一种cd19免疫原多肽及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种CD19免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的CD19免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR?T细胞免疫治疗的应用。本发明的有益效果在于为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞，（2）促进CD8+免疫应答，（3）能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，（4）促进T细胞与肿瘤细胞的结合，（5）在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR?T等细胞疗法。
【专利说明】
一种CD19免疫原多肽及其用途
技术领域
[0001] 本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的CD19免疫原 的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
【背景技术】
[0002] B细胞淋巴瘤是B细胞发生的实体肿瘤通常发生于儿童和成年人，是一种攻击免疫 系统中B细胞的癌症类型。包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其分型众多，经典霍奇金 淋巴瘤和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤，现在被认为是起源于B细胞的肿瘤。弥漫性 大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性 淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)5种B细胞非霍奇金淋巴瘤最为常见，占非霍奇金淋巴 瘤的3/4』细胞淋巴瘤的预后和治疗取决于淋巴瘤的具体类型以及分期分级。目前的治疗 手段以化疗为主，但化疗对身体伤害很大，以后康复了身体抵抗力也会变得很差。
[0003] 研究人员发现B细胞淋巴瘤细胞表面受体CD19起着关键作用。CD19是一种B细胞特 异性转膜糖蛋白，表达于B系细胞(不包括成熟浆细胞)及滤泡树突状细胞上，CD19是一种重 要的信号传导分子，调节B淋巴细胞的生长激活和活化，在调节B淋巴细胞抗原受体或其他 表面受体的信号阈值中起重要作用，是与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重 要膜抗原，是诊断B淋巴细胞系肿瘤的最好标志，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴 细胞白血病(ALL)。
[0004] 目前已经有肿瘤的临床试验测试对抗CD19受体的抗体。这种抗体不仅能杀死B淋 巴细胞系肿瘤，同时也能健康的B细胞，从而削弱免疫系统。研究人员希望能够设计更有效 的治疗方法，能选择性地杀死肿瘤细胞，同时保留健康的B细胞，产生更安全、有效的临床治 疗效果。
[0005] 肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免 疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行 体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗 肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
[0006] CD19可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，CD19由95KDa的蛋白，分子量较大， 较难得到纯度高的⑶19。这样，不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患 者的自身免疫。因此，本发明提供了一种特异性强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
【发明内容】
[0007] 发明目的
[0008] 本发明提供一种CD19免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞免疫 应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
[0009] 技术方案
[0010] 本发明的技术方案在于提供一种C D 1 9免疫原多肽，序列为 DNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLK FLKLSLGLPGLGIHMRPLASW(SEQ ID N0:1)。该氨基酸序列 为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T 细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
[0011] 有益效果
[0012] 本发明的CD19免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。 有益效果在于（1)促进Τ细胞，（2)促进CD8+免疫应答，（3)能与Τ细胞表面的MHC有效的特异 性结合，⑷促进Τ细胞与肿瘤细胞的结合，（5)在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细 胞疗法的靶标分子，应用于CAR-Τ等细胞疗法。
【具体实施方式】
[0013] 多肽由上海生工吉尔合成。
[0014] 实施例1
[0015] Τ淋巴细胞的增殖作用:无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心（1000r/min，5min)，弃上清，TriS-NH4CL破解红细 胞，冰水浴静置3_5min，离心（1000r/min，5min)，弃上清，用无菌冷roS洗涤细胞两次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培养液(5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5 X106 个/ml，于96孔培养板中培养。
[0016] 实验设空白对照组、模型组(刀豆蛋白A，sigma公司购买）、多肽各剂量(3、6、12mg/ ml)组。各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液100μΙ/孔后，空白对照组加入1640培养液100μΙ，模 型组加入ConA(终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加 ConA(终 浓度为Sμg/ml)。37 °C细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20μ1 MTT，继续培养 4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入100ylDMS0，震荡，用酶标仪检测570nm处0D值，每孔设 5个平行。
