一种分离培养脐静脉血管内皮细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域的成体细胞的分离培养领域,尤其涉及一种分离培养脐静脉血管内皮细胞的方法：将脐静脉从华通胶中完全剥离出来；将脐静脉沿一侧纵向剪开，使其由管状变为长方形血管壁面，漂洗；加入Ⅱ型胶原酶进行消化；消化完成后将血管取出漂洗，漂洗液与酶解液混合，离心弃上清，使用培养基进行培养。本发明的细胞分离方法操作简单，单人可独立进行，且红细胞污染较少，可细胞接种后72h再进行换液，细胞贴壁效率更高；原代所得到的血管内皮细胞数量多，P3细胞CD31阳性表达可达95%以上，且在分离制备血管内皮细胞同时不影响脐带间充质干细胞的制备，可充分利用实验材料。
【专利说明】
_种分禹培养脐静脉血管内皮细胞的方法
技术领域
[0001]
本发明涉及生物技术领域的成体细胞的分离培养领域，尤其涉及一种分离培养脐静脉血管内皮细胞的方法。
【背景技术】
[0002]
血管是人体内循环系统的主体，而整个血管的内表面都是由一层内皮细胞所覆盖的。由于内皮细胞能够本身直接与血液接触，所以它们可以通过多种途径在血压调节，凝血和纤溶，炎性细胞的黏附和迀移，以及血管形成等生理、病理过程中发挥重要作用。
[0003]在细胞研究中，血管内皮细胞是常用的体外实验用细胞，而利用人来源的血管内皮细胞进行的研究大多数是以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcellS，HUVEC)为材料来进行的。之所以主要选择脐带作为内皮细胞的取材来源，一方面，是由于脐带作为分娩过程中的废弃物，来源丰富，容易获取;另一方面，脐带血管没有分支，便于操作，而且有着理想的长度，能够保证细胞的足量收集。
[0004]经典的脐静脉血管内皮细胞的分离方法为胶原酶灌注消化法，最早是JaffeEA等在 1973年提出来的[Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, et al.J Clin Invest, 1973,52(11): 2745-2756]，至今被人们广泛使用，另外还有机械刮取法等相关方法。
[0005]通过灌注消化法获得脐静脉血管内皮细胞的成功率较高，但是灌注操作有一些缺点:首先，在灌注法进行脐静脉血管内皮细胞的分离过程中，需要将无菌管插入脐静脉管腔内并在这一端使用止血钳或其它方法进行固定，然后使用PBS清洗并使用酶进行灌注消化来获得细胞。但是由于脐静脉管腔较小且比较黏滑，单人进行插管操作比较困难；同时如果固定不牢，在清洗和灌注过程中容易造成漏液，从而影响实验效果且造成试剂浪费，影响清洗和消化效果;在血管中有淤血或无菌管固定不牢的情况下，再次在冲洗时无法完全冲洗干净，容易混入血管中的血液，造成红细胞残留过多，影响血管内皮细胞贴壁效果；另外在进行酶消化过程中，因为较难密闭操作，所以很难实现37°C进行无菌消化过程，影响了酶的消化效率。
[0006]通过机械刮取法获取脐静脉血管内皮细胞，主要通过机械作用力使细胞脱离，容易造成细胞机械损伤，因此采用度不高。
【发明内容】
[0007]
为了解决以上现有技术中传统脐静脉血管内皮细胞的灌注消化法中存在的单人操作难度较大、容易造成漏液、易被其他细胞污染、酶用量大的问题，发明人进行综合考虑，研究出一种适合单人操作、操作相对简便、不易被污染、酶用量小的分离培养脐静脉血管内皮细胞的方法。
[0008]本发明是通过以下步骤得到的: 一种分离培养脐静脉血管内皮细胞的方法，包括以下步骤:
(1)脐带清洗后将脐静脉从华通胶中完全剥离出来；
(2)将脐静脉沿一侧纵向剪开，使其由管状变为长方形血管壁面，然后使用无菌生理盐水对血管壁进行漂洗直至漂洗液澄清无色；
(3)加入Π型胶原酶进行消化，Π型胶原酶质量体积比浓度为0.05%-0.1%，酶和脐静脉的配比为0.25-0.5mL:1cm长血管，消化时间为15_30min，消化在恒温摇床内进行，消化温度为37°C，摇床转速为120r/min;
(4)消化完成后将血管取出并使用α-ΜΕΜ培养基对血管进行漂洗，漂洗液与酶解液混合，离心后弃掉上清，使用培养基进行培养。
