一种双孢蘑菇内生菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种双孢蘑菇内生菌及其应用，双孢蘑菇内生菌为赖氨酸芽孢杆菌，命名为赖氨酸芽孢杆菌SCAU1，保藏编号为CCTCCM2016106。本发明从双孢蘑菇中分离出的功能内生菌，不仅促进植物生长、抑制植物病原真菌和病原细菌的生长且具备高效纤维素降解能力，可用于“肥药兼效型”微生物肥料的制作，改善土壤理化性质，促进植物生长；连续三次盆栽实验显示SCAU1发酵液经清水稀释后，采用灌根方式对玉米苗表现出明显的促生作用，能够明显提高玉米苗期的根数、根长、株高、叶片数量和叶面积；以烤烟为供试植物，进行SCAU1的大田实验，结果显示能提高烤烟云87团棵期的茎粗、株高、叶面积系数，提高了烤烟的产量和钾含量。CCTCC NO:M201610620160311
【专利说明】
一种双孢蘑菇内生菌及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种双孢蘑菇内生菌及其应用。
【背景技术】
[0002]内生菌是一类生长于活体植物组织中的特殊微生物，在植物中普遍存在，且能够 产生与宿主相同或相似的生物活性物质。从内生菌中筛选活性高的菌株为寻找新型生物活 性物质及开发具有应用功能的微生物菌剂开辟了一条新的道路。食用菌是美食良药兼用的 大型真菌，目前有关食用菌内生菌报道极少。
[0003] 双孢蘑燕（Agar i cus b i sporus )在分类学上属于真菌界（Fungi )、真菌门 ^111115^(^&)、担子菌亚门（1^8丨(1；[01115^01：；[11&)、担子菌纲（1^8丨(1；[01115^6七68)、伞菌目 (Agaricales)、伞菌科(Agaricaceae)、蘑燕属(Agaricus)，它营养丰富，味道鲜美，色白质 嫩，富含蛋白质、多糖等营养成分，是一种受世界各国人民喜爱的"健康食品"，具有很好地 保健功能。双孢蘑菇是世界上人工栽培时间最长，栽培规模最广，栽培效益最好的"三最"大 宗食用菌，也是一类以纤维素为主要碳源，栽培过程需要覆土才能扭结出菇的大型真菌。以 双孢蘑菇为分离源，进行内生细菌的分离并鉴定分离菌株的功能对于挖掘新的微生物菌种 资源应用于新型复合微生物菌剂的开发具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种双孢蘑菇内生菌及其应用，通过综合评价筛选食用菌 内部细菌的功能特性，旨在解决当前微生物肥料生产菌种单一、菌株优良性状退化、菌剂产 品环境适应性较弱等问题。
[0005] 本发明是这样实现的，一种双孢蘑菇组织内细菌，所述双孢蘑菇内生菌为赖氨酸 芽孢杆菌，命名为赖氨酸芽孢杆菌SCAU1，保藏编号为CCTCCM2016106。该菌具有较广泛的抗 菌作用，同时能促进植物生长，兼具"肥药"双效功能，使用该菌制成的微生物肥料对于在农 业种植业中减少化学肥料和农药施用具有重要意义。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种所述双孢蘑菇内生菌的分离方法，所述分离方法 选取未开伞的双孢蘑菇子实体，进行赖氨酸芽孢杆菌的分离。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种所述双孢蘑菇内生菌的鉴定方法，所述鉴定方法 包括:对赖氨酸芽孢杆菌SCAU1进行抗菌活性、IAA产生量、溶磷特性、产纤维素酶特性进行 分析。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述双孢蘑菇内生菌制备的发酵液。
[0009] 进一步，所述制备方法包括:将筛选得到的赖氨酸芽孢杆菌SCAU1活化后接种于LB 肉汤培养液中，30°C，120r/min的丨旦温摇床中培养，培养36h后，作为种子液以1:1比例加入 含有葡萄糖的LB肉汤培养基，30°C，120r/min的恒温摇床中培养36h使其活菌数达到10亿以 上，取出备用。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述双孢蘑菇内生菌制备的赖氨酸芽孢杆 菌SCAU1液体菌剂。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种所述发酵液在玉米盆栽的应用。
