一种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法
【专利摘要】本发明一种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法，属于食品生物利用领域。将去除可见脂肪的鸡爪皮清洗，低温风干，剪成小块。浸泡在NaCl的Tris?HCl缓冲液中除去杂蛋白、脂肪。预处理后的鸡爪皮浸泡于预冷的NaCl中性盐溶液中，搅拌离心后。沉淀浸泡于乙酸中提取酸溶性胶原蛋白，离心取沉淀浸泡于酶溶液中提取酶溶性胶原蛋白。三步的上清液分级盐析，透析，冻干即得到较纯的盐溶性胶原蛋白，酸溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白。本发明利用一种溶液可对原料进行预处理高效节约，利用分级提取，原料利用率更高，并且可按不同使用范围选择对应的胶原蛋白，分级盐析可得到纯的I型胶原蛋白且除去胶原蛋白里面的酶残留。
【专利说明】
一种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明属于食品生物利用领域，具体讲是涉及一种依次提取和分级盐析纯化胶原蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]肉鸡在世界范围内消费量很大，但其作为家禽类产业加工的副产物的鸡爪经常被直接丢弃、用于制作泡椒凤爪等简单加工的肉制品或者用于生产动物饲料，并且很多西方国家是从不食用鸡爪的，这就造成了资源的极大浪费。而鸡爪皮中含有丰富的胶原蛋白，因此开发和利用鸡爪皮的这一优势来提取胶原蛋白，可以极大的提高鸡爪的经济附加值，增加其生物综合利用度，对于肉鸡产业有着重大的意义。
[0003]I型胶原蛋白是机体中含量最丰富的的胶原蛋白，广泛存在于动物的皮肤、筋腱和韧带中。I型胶原蛋白以其特殊的结构广泛的应用于医学、食品和生物领域。鸡爪皮中也含有大量I型胶原蛋白。
[0004]目前从动物皮中提取胶原蛋白的预处理方法一般是，经碱浸泡除去色素和杂蛋白，再由乙醇来除去脂肪，此方法繁琐，并且每步之后都要经过蒸馏水反复清洗。而本方法直接使用缓冲溶液就达到以上几种溶液的目的，极大节省时间，提高效率。而传统的提取过程如:中国专利CN 105218663 A中，牛跟腱胶原蛋白用溶解于乙酸的胃蛋白酶溶液提取，但是原料的利用率不高，有大量的原料残渣里面还含有胶原蛋白未溶解出。而本发明依次用中性盐、乙酸、胃蛋白酶提取，每一步之后的固体留待下一步提取，这样能够达到原料中胶原蛋白几乎完全被提取出的效果，并且可以根据不同提取方法提取出的胶原蛋白的特点，使用在不同得地方，依次达到更高效率提取，更细化胶原蛋白使用的目的。并且本发明在得到胶原蛋白粗提取液后，用分级盐析的方法不仅得到纯的I型胶原蛋白，并且酶提取的胶原蛋白里面没有酶残留。提取方便，原料利用率高，效率高且得到有活性的纯的I型胶原蛋白。
【发明内容】
[0005]本发明以肉鸡加工的副产物鸡爪皮为原料，利用中性盐(NaCI )，乙酸和酶(Pepsin)三种溶液提取，分级盐析依次得到盐溶性胶原蛋白(SSC)，酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC)三种纯化的I型胶原蛋白。
[0006]因此，本发明采用的技术方案如下:一种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法，按照下述步骤进行:
(I)原料的预处理
剥下鸡爪上的皮，切除可见脂肪，自来水洗干净，低温风干，剪成小块。浸泡在NaCl的Tris-HCl缓冲液中除去杂蛋白，色素和脂肪，搅拌，取离心后沉淀。
[0007](2)盐溶性胶原蛋白提取
预处理的鸡爪皮浸泡于预冷的NaCl的Tris-HCl缓冲液中，搅拌，提取，离心上清液即盐溶性胶原蛋白粗提液。离心沉淀用蒸馏水冲洗。
[0008](3)酸溶性胶原蛋白提取
盐提后离心所得沉淀浸泡于预冷的乙酸溶液中，搅拌，提取，离心上清液即酸溶性胶原蛋白粗提液。离心沉淀用蒸馏水冲洗。
[0009](4)酶溶性胶原蛋白提取
酸提后所得沉淀浸泡于预冷的胃蛋白酶溶液中，搅拌，提取，离心上清液即酶溶性胶原蛋白粗提液。
[0010](5)胶原蛋白的提纯
盐溶性胶原蛋白粗提液中先添加HCl搅拌，缓慢的边搅拌边加入NaCl直至其完全溶解，进行第一次盐析过夜，离心，沉淀即盐溶性胶原蛋白粗品，溶解于乙酸中。
[0011 ]酸溶性胶原蛋白粗提液中直接加NaCl，同上步操作进行第一次盐析过夜，离心，收集的沉淀即酸溶性胶原蛋白粗品，溶解于乙酸中。
[0012]酶溶性胶原蛋白粗提液直接加NaCl，同上步操作进行第一次盐析过夜，离心，所得沉淀酸溶性胶原蛋白粗品，用NaCl的Tris-HCl缓冲液溶解，溶解胶原蛋白的同时中性环境使胃蛋白酶残留失活。
[0013]上述三种溶解后的胶原蛋白溶液，离心取上清液，再次加入NaCl进行第二次盐析，离心收集沉淀溶解于适量乙酸中，蒸馏水透析，真空冷冻干燥得较纯的胶原蛋白冻干品。
[0014]步骤(I)手术刀剥去鸡爪皮，手工切除可见脂肪，鸡爪皮剪成IcmXIcm的方块，自来水冲洗，沥干后20 0C下风干，-20 °(:保藏以待下一步使用。鸡爪皮与盐溶液比为Ig: 20mL，Tris-HCl缓冲液为0.05M，调pH为7.5，10mL缓冲液中加20g NaCl。离心为1000g进行20min。此操作重复直至无可见脂肪和色素。
[0015]步骤(2)中Tris-HCl缓冲液同上步相同条件，缓冲液中加NaCl至0.45mol/L，提取4811，离心条件为1700(^进行301^11。离心后沉淀用蒸馏水冲洗至?!1为7.0。
[0016]步骤(3)中酸提取液为0.5mol/L乙酸，提取48h，离心条件为17000g进行30min。
[0017]步骤(4)中酶溶液为0.5moI/L乙酸中加胃蛋白酶比为0.Ig:1OOL。提取48h，离心条件为17000g进行30min。
[0018]步骤(5)中，盐溶性胶原蛋白粗提液中加HCl至0.01mol/L,三种胶原蛋白粗提液第一次盐析加NaCl至0.9mol/L，第一次离心条件为2500g进行30min。盐提和酸提所得沉淀溶解于0.5mol/L乙酸中，溶解酶提所得沉淀的Tris-HCl缓冲液为0.05mol/L调pH为7.5，加NaCl至1.0mol/L。离心条件为2500g进行30min，上清液中加NaCl至2.4mol/L进行第二次盐析。搅拌后17000g离心30min，收集三种提取方法所得沉淀，溶解于0.5mol/L乙酸中，蒸馏水透析，直至用0.0lmol/L AgNO3检测透析外液无白色沉淀为止。之后胶原蛋白溶液倒入培养皿中进行真空冷冻干燥，即得到呈纤维海绵状的白色干燥的胶原蛋白纯品。
[0019]以上技术方案中所有除杂，提取，离心，纯化等操作都在4°C下进行。
[0020]本发明的优势在于:
(I)世界各国每天消耗大量的鸡肉，但肉鸡产业的副产物鸡爪在很多国家直接被视为加工下脚料，通常被加工成饲料或者肥料，而更甚者直接作为垃圾掩埋掉。只有部分亚洲国家会食用鸡爪，也只是进行简单加工，这就造成了资源的极大浪费和对环境的污染。而本发明以鸡爪皮为原料，生产具有较高营养价值和使用价值的胶原蛋白，这就极大地提高了其附加值，增加其生物综合利用度。
[0021](2)传统胶原蛋白的提取在原料预处理时需要进行多步操作，用多种不同的溶液对原料进行除杂蛋白、色素和脂肪，耗时并且浪费大量溶液，并且每一步之后都要用蒸馏水反复冲洗原料以除去上一步溶液残留。而本发明在预处理时直接使用中性盐的缓冲溶液，即可完成以上繁琐操作，省时省力，效率高，易操作。
[0022](3)鸡爪皮中含有大量的胶原蛋白，传统大多只用热水、盐、酸等单种方法难以将鸡爪皮中的胶原蛋白完全提取出，这样就存在原料利用率低，经济效益不高并且提取出的胶原蛋白不纯的问题。而本发明利用分级提取法，依次将用中性盐、酸和酶将鸡爪皮中的胶原蛋白几乎完全提取出。并且可以根据三种方法提出的胶原蛋白的结构分类利用于食品和化妆品领域中。
[0023](4)酶溶性胶原蛋白提取时，纯化步骤粗胶原蛋白溶解在NaCl的Tris_HCl中性缓冲液中，提纯胶原蛋白的同时灭酶，避免在之后的透析、冻干和存放的步骤中胶原蛋白中的胃蛋白酶还存在活性，将胶原蛋白酶解为小分子肽，影响胶原蛋白的生物活性。
【附图说明】
[0024]图1:鸡爪皮胶原蛋白提取方法的流程图。
[0025]图2:不同溶液提取鸡爪皮胶原蛋白的SDS-PAGE图谱。
[0026]图3:不同溶液提取的胶原蛋白的流变特性图:动态频率扫描实验的动态模量(G')。
[0027]具体事例
下面结合实例对本发明进行详细阐述:
本发明中三种溶液提取胶原蛋白的流变性测定通过以下方法，胶原蛋白溶解于0.5M乙酸中制备1.0%(w/w)溶液，用直径40mm磨具，磨具和样品台间距100ym，sweep模式，温度250C，频率0.1-1 OHZ，持续应力0.5%,进行震荡流变测量动态模量G丨值。
[0028]实施例1:
将除去可见脂肪的鸡爪皮，自来水洗干净，低温风干，剪成小块(约IcmX Icm)。称取10g浸泡在20L 20% (w/v) NaCl的Tris-HCl(0.05mol/L，pH7.5)缓冲液中除去杂蛋白，色素和脂肪，搅拌48h，1000g离心20min，收集沉淀，蒸馏水洗至pH为7.0。
[0029]预处理后的鸡爪皮浸泡于8L预冷的0.45mol/L NaCl的Tris-HCl (0.05mol/L，pH7.5)缓冲液中，搅拌48h，17000g离心30min上清液即盐溶性胶原蛋白粗提液。离心后所得沉淀用蒸馏水冲洗至pH为7.0。
[0030]盐提后离心所得沉淀浸泡于8L预冷的0.5mol/L的乙酸溶液中，搅拌48h，17000g离心30min上清液即酸溶性胶原蛋白粗提液。
[0031]酸提后所得沉淀浸泡于8L预冷的胃蛋白酶溶液(8L乙酸中加Sg胃蛋白酶)中，搅拌48h，17000g离心30min上清液即酶溶性胶原蛋白粗提液。
[0032]盐溶性胶原蛋白粗提液中先添加HCl至0.0lmol/L，缓慢的边搅拌边加入NaCl至0.9mol/L进行第一次盐析过夜，2500g离心30min，沉淀即盐溶性胶原蛋白粗品，溶解于8L0.5mol/L乙酸中。
[0033]酸溶性胶原蛋白粗提液中缓慢的边搅拌边加入NaCl至0.9mol/L进行第一次盐析过夜，2500g离心30min，收集的沉淀即酸溶性胶原蛋白粗品，溶解于8L 0.5mol/L乙酸中。
