一种复合微生态制剂的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种复合微生态制剂的制备方法及其应用，将处于对数期的芽孢杆菌和抗菌肽酵母培养发酵液等体积混合，添加低聚木糖和β?葡聚糖混匀，以脱脂乳为基本基质，添加海藻糖制备悬浮液，真空冷冻干燥后，制得复合微生态制剂。所得的复合微生态制可以抑制石斑鱼、半滑舌鳎体内有害致病菌的生长，促进石斑鱼、半滑舌鳎的生长，提高水产幼苗存活率和长期存活率，提高幼苗存活率30%以上，提高生长期存活率10%?20%，可以有效地改善养殖水体微环境，帮助水产生物对营养物质进行消化吸收。
【专利说明】
一种复合微生态制剂的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物制剂领域，具体涉及一种复合微生态制剂的制备方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 微生态制剂包括含有活菌和/或死菌及其组分和产物的制剂，可经口或其他黏膜 途径投放，旨在改善黏膜表面微生物或酶的动态平衡，或用于刺激特异性或非特异性免疫 机制。随着抗生素药物在养殖业的禁止使用，开发抗生素药物替代品应用于养殖业逐渐成 为关注热点。
[0003] 芽孢杆菌具有保湿性强、有机质分解力强、抑菌灭害力强等特点，又能产生丰富的 代谢生成物，如多种有机酸、消化酶等，可抑制有害菌、病原菌等有害微生物的生长繁殖，改 善养殖水体微环境，帮助水产生物对营养物质进行消化吸收。将芽孢杆菌应用于水产养殖 行业是解决抗生素污染问题的一个有效方案。
[0004] 经过修饰鱼类抗菌肽hepcidin和两栖动物抗菌肽maginin所组成的融合蛋白抗菌 肽酵母是一种具有抗菌、免疫功能并以基因工程构建的新型饲料添加剂。
[0005] 将芽孢杆菌和抗菌肽酵母复合发酵制成的微生态制剂运用到水产养殖业替代抗 生素将具有重大的经济和社会意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种复合微生态制剂的制备方法及其应用。所得的复合微 生态制可以抑制石斑鱼、半滑舌鳎体内有害致病菌的生长，促进石斑鱼、半滑舌鳎的生长， 提高水产幼苗存活率和长期存活率，提高幼苗存活率30%以上，提高生长期存活率10%_20%， 可以有效地改善养殖水体微环境，帮助水产生物对营养物质进行消化吸收。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种复合微生态制剂的制备方法，具体包括以下步骤： (1) 芽孢杆菌和抗菌肽酵母的培养:将芽孢杆菌和抗菌肽酵母种子分别从试管斜面培 养基中接种到接有液体培养基的锥形瓶，置于摇床中，摇床转速150-250r/min，于25 °C下培 养3天； (2) 将步骤（1)中处于对数期的芽孢杆菌及抗菌肽酵母分别接种到发酵培养基中进行 发酵，发酵温度为25 °C，发酵时间为48h; (3) 将步骤(2)所得的处于对数期的芽孢杆菌和抗菌肽酵母培养发酵液等体积混合，加 入低聚木糖和葡聚糖混匀，低聚木糖和葡聚糖在混合液中浓度均为2.0g · I/1，继续添 加20wt%脱脂乳作为基本基质，并添加5wt%海藻糖，搅拌均匀后得到悬浮液，将所得悬浮液 真空冷冻干燥后，制得复合微生态制剂。
[0008] 步骤（1)中所述的液体培养基的配方为:蛋白胨5g、酵母粉lg、磷酸高铁O.Olg和蒸 馏水 lL;pH值 7.6-7.8，121°C 灭菌 15-20min。
[0009] 步骤(2)中的发酵培养基的配方为:可溶性淀粉3-3.5g、蛋白胨10-12g、酵母膏3_ 5g、KH2P〇4 1.5-4g、KHP〇4 2-4g、MgS〇4 0·卜lg、ZnCl2 卜3g、蒸馏水lL;pH值7·4-7·6，12?Γ 灭菌 15_20min。
[0010] 根据本发明的制备方法制得的复合微生态制剂应用于石斑鱼、半滑舌鳎养殖中。 [0011]芽孢杆菌具有优良的产酶能力，且在低温条件下，产酶能力没有明显下降。添加芽 孢杆菌的饲料可以显著增加石斑鱼、半滑舌鳎的体重。
[0012]抗菌肽酵母表达抗菌肽含量大于200yg/g，是一种蛋白质含量高、营养丰富、富含 动物抗菌肽的绿色无污染酵母饲料添加剂。