[0009]所述的方法，优选步骤(4)中1500r/min离心1min后离心后弃掉上清，使用培养基A重悬细胞沉淀，进行培养，3天后更换培养基为培养基B，细胞融合度达到80%后进行传代；
所述培养基A和B是向α-ΜΕΜ培养基中添加胎牛血清FBS、碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF得到的，
其中，培养基A中胎牛血清FBS的终浓度为20%，碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF的终浓度分别为20ng/m L，
培养基B中胎牛血清FBS的终浓度为10%，碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF的终浓度分别为10ng/mL。
[0010]所述的方法，优选步骤(3)中为减少血管壁平滑肌细胞等其它杂细胞的污染，Π型胶原酶的质量体积比浓度为0.05%;酶与脐静脉的配比为0.5mL:1cm长血管；消化时间为25min0
[0011 ]所述的方法，优选步骤(I)中使用无菌眼科剪将脐带一端沿脐静脉血管腔剪0.5cm左右小口，然后使用无菌敷料镊将脐带沿脐静脉方向剥开并将脐静脉完全暴露出来，将脐静脉从华通胶中完全剥离出来。
[0012]所述的方法，优选使用培养基A重悬细胞沉淀计数后以IX 1Vcm2的密度转入75cm2细胞培养瓶内，放入37°C、5%C02、饱和湿度中进行培养。
[0013]所述的方法，优选步骤(I)中细胞可传至8-10代。
[0014]所述的方法，优选步骤(3)中消化使用容器为50mL无菌离心管。
[0015]所述的方法，优选步骤(I)中脐带是24h内采集的。
[0016]有益效果:
本发明的分离内皮细胞的方法操作简单，单人可独立进行，且红细胞污染较少，可细胞接种后72h再进行换液，细胞贴壁效率更高；原代所得到的血管内皮细胞数量多，1cm脐带可得细胞2 XlO6, P3细胞⑶31阳性表达可达95%以上，且在分离制备血管内皮细胞同时不影响脐带间充质干细胞的制备，可充分利用实验材料。
【附图说明】
[0017]图1为脐静脉血管内皮细胞体外分离培养后，光学显微镜下形态，其中A为初始贴壁状态，B为长满后鹅卵石状；
图2为脐静脉血管内皮细胞体外成管能力检测结果；
图3为脐静脉血管内皮细胞流式检测结果，其中，A为CD31检测结果，B为CD34检测结果； 图4为脐静脉血管内皮细胞血管VI因子免疫荧光检测结果:图A为实验组结果，图B为阴性对照结果。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施实例I按照本方案进行脐静脉血管内皮细胞细胞的提取
该实例使用经产妇同意授权的新生儿脐带作为脐静脉血管内皮细胞的来源。
[0019]该实验用到的试剂如下:Π型胶原酶(Sigma)、α-ΜΕΜ培养基(Hyc 1ne，Cat.N0.SH30265.01B)、血管内皮生长因子VEGF(Peprotech)、成纤维细胞生长因子FGF(Peprotech)、胎牛血清 FBS(Gibco)、胰蛋白酶(Hyclone)。
[0020](I)将新生儿脐带(1cm左右)在含1%双抗的生理盐水中洗涤三次，去除表面的血污，用无菌眼科剪将脐带沿脐静脉方向剪0.5cm左右的小口，然后使用无菌敷料镊沿切口位置沿脐静脉纵向方向将脐带扒开，从而使脐静脉完全暴露出来，使用无菌敷料镊将脐静脉剥离下来；(2)使用眼科剪将血管纵向剪开管壁，从而将其由管状剪为长方形血管壁面。将血管壁用含I %双抗的生理盐水充分洗涤3-5次；
(3)然后转入50mL无菌离心管中并加入质量体积浓度为0.05%的Π型胶原酶，1cm血管使用Π型胶原酶体积为5m L，最后放入37°C恒温摇床内120r/min消化25min;