[0012] 进一步，将按50-200比例稀释的SCAU1菌株的发酵液采用灌根的方式进行玉米苗 的接菌处理。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种所述发酵液在烤烟的应用。
[0014] 进一步，将按50-200比例稀释SCAU1菌株发酵液，在烤烟苗移栽时，将SCAU1进行烤 烟灌根处理。
[0015] 本发明提供的双孢蘑菇内生菌及其应用，从双孢蘑菇中分离出特异内生菌，不仅 可以促进植物的生长，还可以抑制植物病原真菌和细菌的生长，且具备高效纤维素降解能 力，可用于抗病促生型多功能微生物肥料的制作，改善土壤理化性质，促进植物生长;连续 三次盆栽实验显示SCAU1发酵液经清水稀释后，采用灌根的方式对玉米苗表现出明显的促 生作用，能够明显提高玉米苗期的根数、根长、株高、叶片数量和叶面积；以烤烟为供试植 物，进行SCAU1的大田实验，结果显示该菌能提高烤烟云87团棵期的茎粗、株高、叶面积系 数，提高烤烟的产量和钾含量。本发明的赖氨酸芽孢杆菌，具有较广泛的抗菌作用，同时能 促进植物生长，具有"肥药"兼效功能，使用该菌制成的发酵菌剂对于在农业种植业中减少 化学肥料和农药施用具有重要意义;菌株具有广泛的抗菌活性，高效纤维素降解能力，同时 产生IAA，对植物具有明显的促进生长作用，表现出多重生物学功能。该菌制作的生物肥料 能够促进玉米和烤烟等植物的生长，同时促进烤烟品质。对于在农业生产中"减肥减药"具 有潜在应用价值。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明实施例提供的双孢蘑菇内生菌的制备方法流程图。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0018] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0019] 本发明实施例的双孢蘑菇内生菌，经形态、生理、分子鉴定为赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillus fusiformis)，命名为赖氨酉爱芽抱杆菌(Lysinibacillus fusiformis) SCAU1，该菌株已于2016年3月11日湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山的中国典型培养物保 藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM2016106。
[0020] 如图1所示，本发明实施例的双孢蘑菇内生菌的制备方法包括以下步骤：
[0021] S101:双孢蘑菇子实体选择，采集田间露地栽培的双孢蘑菇，品种为川农蘑菇3号， 子实体燕型正常、无病虫害、八分成熟；
[0022] S102:双孢蘑菇内生细菌的分离，取新鲜双孢蘑菇样品，利用97%酒精表面消毒。 用无菌解剖刀去掉子实体表皮，用无菌镊子取绿豆大小的内部组织，接于NB和ISP4培养基 平板中，以最后一遍的洗涤水作对照，以检测表面消毒是否彻底；
[0023] S103:在28°C倒置培养4-5d，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取单菌落并 进行划线纯化。通过分离，共获得46株菌落形态各不相同的菌株。
[0024] 下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0025] (一)赖氨酸芽抱杆菌(Lysinibacillus fusiformis)SCAUl菌株筛选
[0026] 1、双孢蘑菇子实体选择
[0027]采集田间露地栽培的双孢蘑菇，品种为川农蘑菇3号，子实体菇型正常、无病虫害、 八分成熟。
[0028] 2、双孢蘑菇内生细菌的分离
[0029]取步骤1中的新鲜双孢蘑菇样品，利用97%酒精表面消毒。用无菌解剖刀去掉子实 体表皮，用无菌镊子取绿豆大小的内部组织，接于NB和ISP4培养基平板中，以最后一遍的洗 涤水作对照，以检测表面消毒是否彻底。在28°C倒置培养4-5d，根据菌落大小、形态和色泽 等表观特征挑取单菌落并进行划线纯化。通过分离，共获得46株菌落形态各不相同的菌株。 [0030] 3、内生细菌产吲哚乙酸（IAA)测定