[0013]本发明制备的复合微生态制剂，复合发酵后菌株浓度达到5X109CFU/mL以上，干 燥后产品中活菌数达1亿以上，抗菌肽酵母菌、粗蛋白多30%、抗菌肽含量>200yg/g，适宜饵 料粒径在4-20μηι左右;将芽孢杆菌与抗菌肽酵母混合，能起到功能性协同作用，能够有效的 促进石斑鱼、半滑舌鳎的生长。
[0014] 本发明的有益效果在于:本发明所得的复合微生态制剂用于水产养殖饲料直接投 入养殖水体中，可以抑制石斑鱼、半滑舌鳎体内有害致病菌的生长，促进石斑鱼、半滑舌鳎 的生长，提高水产幼苗存活率和长期存活率，提高幼苗存活率30%以上，提高生长期存活率 10%-20%，可以有效地改善养殖水体微环境，帮助水产生物对营养物质进行消化吸收。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
[0016] 实施例1 一种复合微生态制剂的制备方法，具体包括以下步骤： (1) 芽孢杆菌和抗菌肽酵母的培养:将芽孢杆菌和抗菌肽酵母种子分别从试管斜面培 养基中接种到接有液体培养基的锥形瓶，置于摇床中，摇床转速150r/min，于25°C下培养3 天； (2) 将步骤（1)中处于对数期的芽孢杆菌及抗菌肽酵母分别接种到发酵培养基中进行 发酵，发酵温度为25 °C，发酵时间为48h; (3) 将步骤(2)所得的处于对数期的芽孢杆菌和抗菌肽酵母培养发酵液等体积混合，加 入低聚木糖和葡聚糖混匀，低聚木糖和葡聚糖在混合液中浓度均为2.0g · I/1，继续添 加20wt%脱脂乳作为基本基质，并添加5wt%海藻糖，搅拌均匀后得到悬浮液，将所得悬浮液 真空冷冻干燥后，制得复合微生态制剂。
[0017]步骤(1)中所述的液体培养基的配方为:蛋白胨5g、酵母粉lg、磷酸高铁O.Olg和蒸 馏水 lL;pH值7.6，121°C 灭菌 20min。
[0018] 步骤（2)中的发酵培养基的配方为：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、酵母膏3g、KH2P04 1.5g、KHP〇4 2g、MgS〇4 0.1g、ZnCl2 lg、蒸馏水lL;pH值7.6，121°C灭菌 15min。
[0019] 实施例2 一种复合微生态制剂的制备方法，具体包括以下步骤： (1)芽孢杆菌和抗菌肽酵母的培养:将芽孢杆菌和抗菌肽酵母种子分别从试管斜面培 养基中接种到接有液体培养基的锥形瓶，置于摇床中，摇床转速200r/min，于25°C下培养3 天； (2) 将步骤（1)中处于对数期的芽孢杆菌及抗菌肽酵母分别接种到发酵培养基中进行 发酵，发酵温度为25 °C，发酵时间为48h; (3) 将步骤(2)所得的处于对数期的芽孢杆菌和抗菌肽酵母培养发酵液等体积混合，加 入低聚木糖和葡聚糖混匀，低聚木糖和葡聚糖在混合液中浓度均为2. Og · I/1，继续添 加20wt%脱脂乳作为基本基质，并添加5wt%海藻糖，搅拌均匀后得到悬浮液，将所得悬浮液 真空冷冻干燥后，制得复合微生态制剂。
[0020] 步骤（1)中所述的液体培养基的配方为:蛋白胨5g、酵母粉lg、磷酸高铁O.Olg和蒸 馏水 lL;pH值7.7，121°C 灭菌 18min。
[0021] 步骤(2)中的发酵培养基的配方为:可溶性淀粉3.2g、蛋白胨llg、酵母膏4g、KH2P04 2.5g、KHP〇4 3g、MgS〇4 0.6g、ZnCl2 2g、蒸馏水lL;pH值7.5，121°C灭菌 18min。
[0022] 实施例3 一种复合微生态制剂的制备方法，具体包括以下步骤： (1) 芽孢杆菌和抗菌肽酵母的培养:将芽孢杆菌和抗菌肽酵母种子分别从试管斜面培 养基中接种到接有液体培养基的锥形瓶，置于摇床中，摇床转速250r/min，于25°C下培养3 天； (2) 将步骤（1)中处于对数期的芽孢杆菌及抗菌肽酵母分别接种到发酵培养基中进行 发酵，发酵温度为25 °C，发酵时间为48h; (3) 将步骤(2)所得的处于对数期的芽孢杆菌和抗菌肽酵母培养发酵液等体积混合，加 入低聚木糖和葡聚糖混匀，低聚木糖和葡聚糖在混合液中浓度均为2.0g · I/1，继续添 加20wt%脱脂乳作为基本基质，并添加5wt%海藻糖，搅拌均匀后得到悬浮液，将所得悬浮液 真空冷冻干燥后，制得复合微生态制剂。