(4 )消化完成后血管使用20m L α-ΜΕΜ培养基(不含FBS、b_FGF和VEGF)漂洗，收集胶原酶和漂洗液合并后150(^/1!^11离心101^11，使用培养基厶重悬细胞沉淀，计数后以5\104/孔转入6孔板内，放入37 V、5%C02中培养。3天后更换培养基为培养基B，细胞融合度达到80%后进行传代，后续培养过程均使用培养基B。培养基A中胎牛血清FBS的终浓度为20%，碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF的终浓度分别为20ng/mL，培养基B中胎牛血清FBS的终浓度为10%，碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF的终浓度分别为10ng/mL。
[0021]在实施实例I中，1cm脐带得到初始细胞数量为2XlO5，3d后换液时漂浮细胞较少，细胞生长至80%融合度需要120h。
[0022]实施实例2胶原酶灌注法进行脐静脉血管内皮细胞细胞的提取该实验使用的试剂与实施实例I相同。
[0023]按照传统胶原酶灌注法进行脐静脉血管内皮细胞的分离，因方法较为成熟，本处不再赘述。在消化过程中，使用质量体积浓度为0.05%的Π型胶原酶消化25min，收集细胞后以5父104/孔转入6孔板内，放入37°(:、5%0)2中培养，2411后换液去除漂浮的红细胞，3天后更换培养基为培养基B，细胞融合度达到80%后进行传代，后续培养过程均使用培养基B。培养基A中胎牛血清FBS的终浓度为20%，碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF的终浓度分别为20ng/mL，培养基B中胎牛血清FBS的终浓度为10%，碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF的终浓度分别为10ng/mL。
[0024]在实施实例2中，1cm脐带得到初始细胞数量为1.6X 15，3d后换液时漂浮的红细胞多于实施实例I，细胞生长至80%融合度需要168h。
[0025]实施实例3 同实施例1相比，该实施例步骤(3)中1cm血管使用Π型胶原酶质量体积浓度为0.1%，消化时间为15min，其余同实施实例I相同。
[0026]在实施实例3中，1cm脐带得到初始细胞数量为1.8X 15，细胞生长至80%融合度需要144h。
[0027]实施实例4
同实施例1相比，该实施例步骤(3)中1cm血管使用Π型胶原酶质量体积浓度为0.1%，消化时间为25min，其余同实施实例I相同。
[0028]在实施实例4中，1cm脐带得到初始细胞数量为2.2 X 15，细胞生长至80%融合度需要120h，但在贴壁细胞中出现部分长梭形的血管平滑肌细胞，内皮细胞纯度低于90%。
[0029]实施实例5脐静脉血管内皮细胞鉴定
取实施实例I中传至第八代的细胞，进行相关鉴定实验。
[0030]1、细胞形态观察
取第八代脐静脉血管内皮细胞按照I X 15/孔接种到6孔板中，光学显微镜下观察细胞形态，初始时细胞呈梭形，铺满后呈鹅卵石状，例如实施实例I中培养的脐静脉血管内皮细胞如图1所示，符合内皮细胞的形态特征。
[0031]2、血管形成实验
1)96孔培养板板和灭菌的20-200μ1枪头置于-20°C预冷，Matrigel(BD)置于4°C冰箱内过夜融化；
2)使用预冷枪头每孔加入20μ1的Matrigel铺胶，动作迅速，避免气泡生成，然后置于37°C培养箱内孵育30min;
3)细胞悬液调整至2X105/mL，以14/孔接种于培养板中，置于37°C、5%C02饱和湿度内培养4-8小时后观察实验结果;实验结果表明，本方法中分离得到的脐静脉血管内皮细胞具有体外成血管能力(图2)。
[0032]3、流式细胞仪检测细胞表型
在三个上样管中分别加入5μ1流式抗体IgGl-PE、CD31-PE、CD34-PE(均为BD公司生产)，然后取实施实例I中第八代脐静脉血管内皮细胞调整至2 X 106/m L，每个上样管中加入100μ?细胞悬液，混匀后避光孵育15min，然后再加200μ1 PBS混匀后上机检测。实验重复检测三次，结果表明⑶31阳性率均在90%以上，⑶34阳性率均在10%以下，符合内皮细胞标准(图3 )。
[0033]4、免疫荧光检测血管VI因子抗原表达情况