[0034]酶溶性胶原蛋白粗提液缓慢的边搅拌边加入NaCl至0.9mol/L进行第一次盐析过夜，2500g离心30min，所得沉淀酸溶性胶原蛋白粗品，用8L的NaCl (1.0mol/L)的Tris-HCl(0.05mo 1/L，pH7.5)缓冲液溶解。
[0035]上述三种溶解后的胶原蛋白溶液，2500g离心30min取上清液，再次加入NaCl至2.4mol/L进行第二次盐析，17000g离心30min收集沉淀溶解于500mL乙酸(0.5mol/L)中，将溶液装入截留分子量为14KDa的透析袋中，蒸馏水透析72h，真空冷冻干燥得到胶原蛋白冻干品。按照胶原蛋白粗提液和原料中羟脯氨酸比例计算其得率为PSC>ASC>SSC，依次为(49.10±1.95)%、(14.49±0.90)%和(1.13±0.31)%。经SDS-PAGE分析得到的胶原蛋白都为较纯的I型胶原蛋白。三种胶原蛋白溶解于乙酸中测定其流变特性，如图3所示，三种胶原蛋白溶液都主要表现为弹性行为，而力学损耗趋势为PSC> ASC> SSC。
[0036]实施例2:
将除去可见脂肪的鸡爪皮，自来水冲洗干净，沥干，剪成小块(约IcmX Icm)。称取10g浸泡在25L 20% (w/v) NaCl的Tris-HCl(0.05mol/L，pH7.5)缓冲液中除去杂蛋白，色素和脂肪，搅拌72h，1000g离心20min，收集沉淀，蒸馏水洗至pH为7.0。
[0037]预处理后的鸡爪皮浸泡于1L预冷的0.45mol/L NaCl的Tris-HCl (0.05mol/L，pH7.5)缓冲液中，搅拌72h，17000g离心30min上清液即盐溶性胶原蛋白粗提液。离心后所得沉淀用蒸馏水冲洗至pH为7.0。
[0038]盐提后离心所得沉淀浸泡于1L预冷的0.5mol/L的乙酸溶液中，搅拌72h，17000g离心30min上清液即酸溶性胶原蛋白粗提液。
[0039]酸提后所得沉淀浸泡于1L预冷的胃蛋白酶溶液(10L乙酸中加1g胃蛋白酶)中，搅拌72h，17000g离心30min上清液即酶溶性胶原蛋白粗提液。
[0040]盐溶性胶原蛋白粗提液中先添加HCl至0.0lmol/L，缓慢的边搅拌边加入NaCl至0.9mol/L进行第一次盐析过夜，2500g离心30min，沉淀即盐溶性胶原蛋白粗品，溶解于1L0.5mol/L乙酸中。
[0041]酸溶性胶原蛋白粗提液中缓慢的边搅拌边加入NaCl至0.9mol/L进行第一次盐析过夜，2500g离心30min，收集的沉淀即酸溶性胶原蛋白粗品，溶解于1L 0.5mol/L乙酸中
酶溶性胶原蛋白粗提液缓慢的边搅拌边加入NaCl至0.9mol/L进行第一次盐析过夜，2500g离心30min，所得沉淀酸溶性胶原蛋白粗品，用1L的NaCl (1.0mol/L)的Tris-HCl(0.05mo 1/L，pH7.5)缓冲液溶解。
[0042]上述三种溶解后的胶原蛋白溶液，2500g离心30min取上清液，再次加入NaCl至2.4mol/L进行第二次盐析，17000g离心30min收集沉淀溶解于500mL乙酸(0.5mol/L)中，蒸馏水透析72h，真空冷冻干燥得胶原蛋白冻干品。按照胶原蛋白粗提液和原料中羟脯氨酸比例计算其得率为 PSC>ASC>SSC，依次为(50.60 ±2.21)%、(16.01 ±0.03)%和(1.28土
0.97) %。与案例I相比说明提取时料液比变高时得率会适当提高。经SDS-PAGE分析得到的胶原蛋白都为较纯的I型胶原蛋白。
[0043]实施例3:
将除去可见脂肪的鸡爪皮，自来水洗干净，沥干，剪成小块(约IcmX Icm)。称取10g浸泡在15L 20% (w/v) NaCl的Tris-HCl(0.05mol/L，pH7.5)缓冲液中除去杂蛋白，色素和脂肪，搅拌48h，1000g离心20min，收集沉淀，蒸馏水洗至pH为7.0。
[0044]预处理后的鸡爪皮浸泡于6L预冷的0.45mol/L NaCl的Tris-HCl (0.05mol/L，pH7.5)缓冲液中，搅拌48h，17000g离心30min上清液即盐溶性胶原蛋白粗提液。离心后所得沉淀用蒸馏水冲洗至pH为7.0。
[0045]盐提后离心所得沉淀浸泡于6L预冷的0.5mol/L的乙酸溶液中，搅拌48h，17000g离心30min上清液即酸溶性胶原蛋白粗提液。
[0046]酸提后所得沉淀浸泡于6L预冷的胃蛋白酶溶液(6L乙酸中加6g胃蛋白酶)中，搅拌48h，17000g离心30min上清液即酶溶性胶原蛋白粗提液。
[0047]盐溶性胶原蛋白粗提液中先添加HCl至0.01mol/L，缓慢的边搅拌边加入NaCl至0.9mol/L进行第一次盐析过夜，2500g离心30min，沉淀即盐溶性胶原蛋白粗品，溶解于6L0.5mol/L乙酸中。
[0048]酸溶性胶原蛋白粗提液中缓慢的边搅拌边加入NaCl至0.9mol/L进行第一次盐析过夜，2500g离心30min，收集的沉淀即酸溶性胶原蛋白粗品，溶解于6L 0.5mol/L乙酸中。
[0049]酶溶性胶原蛋白粗提液缓慢的边搅拌边加入NaCl至0.9mol/L进行第一次盐析过夜，250(^离心30111；[11，所得沉淀酸溶性胶原蛋白粗品，用6]^的他(:1(1.01]101凡)的1'1^8-此1(0.05mo 1/L，pH7.5)缓冲液溶解。
[0050]上述三种溶解后的胶原蛋白溶液，2500g离心30min取上清液，再次加入NaCl至
2.4mol/L进行第二次盐析，17000g离心30min收集沉淀溶解于500mL乙酸(0.5mol/L)中，将溶液装入截留分子量为14KDa的透析袋中，蒸馏水透析72h，真空冷冻干燥得到胶原蛋白冻干品。按照胶原蛋白粗提液和原料中羟脯氨酸比例计算其得率为PSC>ASC>SSC，依次为(47.78 ±0.20) %、(13.11 ±1.65)%和(0.78 ±0.33) %。经 SDS-PAGE 分析得到的胶原蛋白都为较纯的I型胶原蛋白。
[0051]以上实例的所有除杂，提取，离心，纯化等操作都在4°C下进行。依次提取鸡爪皮胶原蛋白及分级盐析的过程见流程图。提取的胶原蛋白可以通过SDS-PAGE图谱鉴定其纯度。三种方法得到的蛋白都为较纯的I型胶原蛋白，可以看出SSC、ASC和PSC都有清晰的三条肽链，g卩Q1(I)和α2( Π )两条α链，α的二聚体β和α的三聚体γ链。
【主权项】
1.一种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法，其特征在于按照下述步骤进行: (1)原料的预处理 剥下鸡爪上的皮，切除可见脂肪，自来水洗干净，低温风干，剪成小块；浸泡在NaCl的Tris-HCl缓冲液中除去杂蛋白，色素和脂肪，搅拌，取离心后沉淀； (2)盐溶性胶原蛋白提取 预处理的鸡爪皮浸泡于预冷的NaCl的Tris-HCl缓冲液中，搅拌，提取，离心上清液即盐溶性胶原蛋白粗提液;离心沉淀用蒸馏水冲洗； (3)酸溶性胶原蛋白提取 盐提后离心所得沉淀浸泡于预冷的乙酸溶液中，搅拌，提取，离心上清液即酸溶性胶原蛋白粗提液;离心沉淀用蒸馏水冲洗； (4)酶溶性胶原蛋白提取 