[0031]将步骤2中的46株菌培养到对数期，取菌液50μ1于含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体 培养基中（约3ml)中，重复3次，28 °C 140r/min振荡培养1.5天，取50μ1于洗净的白瓷板中， 加 100μΙ显色剂，25°C下避光30min，如果出现粉红色，表明产生ΙΑΑ，以没有接菌的含0.5g/L 色氨酸的牛肉膏液体培养基为对照。
[0032]将产吲哚乙酸的内生细菌继续在含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基中培养24-48h后，8000r/min离心5min，取上清液2ml加入4ml Salkowski显色剂，25°C下避光30min后， 530nm下测定吸光度值。以空白培养基作对照，并以IAA的标准样品对应的光密度做标准曲 线，计算IAA的产量(mg/L)。
[0033] 46株菌中有36株产生IAA，产量大于40mg/L的菌株有6株，其中SCAU1菌株IAA产量 最高，为 53.4mg/L。
[0034] 4、菌株溶磷测定
[0035] 将步骤2中的菌株用无菌牙签点接种于含磷酸钙的固体培养基上，然后倒置于28 °C恒温培养箱中培养7d，记录菌株溶磷圈直径HD值及菌落直径⑶值，并计算其比值。46株菌 中有19株具溶磷能力，并且有5株表现较好的溶磷效果(HD/CD>2)，其中SCAU1的HD/CD值约 2.1〇
[0036] 5、产纤维素酶测定
[0037]将步骤2中的菌株点种于羧甲基纤维素钠培养基平板上，30°C培养2d，用lmg/mL的 刚果红溶液侵染lh，再用lmol/L的NaCl溶液脱色lh，倒入lmol/L的HC1使背景呈蓝色而使透 明圈更加明显，记录透明圈直径HD值与菌落直径CD值并计算其比值。46株菌中有29株具纤 维素酶活，SCAU1的HD/⑶值约1.8。
[0038] 6、菌株抑菌能力测定
[0039]以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、玉米弯孢病菌、玉米纹枯病菌、西瓜枯黄病菌和番 茄早疫病菌为供试病原菌，通过平板拮抗测定分离菌株对病原菌的抑制作用。记录HD值与 CD值并计算其比值。46株供试内生细菌中有4株对上述6种病原菌均表现出抑制效果，其中 SCAU1对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的HD/CD值分别为3.4和4.2，对玉米弯孢病菌、玉米纹 枯病菌、西瓜枯黄病菌和番茄早疫病菌的HD/CD值介于约1.2~2.1。
[0040] 7、SCAU1发酵液的准备
[0041 ] 将上述步骤中筛选得到的赖氨酸芽孢杆菌(1^8；[11；^3(3；[11118；1^18丨；1^01'111丨8)30八1]1 活化后接种于LB肉汤培养液中，30°C，120r/min的恒温摇床中培养，培养36h后，作为种子液 以1:1比例加入含有葡萄糖的LB肉汤培养基，30°C，120r/min的恒温摇床中培养36h使其活 菌数达到10亿以上，取出备用。
[0042] 8、玉米盆栽应用
[0043]供试玉米品种为川单13,将按一定比例稀释的SCAU1菌株的发酵液采用灌根的方 式进行玉米苗的接菌处理，以无菌水作对照，培养60后测定玉米苗相关指标。
[0044]表1玉米苗在各处理中的形态指标
[0045]
[0046]从表1可以看出，不同浓度SCAU1菌株的发酵液稀释物对玉米苗的根数、根长、株 高、叶片数和叶绿素含量均表现出促进作用。
[0047] (二)赖氨酸芽抱杆菌(Lysinibacillus fusiformis)SCAUl菌株田间应用
[0048] 1、SCAU1液体菌剂制作
[0049]①斜面菌种（一级种）：牛肉膏蛋白胨斜面培养基（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂 17g，水1000mL，pH约7 · 2)，接种赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis) SCAU1后在30°C下培养36小时制成一级种子。
