除了具有选 定的m/z的那些之外。离子阱的一个优点是，它们具有极高灵敏度，只要小心地限制一次捕 集的离子的数目。通过改变将离子注射到阱内的时间，可以完成离子数目的控制。离子阱的 质量分辨率类似于四极质量过滤器的质量分辨率，尽管离子阱的确具有低m/z限制。
[0068] 飞行时间质谱法利用飞行时间质量分析仪。对于这种m/z分析方法，离子首先通过 在电场（由高电压产生）中加速获得固定量的动能。在加速后，离子进入无场或"漂移"区域， 在该区域中它以与其m/z成反比的速度行进。因此，具有低m/z的离子比具有高m/z的离子更 速地行进。测量离子经过无场区域的长度所需的时间，并用于计算离子的m/z。
[0069] 这类质量分析中的一个考虑是，将待研究的离子集合同时引入分析仪内。例如，这 类质量分析非常适合于电离技术如MALDI，其以短的充分确定的脉冲产生离子。另一个考虑 是控制由离子产生的速度分布，所述离子在其动能的量方面具有变动。更长的飞行管、离子 反射器或更高的加速电压的应用可以帮助使速度分布的效应最小化。飞行时间质量分析仪 具有高灵敏度水平和比四极或离子阱质量分析仪更宽的m/z范围。另外，用这类质量分析仪 可以快速地获得数据，因为质量分析仪的扫描不是必要的。
[0070] 气相层析质谱法会为实时检测靶标提供良好解决方案。系统的气相层析(GC)部分 将化学混合物分离成分析物(例如，MDF)的脉冲，并且质谱仪(MS)鉴定和定量分析物。
[0071] 串联质谱法可以利用上文描述的质量分析仪的组合。串联质谱仪可以使用根据其 m/z来分离离子的第一质量分析仪，以便分离目标离子用于进一步分析。分离的目标离子随 后破碎成碎片离子(称为碰撞活化的解离或碰撞诱导的解离），并且碎片离子由第二质量分 析仪进行分析。这些类型的串联质谱仪系统被称为在空间上串联的系统，因为两个质量分 析仪通常被碰撞室在空间上分离。串联质谱仪系统还包括在时间上串联的系统，其中使用 一种质量分析仪，但是，质量分析仪依次用于分离离子、诱导破碎和随后执行质量分析。
[0072] 空间串联类别中的质谱仪具有超过一个质量分析仪。例如，串联四极质谱仪系统 可以具有第一四极质量过滤器，随后为碰撞室，随后为第二四极质量过滤器，然后为检测 器。另一种排列是使用四极质量过滤器用于第一质量分析仪，并使用飞行时间质量分析仪 用于第二质量分析仪，碰撞室将两个质量分析仪隔开。其它串联系统是本领域已知的，包括 反射-飞行时间、串联扇区和扇区-四极质谱法。
[0073] 时间串联类别中的质谱仪具有在不同时间执行不同功能的一个质量分析仪。例 如，离子阱质谱仪可以用于捕集所有m/z的离子。应用一系列rf扫描功能，其从阱射出所有 m/z的离子，除了目标离子的m/z之外。在目标m/z已被分离后，施加 rf脉冲以产生与阱中的 气体分子的碰撞，从而诱导离子的破碎。然后通过质量分析仪测量碎片离子的m/z值。离子 回旋加速器共振器械，也被称作傅里叶变换质谱仪，是在时间上串联的系统的一个例子。
[0074] 通过控制在实验的每个阶段中选择的离子，可以执行几类串联质谱法实验。不同 类型的实验利用质量分析仪的不同操作模式，有时称为"扫描"。在被称为质谱图扫描的第 一个例子中，第一质量分析仪和碰撞室将用于质量分析的所有离子传递到第二质量分析仪 内。在被称为产物离子扫描的第二个例子中，目标离子在第一质量分析仪中进行质量选择， 然后在碰撞室内破碎。所形成的离子随后通过扫描第二质量分析仪进行质量分析。在称为 前体离子扫描的第三个例子中，扫描第一质量分析仪以依次将分析过质量的离子传递到碰 撞室内用于破碎。第二质量分析仪对目标产物离子进行质量选择用于传递给检测器。因此， 检测器信号是所有前体离子的结果，其可以破碎成共同的产物离子。其它实验形式包括中 性丢失扫描，其中在质量扫描中表示出恒定质量差异。与多路实验一样，当在单个实验中测 量报道标签的大集合时，这些不同的串联质谱法扫描操作的应用可以是有利的。
[0075] 在典型应用中，基于循环阈（Ct)值确定在反应期间生成的MDF量，所述Ct值代表产 生可检测量的核酸所需的循环的数目。Ct值的确定是本领域众所周知的。简言之，在PCR期 间，随着形成的扩增子的量增加，信号强度增加至可测量的水平，并且在反应进入非对数期 时在以后循环中达到平台。通过相对于反应的对数期中的循环数目绘制信号强度，可以推 断出获得可测量信号时的具体循环，且用于计算在PCR开始之前的靶标数量。确定Ct的示例 性方法描述在例如Heid等人· Genome Methods 6:986-94，1996中，参考水解探针。 实施例
[0076] 实施例1 使用5'-翼探针检测EGFR T790M扩增 执行PCR测定，以检测人表皮生长因子受体(EGFR)基因的T790M突变(核苷酸变化2369 C->T)。下述引物用于扩增EGFR基因的包括T790M突变位置的区域： 正向引物：5'CCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGA 3'（SEQ ID NO: 1) 反向引物：5'CAGTCGAAGGGCATGAGCTGEA 3'（E=叔丁基苄基-dC) (SEQ ID NO: 2) 为了检测，使用下述含有两个连续六甘醇(HEG)分子的5'-翼探针作为接头： 5'-T9JJTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGP-3'（SEQ ID N0: 3)，其中T9代表非互补的5'-翼部 分，J代表HEG，并且P代表磷酸酯。在96孔板上制备具有下述终浓度的PCR反应混合物:50 mM Tris-HCl(pH 8·0)，80-100 mM氯化钾，200μΜ每种dATP、dCTP和dGTP，400yM dUTP，200 nM每 种引物，200 nM 5'-翼探针，靶DNA( 1,000-100，000个EGFR质粒拷贝，20 nM DNA聚合酶(具 有5'核酸酶活性），0.1 mM EDTA，2.5 mM乙酸镁。使用Roche LightCycler?480器械(Roche Applied Science，Indianapolis，Ind.)完成扩增和分析。使用下述温度分布:95°C保持1分 钟(或2个95 °C (10秒)至62 °C (25秒）的循环，随后从92 °C (10秒)至62 °C (25-30秒)循环99次。