酸提后所得沉淀浸泡于预冷的胃蛋白酶溶液中，搅拌，提取，离心上清液即酶溶性胶原蛋白粗提液； (5)胶原蛋白的提纯 盐溶性胶原蛋白粗提液中先添加HCl搅拌，缓慢的边搅拌边加入NaCl直至其完全溶解，进行第一次盐析过夜，离心，沉淀即盐溶性胶原蛋白粗品，溶解于乙酸中； 酸溶性胶原蛋白粗提液中直接加NaCl，同上步操作进行第一次盐析过夜，离心，收集的沉淀即酸溶性胶原蛋白粗品，溶解于乙酸中； 酶溶性胶原蛋白粗提液直接加NaCl，同上步操作进行第一次盐析过夜，离心，所得沉淀酸溶性胶原蛋白粗品，用NaCl的Tris-HCl缓冲液溶解，溶解胶原蛋白的同时中性环境使胃蛋白酶残留失活； 上述三种溶解后的胶原蛋白溶液，离心取上清液，再次加入NaCl进行第二次盐析，离心收集沉淀溶解于适量乙酸中，蒸馏水透析，真空冷冻干燥得较纯的胶原蛋白冻干品。2.根据权利要求1所述的一种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法，其特征在于步骤(I)手术刀剥去鸡爪皮，手工切除可见脂肪，鸡爪皮剪成IcmX Icm的方块，自来水冲洗，沥干后20°C下风干，_20°C保藏以待下一步使用；鸡爪皮与盐溶液比为lg:20mL，Tris-HCl缓冲液为0.05M，调pH为7.5，10mL缓冲液中加20g NaCl;离心为1000g进行20min;此操作重复直至无可见脂肪和色素。3.—种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法，其特征在于步骤(2)中Tris-HCl缓冲液同上步相同条件，缓冲液中加NaCl至0.45mol/L，提取48h，离心条件为17000g进行30min;离心后沉淀用蒸馏水冲洗至pH为7.0。4.一种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法，其特征在于步骤(3)中酸提取液为0.5mol/L乙酸，提取48h，离心条件为17000g进行30min。5.—种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法，其特征在于步骤(4)中酶溶液为0.5mol/L乙酸中加胃蛋白酶比为0.1g:100L;提取48h，离心条件为17000g进行30min。6.一种依次提取和分级盐析纯化鸡爪皮胶原蛋白的方法，其特征在于步骤(5)中，盐溶性胶原蛋白粗提液中加HCl至0.0lmol/L，三种胶原蛋白粗提液第一次盐析加NaCl至.0.9mol/L，第一次离心条件为2500g进行30min;盐提和酸提所得沉淀溶解于0.5mol/L乙酸中，溶解酶提所得沉淀的Tris-HCl缓冲液为0.05mol/L调pH为7.5，加NaCl至1.0mol/L;离心条件为2500g进行30min，上清液中加NaCl至2.4mol/L进行第二次盐析;搅拌后17000g离心.30min，收集三种提取方法所得沉淀，溶解于0.5mol/L乙酸中，蒸馈水透析，直至用0.0lmol/L AgNO3检测透析外液无白色沉淀为止;之后胶原蛋白溶液倒入培养皿中进行真空冷冻干燥，即得到呈纤维海绵状的白色干燥的胶原蛋白纯品。
【文档编号】C07K1/30GK105906710SQ201610393886
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】周存山, 李妍花, 马海乐, 余筱洁, 胡佳丽, 鲍鑫捷
【申请人】江苏大学