O取第八代细胞接种于消毒后的盖玻片上，待细胞爬满玻片后取出，用PBS冲洗3遍，然后使用4%多聚甲醛固定20min ；
2) PB S漂洗3次，每次5m i η，加入5%的山羊血清(含有0.5%Tr i t onX-10 O )封闭，室温20min；
3)加入鼠抗人VI因子相关抗原单克隆抗体50ul(santacruz)，4°C过夜；
4)PBS溶液漂洗3次，每次3min，使用Alexa Flour? 555标记羊抗大鼠荧光二抗50ul(santa cruz)，室温下避光孵育45min;
5)PBS溶液漂洗3次，每次5min，然后加入50 ul DAPI(Sigma)，室温下避光孵育5min；
6)PBS溶液漂洗3次后封片观察，结果可见细胞浆内有颗粒状红色荧光免疫沉积物，证明血管VI因子相关抗原阳性表达(图4 )。
[0034]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种分离培养脐静脉血管内皮细胞的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)脐带清洗后将脐静脉从华通胶中完全剥离出来； (2)将脐静脉沿一侧纵向剪开，使其由管状变为长方形血管壁面，然后使用无菌生理盐水对血管壁进行漂洗直至漂洗液澄清无色； (3)加入Π型胶原酶进行消化，Π型胶原酶质量体积比浓度为0.05%-0.1%，酶和脐静脉的配比为0.25-0.5mL:1cm长血管，消化时间为15_30min，消化在恒温摇床内进行，消化温度为37°C，摇床转速为120r/min; (4)消化完成后将血管取出并使用α-ΜΕΜ培养基对血管进行漂洗，漂洗液与酶解液混合，离心后弃掉上清，使用培养基进行培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中离心后弃掉上清，使用培养基A重悬细胞沉淀，进行培养，3天后更换培养基为培养基B，细胞融合度达到80%后进行传代； 所述培养基A和B是向α-ΜΕΜ培养基中添加胎牛血清FBS、碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF得到的， 其中，培养基A中胎牛血清FBS的终浓度为20%，碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF的终浓度分别为20ng/m L， 培养基B中胎牛血清FBS的终浓度为10%，碱性成纤维细胞生长因子b-FGF和血管内皮细胞生长因子VEGF的终浓度分别为10ng/mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中Π型胶原酶的质量体积比浓度为0.05%;酶与脐静脉的配比为0.5mL:1 cm长血管；消化时间为25min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中使用无菌眼科剪将脐带一端沿脐静脉血管腔剪0.5cm左右小口，然后使用无菌敷料镊将脐带沿脐静脉方向剥开并将脐静脉完全暴露出来，将脐静脉从华通胶中完全剥离出来。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于使用培养基A重悬细胞沉淀计数后以IX 14/cm2的密度转入75cm2细胞培养瓶内，放入37°C、5%C02、饱和湿度中进行培养。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中细胞可传至8-10代。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中消化使用容器为50mL无菌离心管。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中脐带是24h内采集的。
【文档编号】C12N5/071GK105907704SQ201610336519
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】刘 东, 曲廷瑜, 张秀涛
【申请人】山东省齐鲁干细胞工程有限公司