[0077] 使反应产物穿过TopTip (Glygen Corp)阴离子交换旋转柱，用于除去去污剂及其 它污染物，然后装载到Agilent Q-T0F 6530器械上，并且通过LC-MS分析片段。图2显示了来 自该实验的提取离子层析图（EIC)，以寻找在大小上与T9JJT和T 9JJTG对应的片段。仅检测到 与片段T9JJT对应的单个峰，这证实了5 '核酸酶几乎排它地在邻近双HEG接头分子的3 '侧的 核苷酸位置处的切割。在该片段的3 '末端上的"T"核苷酸对应于所述探针的与EGFR基因互 补的部分的5 '末端核苷酸。
【主权项】
1. 一种检测靶核酸序列在样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括下述步骤： (a) 使包含靶核酸的样品与下述物质接触： (i) 一对寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含与靶核酸序列的一条链中的一个 区域互补的序列且引发第一延伸产物的合成，并且其中第二寡核苷酸引物包含与所述第一 延伸产物中的一个区域互补的序列且引发与所述第一延伸产物互补的核酸链的合成，和 (ii) 寡核苷酸探针，其包含至少两个不同部分，第一部分包含标准核苷酸，具有或不具 有核苷酸类似物，所述第一部分包含与靶核酸序列的一个区域至少部分互补的序列，其中 所述第一部分在所述寡核苷酸引物对所结合的靶核酸序列内对合，并且其中所述第一部分 在3'端处被封闭以阻止通过核酸聚合酶进行的延伸;并且附着至所述第一部分的5'末端的 第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，且包含与靶核酸序列非互补的 序列；其中所述第二部分与所述第一部分被非核苷酸接头隔开，所述接头衍生自单个单元 或被磷酸酯键隔开的多个单元，其中所述接头在所述第一部分和所述第二部分的连接部处 建立失稳区域； (b) 在条件下用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶扩增靶核酸序列，所述条件允许 所述寡核苷酸引物对和所述寡核苷酸探针与所述靶核酸序列对合以及从所述寡核苷酸引 物对合成引物延伸产物，同时所述核酸聚合酶的5 '至3 '核酸酶活性能够切割对合的寡核苷 酸探针并从其释放优势片段，所述优势片段包含所述寡核苷酸探针的第二部分、所述非核 苷酸接头和在所述寡核苷酸探针的第一部分的5 '末端处的单个核苷酸;和 (c) 通过质谱法检测所述优势片段的存在或不存在，由此检测所述靶核酸序列在所述 样品中的存在或不存在。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在单个多路化反应中检测两种或更多种靶核酸。3. 根据权利要求2所述的方法，其中使用两种或更多种寡核苷酸探针在单个多路化反 应中检测两种或更多种靶核酸。4. 根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述非核苷酸接头选自丙二醇、六甘 醇(HEG)、三甘醇(TEG)、间隔物亚磷酰胺9、间隔物C12 CE亚磷酰胺和dSpacer CE亚磷酰胺 或它们的组合。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述非核苷酸接头选自丙二醇和HEG。6. 根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中通过质谱仪完成检测，所述质谱仪选 自基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF) MS、串联MS、电喷射电离-飞行时间(ESI-T0F)、ESI-离子阱、液相层析(LC)-MS)、气相层析(GC)-MS)和离子迀移率(ΠΟ-MS。7. 根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶是热稳定的DNA聚合 酶。8. -种包含寡核苷酸探针的组合物，其中所述寡核苷酸探针包含至少两个不同部分， 其中第一部分包含标准核苷酸，具有或不具有核苷酸类似物，所述第一部分包含与靶核酸 序列的一个区域至少部分互补的序列，使得所述第一部分能够结合至所述靶核酸序列的该 区域，且其中所述第一部分在3'端处被封闭以阻止DNA聚合酶对所述寡核苷酸探针的延伸； 并且附着至所述第一部分的5'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷 酸两者，且包含与靶核酸序列非互补的序列；其中所述第一部分和所述第二部分被非核苷 酸接头隔开，所述接头衍生自单个单元或被磷酸酯键隔开的多个单元，其中所述接头在所 述寡核苷酸探针的所述第一部分和所述第二部分的连接部处建立失稳区域。9. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述非核苷酸接头选自丙二醇、六甘醇(HEG)、三 甘醇(TEG)、间隔物亚磷酰胺9、间隔物C12 CE亚磷酰胺和dSpacer CE亚磷酰胺或它们的组 合。10. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述非核苷酸接头选自丙二醇和HEG。
【文档编号】C12Q1/68GK105899676SQ201480068099
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月18日
【发明人】A.古普塔
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司