[0050] ②液体菌种(二级种）：肉汤培养基（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL) 经高压灭菌后，按200mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制）装瓶，在无菌状态接种赖氨 酸芽孢杆菌SCAU1斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度27-29°C，初始pH值7.0，120r/min 振荡培养36h，制成赖氨酸芽孢杆菌SCAU1液体种子。
[0051] ③液体发酵:营养肉质培养液(玉米粉6g/L、豆柏17g/L、氯化钠10g/L)经高压灭菌 后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种SCAU1液体种子， 接种量10%(体积比），温度27-29°(：，初始?田直7.5，125以1^11振荡培养7211，制成5041]1液体 菌剂。
[0052] ④制剂保存：菌剂无菌条件下常温保存半年或低温(4度）1年半不影响其促生效 果。
[0053] 2、SCAU1菌剂田间应用 [0054] 供试植物:烤烟云87。
[0055]将按一定比例稀释SCAU1菌株发酵液，在烤烟苗移栽的时候，将SCAU1进行烤烟灌 根处理，以无菌水作对照，于烤烟生长的团棵期和打顶期进行烤烟农艺性状的测定(表2和 表3)。
[0056]表2 SCAU1菌剂对烤烟团棵期农艺性状的影响
[0057]
[0058] 在云烟87的团棵期，SCAU1菌剂200倍以内的各稀释液均可以有效提高烤烟的株高 和叶片数等农艺性状指标。
[0059] 表3 SCAU1菌剂对烤烟打顶期农艺性状的影响
[0060]
[0061 ]在云烟87的打顶期，SCAU1菌剂200倍以内的各稀释液同样可 [0062]以有效提高烤烟的株高、叶片数、节距和茎围等农艺性状指标。以上所述仅为本发 明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修 改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种双孢蘑菇内生菌，其特征在于，所述双孢蘑菇内生菌为赖氨酸芽孢杆菌，命名为 赖氨酸芽孢杆菌SCAU1，保藏编号为CCTCCM2016106。2. -种如权利要求1所述双孢蘑菇内生菌的分离方法，其特征在于，所述分离方法选取 未开伞的双孢蘑菇子实体，进行赖氨酸芽孢杆菌的分离。3. -种如权利要求1所述双孢蘑燕内生菌的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包 括:对赖氨酸芽孢杆菌SCAUl进行抗菌活性、IAA产生量、溶磷特性、产纤维素酶特性进行分 析。4. 一种利用如权利要求1所述双孢蘑菇内生菌制备的发酵液。5. 如权利要求4所述的发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括:将筛选得 到的赖氨酸芽孢杆菌SCAUl活化后接种于LB肉汤培养液中，30°C，120r/min的恒温摇床中培 养，培养36h后，作为种子液以1:1比例加入含有葡萄糖的LB肉汤培养基，30°C，120r/min的 恒温摇床中培养36h使其活菌数达到IO亿以上，取出备用。6. -种利用如权利要求1所述双孢蘑菇内生菌制备的赖氨酸芽孢杆菌SCAUl菌液体菌 剂。7. -种如权利要求4所述发酵液在玉米盆栽的应用。8. 如权利要求7所述玉米盆栽的应用，其特征在于，将按50-200比例稀释的SCAUl菌株 的发酵液采用灌根的方式进行玉米苗的接菌处理。9. 一种如权利要求4所述发酵液在烤烟的应用。10. 如权利要求9所述的烤烟的应用，其特征在于，将按50-200比例稀释SCAUl菌株发酵 液，在烤烟苗移栽时，将SCAUl进行烤烟灌根处理。
【文档编号】C12N1/20GK105907671SQ201610280630
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】辜运富, 陈小敏, 陈强, 张小平, 余秀梅, 赵珂, 谢强
【申请人】四川农业大学