[0023]步骤(1)中所述的液体培养基的配方为:蛋白胨5g、酵母粉lg、磷酸高铁O.Olg和蒸 馏水 lL;pH值7.8，121°C 灭菌 20min。
[0024] 步骤(2)中的发酵培养基的配方为:可溶性淀粉3.5g、蛋白胨12g、酵母膏5g、KH2P04 4g、KHP〇4 4g、MgS〇4 lg、ZnCl2 3g、蒸馏水lL;pH值7.6，121°C灭菌20min。
[0025] 性能测试 测试1:芽孢杆菌的耐酸、耐碱、耐温试验 耐酸碱能力:芽孢杆菌菌液分别在pH为3·0、4·0、5·0、6·0、7·0、8·0、9·0、10·0、11·0 的液体LB存放5h，通过紫外分光光度计测存活率。
[0026]表1芽孢杆菌耐酸度试验
耐温能力:在90°C恒温水浴处理30分钟，测菌种的存活率。
[0027] 试验结果:芽孢杆菌的存活率为65%。
[0028]测试2:复合菌剂稳定性试验 复合微生态制剂在常温下避光保存0个月、1个月、2个月、3个月后，分别取样检测菌剂 中的芽孢杆菌及酵母含量。
[0029] 表2稳定性试验
测试3:对幼苗存活率的影响 将石斑鱼幼苗和半滑舌鳎都分为两组，每组100尾，试验组添加了本发明制得的复合微 生态制剂，对照组为常规饲料，不添加任何菌剂。
[0030]表3复合微生态制剂对幼苗存活率的试验
测试4:对石斑鱼、半滑舌鳎肠道致病菌的影响 抑菌圈试验：取培养4天的复合发酵液至离心管中，12000rad，4°C离心20min。取上清 液，再次离心，再取上清液。把收集到的上清液过〇.22um的筛，重复三遍。用海洋致病弧菌弗 尼斯做指示菌，将收集到的无菌上清液做培养皿抑菌试验。
[0031 ]试验结果:抑菌圈直径为2.6cm，表明复合微生态制剂发酵产生的次级代谢产物对 海洋致病弧菌具有强抑制效果。应用到石斑鱼、半滑舌鳎水产养殖中，可抑制石斑鱼、半滑 舌鳎肠道中致病菌的生长和繁殖，提高石斑鱼、半滑舌鳎存活率。
[0032]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种复合微生态制剂的制备方法，其特征在于:具体包括以下步骤： (1) 芽孢杆菌和抗菌肽酵母的培养:将芽孢杆菌和抗菌肽酵母种子分别从试管斜面培 养基中接种到接有液体培养基的锥形瓶，置于摇床中，摇床转速150-250r/min，于25 °C下培 养3天； (2) 将步骤（1)中处于对数期的芽孢杆菌及抗菌肽酵母分别接种到发酵培养基中进行 发酵，发酵温度为25 °C，发酵时间为48h; (3) 将步骤(2)所得的处于对数期的芽孢杆菌和抗菌肽酵母培养发酵液等体积混合，加 入低聚木糖和葡聚糖混匀，低聚木糖和葡聚糖在混合液中浓度均为2. Og · I/1，继续添 加20wt%脱脂乳作为基本基质，并添加5wt%海藻糖，搅拌均匀后得到悬浮液，将所得悬浮液 真空冷冻干燥后，制得复合微生态制剂。2. 根据权利要求1所述的一种复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（1)中所 述的液体培养基的配方为:蛋白胨5g、酵母粉lg、磷酸高铁0.0 lg和蒸馏水1L; pH值7.6-7.8， 121 °C 灭菌15_20min。3. 根据权利要求1所述的一种复合微生态制剂的制备方法，其特征在于:步骤(2)中的 发酵培养基的配方为：可溶性淀粉3_3.5g、蛋白胨10-12g、酵母膏3-5g、KH 2P〇4 1.5-4g、 KHP〇4 2-4g、MgS〇4 0.1-lg、ZnCl2 l_3g、蒸馏水lL;pH值7·4-7·6，12Γ(：灭菌 15-20min。4. 一种如权利要求1所述的制备方法制得的复合微生态制剂。5. -种如权利要求1所述的制备方法制得的复合微生态制剂的应用，其特征在于:所制 得的复合微生态制剂应用于石斑鱼和半滑舌鳎养殖中。
【文档编号】C12N1/19GK105907674SQ201610288109
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】陈宪, 李智, 杨明, 艾佳敏, 黄巧丽, 陈小雅, 陈志鸿
【申请人】福州大学