一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，开创性地使用活检针营造了一个消化腔，不但在用活检针打开通路(即消化腔入口)时去除了脂肪组织块表面杂细胞(包膜、结缔组织等)，而且形成了一个完全在脂肪组织块内部的消化腔，使得在后续的消化过程中，酶消化液得到了最大程度的利用，同时巧妙地避免了消化过程中的污染；同时消化效果好，解决了消化不良和过度消化的问题；本发明能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的脂肪间充质干细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，具有较大的推广意义。
【专利说明】
一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方 法。
【背景技术】
[0002] 脂肪间充质干细胞是一种典型的成体干细胞。其具有分化为成熟的脂肪细胞、软 骨细胞、骨细胞、肌腱细胞和骨骼肌细胞的潜能。这些特性及其具有的发育可塑性，引起了 人们的广泛关注。脂肪间充质干细胞可应用于再生医学领域，用来替代和修复变性坏死的 组织细胞。研究表明，脂肪间充质干细胞在无血清的培养条件下，通过转化生长因子的诱导 作用，可以分化为软骨细胞。相反，在有血清的培养条件下，加入脂肪酸和地塞米松，可以将 脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞。脂肪间充质干细胞具有自我更新的能力，并且能够分 化成各种间充质组织细胞系。由于具有自我更新能力，当脂肪间充质干细胞被移植到组织 受损部位或移植到生物材料上，这些细胞可以产生合适的组织架构。
[0003] 目前，国内外已经有大量的研究者进行了哺乳动物脂肪间充质干细胞的培养和药 理学特性方面的研究，既往的研究多采用组织块培养法或者胰酶消化法。组织块消化方法 消化不均匀，常存在未能完全消化的部分，同时多次吹打对细胞损害很大；同时组织块消化 法分离的原代细胞培养时间长，且并非每一块都有细胞萌出，故细胞传代次数和最终获取 的细胞数较少，细胞种类不纯，使进一步持续深入的研究受到限制。而胰酶消化法对细胞的 损害比较大，尤其是在37度水浴的条件下，胰酶可以最大程度地发挥其消化效力，故对消化 时间和消化次数的掌控较难;过度消化会导致细胞损伤，细胞膜破损，DNA溢出。所以，以往 的研究人员会发现，消化之后的单细胞悬液非常粘稠，有时需要在消化液中加入DNA酶来打 断溢出的DNA。这样导致的结果往往是，细胞数量非常少，且活力差。另外，上述的两种方法 均存在分离过程中对污染的把控不彻底，而导致细胞或细菌等污染。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种高纯度、高活率、高活性同时低 污染的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法。
[0005] 为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：
[0006] -种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤1:脂肪组织的预处理
[0008] 清理离体的脂肪组织块，并利用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗；
[0009] 步骤2:构造消化腔
[0010] 使用活检针刺入步骤1处理后的脂肪组织块，切取部分表面组织，丢弃，形成消化 腔入口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内部脂肪组织并丢弃，造成脂 肪组织块内部的消化腔；
[0011] 步骤3:酶消化
[0012] 使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化 液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
[0013] 步骤4:分离培养脂肪间充质干细胞
[0014] 使用注射器将消化腔内消化完毕的细胞液吸出，过70um筛网，进行离心洗涤，除去 漂浮的脂肪和油脂，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到脂 肪间充质干细胞，在37 °C 5 % C02的培养箱中进行培养。
[0015]为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
[0016] 优选地，上步骤1中清理离体的脂肪组织块包括清理脂肪组织块外部的血管和结 缔组织的步骤;进一步优选地，还包括将脂肪组织块放入无菌纱布袋中的步骤。
[0017] 优选地，上述步骤2中使用的活检针为半自动或全自动活检针；更优选地，使用的 活检针为MD半自动活检针。
[0018] 优选地，上述步骤3中复合酶消化液中各个酶的浓度均为lmg/ml。
[0019] 优选地，上述步骤3中酶消化过程为使用4°C复合酶消化液注入消化腔消化4-20h; 可替换地，上述步骤3中酶消化过程也可以为使用37°C预热的复合酶消化液注入消化腔消 化10min_2h。
[0020] 优选地，上述步骤4中培养脂肪间充质干细胞的培养基为DMEM培养基。
[0021] 优选地，上述步骤4中培养脂肪间充质干细胞的培养基内还包括10%胎牛血清、 5ug/ml胰岛素及lug/ml地塞米松。
[0022]优选地，上述双抗为青链霉素。
[0023] 另一方面，本发明还提供一种利用上述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法培 养的人脂肪间充质干细胞及其相关应用。
[0024] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0025] 首先，在分离脂肪间充质干细胞的过程中，本发明在分离步骤开创性地使用活检 针营造了一个消化腔，不但在用活检针打开通路(即消化腔入口）时去除了脂肪组织块表面 杂细胞(包膜、结缔组织等），而且形成了一个完全在脂肪组织块内部的消化腔，使得在后续 的消化过程中，复合酶消化液得到了最大程度的利用，同时巧妙地避免了消化过程中的污 染。
[0026] 其次，本发明在消化的过程中，在消化腔内部消化，使用注射器将消化后的液体吸 出，这就意味着，吸出的细胞必定是消化完全的细胞，不存在组织块消化法中消化不完全的 问题，同时本发明控制了消化的时间和温度，又是在整个组织块内部向外消化，故也杜绝了 胰酶消化法存在的消化过度的问题。
[0027] 再次，本发明的分离培养方法自始至终均无需吹打，最大限度地保护了脂肪间充 质干细胞的活力，使得培养得到的细胞活率高，活性好。