[0017]表1多肽对T淋巴细胞的增殖作用
[0018]
[0019] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 与模型组相比。
[0020]实验结果见表1，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为3 ~12mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系，以20mg/ml的增殖率最高，为153.6%。
[0021] 实施例2
[0022] CD19免疫原多肽的免疫原性测定:采用流式细胞技术测定免疫原多肽对CD8+T细 胞的影响。6_8w龄C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。（1)空白组；（2)免疫原多肽低 剂量组；（3)免疫原多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14天，分别进行免疫。 方案为:空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：l、2、4mg/Kg，在小鼠背部淋巴 结附近多点注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离心后取血细胞层，用红细胞裂 解液破解红细胞，洗去裂解的红细胞，再用荧光标记的单克隆抗CD8+-FITC(购自北京华泰 昕生物医疗技术有限公司)孵育、固定后，进行流式细胞技术测定，评价免疫原多肽对CD8+T 细胞的影响。
[0023]表2多肽对⑶8+T淋巴细胞的作用
[0024]
[0025] *P〈0 · 05，#P〈0 · 01 与模型组相比。
[0026]实验结果见表2,与空白组比较，多肽能促进小鼠 CD8+T淋巴细胞，在剂量为1~ 4mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系，以4mg/Kg的增殖率最高，为156.82%。
[0027] 实施例3
[0028] 应用竞争性受体-配体亲和法测试多肽与MHC的结合能力：
[0029] 将多肽与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和法判断。将固定浓度为50μ mo 1 /L的标记1251的多肽以及不同浓度（1 -50μπιο 1 /L)的多肽加入反应体系（磷酸盐缓冲液 和MHC，所述的MHC试剂盒购自上海泛柯生物科技有限公司，试剂盒内有HLA-A1、Α2、A3、A11 和A24)，在反应体系中形成两种复合物，即待测多肽MHC复合物和1251标记多肽复合物。待 测多肽与1251标记多肽竞争与MHC的结合。用超过滤(产品型号Microcon 30，Amicon公司） 分离游离多肽和多肽MHC复合物，然后测定多肽MHC复合物的1251放射量，将此放射量与没 有竞争性抑制的多肽MHC复合物(没有加待测多肽的样本）的放射量比较，求待测多肽在抑 制50%标记多肽与腿(：结合时的浓度，8卩1050。由此得到，多肽对!11^-六1^2^3^11和八24的 IC50值分别为8.67、6.87、3.22、6.53和0.22以111〇1/1，均符合阳性多肽的标准（彡1(^111〇1/1)。 因此，多肽为具有有效结合能力的免疫原多肽。
[0030] 实施例4
[0031] CD19免疫原多肽的T细胞结合试验:采用玫瑰花环试验评价T细胞与人弥漫大B细 胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)活化B细胞（activated B-cell,ABC) 型细胞株〇CI_Ly3的结合能力。无菌取豚鼠胸腺，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心1000转/分，10分钟，弃上清，以Hank's液调细胞浓度 为3 X 10%1。于96孔培养板中培养。
[0032] 实验设空白对照组、多肽各剂量(3、6、12mg/ml)组。各组分别加入胸腺淋巴细胞悬 液?οομL/孔后，空白对照组加入1640培养液500μ1，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽。 37°C细胞培养箱，培养48h，培养结束后每孔中加入100μΙ/孔0CI-Ly3细胞(细胞浓度为IX 106/ml，含10 %胎牛血清），混匀，500转/分，离心5分钟。弃上清，加少量戊二醛，轻轻晃动， 使细胞悬浮，加甲紫染色，400倍显微镜观察。凡结合3个以上肿瘤细胞的T淋巴细胞为花环 阳性细胞。记数100个T细胞中形成花环的淋巴细胞百分率，即为T细胞与0CI-Ly3细胞的结 合率。每孔设5个平行。
[0033] 实验结果见表3，与空白组比较，CD19免疫原多肽可以显著性增加 T细胞与0CI_Ly3 细胞的结合率(P〈〇.01)，低中高剂量组的结合率分别为34.35、45.30和54.72%。在剂量为3 ~12mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。
[0034] 表3多肽对T细胞结合的影响
[0035]
[0036]
[0037] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 与空白组相比。
[0038] 实施例5
[0039] 用人弥漫性大B细胞淋巴瘤移植瘤模型检测CD19免疫原多肽的体内活力。
[0040] 6-8龄SCID小鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。（1)空白组；（2)多肽低剂 量组；（3)多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。建立人弥漫性大B细胞淋巴瘤移植瘤模型，在接 种肿瘤细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为:空白组加入相同体积的溶剂，实验组多 肽设3个剂量:1、2、4mg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。 结果显示，剂量l、2、4mg/Kg的多肽可有效地保护小鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率达到 65·87、70·98 和82.98%。
【主权项】
1. 一种⑶19免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列为SEQ ID NO: 1。2. 根据权利要求1所述的多肽在用于治疗肿瘤药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的多肽在制备用于肿瘤免疫细胞，增 强T细胞免疫应答药物中的应用。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
【文档编号】C07K14/705GK105906705SQ201610438413
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司