[0028] 最后，本发明消化采用特殊制备的复合酶消化液，复合酶消化液由I型胶原酶、II 型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶组成，消化效果好，消化更均匀透彻。
[0029]综上所述，本发明的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，能够获得高纯度、 高活率、高活性同时污染风险极低的脂肪间充质干细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高， 具有较大的推广意义。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明的分离培养方法得到的人脂肪间充质干细胞显微照片(4X)。
【具体实施方式】
[0031] 本发明提供了一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
[0032] -种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
[0033] 步骤1:脂肪组织的预处理
[0034]清理离体的脂肪组织块，并利用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗；
[0035]步骤2:构造消化腔
[0036]使用活检针刺入步骤1处理后的脂肪组织块，切取部分表面组织，丢弃，形成消化 腔入口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内部脂肪组织并丢弃，造成脂 肪组织块内部的消化腔；
[0037]步骤3:酶消化
[0038] 使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化 液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
[0039] 步骤4:分离培养脂肪间充质干细胞
[0040] 使用注射器将消化腔内消化完毕的细胞液吸出，过70um筛网，进行离心洗涤，除去 漂浮的脂肪和油脂，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到脂 肪间充质干细胞，在37 °C 5 % C02的培养箱中进行培养。
[0041 ]下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0042] 实施例1
[0043]本实施例采用手术切下的脂肪块为例，提取脂肪间充质干细胞，具体步骤和操作 如下：
[0044] 步骤1:脂肪组织的预处理
[0045]清理离体的脂肪组织块，清理离体的脂肪组织块包括清理脂肪组织块外部的血管 和结缔组织，并利用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗，然后将组织块放进无菌纱布 袋，纱布袋上部留有活检针刺入口；
[0046]步骤2:构造消化腔
[0047]使用MD半自动活检针刺入步骤1处理后的脂肪组织块，切取部分表面组织，丢弃， 形成消化腔入口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内部脂肪组织并丢 弃，造成脂肪组织块内部的消化腔，消化腔大小视组织块大小和需要采取的细胞量而定； [0048] 步骤3:酶消化
[0049] 使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化 液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶，4°C消化过 夜(条件允许可以使用将组织块放入培养皿，然后将培养皿置于摇床轻微震荡过夜）；
[0050] 步骤4:分离培养脂肪间充质干细胞
[0051] 使用注射器将消化腔内消化完毕的细胞液吸出，过70um筛网，进行离心洗涤，除去 漂浮的脂肪和油脂，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到脂 肪间充质干细胞，用0.2 %台盼兰计数活细胞数，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为 0.5*106/瓶。置于37度，5%C0 2的培养箱中进行培养。为了进一步去除脂肪细胞，接种48小时 后，将悬浮于培养液中的细胞吸除，更换新的培养液，这样便可以培养瓶中获得纯化的人脂 肪间充质干细胞。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况，至细胞融合 度达70 %~80 %，进行传代培养。
[0052]步骤5:传代培养
[0053] 当细胞融合度达70 %~80 %时，每瓶细胞加0.25 %胰酶-EDTA 1ml，在37度培养箱 中孵育消化5~10分钟。显微镜下观察，当细胞变圆、间隙增大时，用含血清的培养基终止消 化，并将细胞吹打下来。400g离心5分钟，获得的细胞再加入新的培养基，接种于T25培养瓶 中，接种密度为0.5*10 6/瓶。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况。 [0054] 步骤6:细胞形态观察
[0055] 使用显微镜观察细胞形态，如图1所示，分离得到的乳腺细胞胞浆饱满、细胞形态 良好、活力较高。
[0056] 步骤7:其他情况统计
[0057] 培养期间测定细菌及真菌污染情况、细胞污染情况、统计细胞活率等。
[0058] 对比实施例
[0059] 对比实施例采用传统的组织块消化法，无菌条件下获得脂肪组织，分离去除脂肪 组织表面的结缔组织包膜及血管。将取下的脂肪组织在无菌操作下剪碎，并使用II胶原酶 37°C消化2h，使用缓冲液吹打组织，分散细胞，过筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次 离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到脂肪间充质干细胞，细胞计数后，加入到T25 培养瓶中进行培养，接种密度为〇.5*10 6/瓶，置于37度，5%C02的培养箱中进行培养并观察 和测定相关指标。测定细胞污染、细菌污染等情况。
[0060] 上述的实施例和对比例实验，
【申请人】进行了多次实验，并进行了相关指标的比较 和数据统计。如表1所示：
[0061] 表 1
[0062]
[0063] 综上所述，本发明的一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，能够获得高纯度、 高活率、高活性同时污染风险极低的脂肪间充质干细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高， 具有较大的推广意义，为以脂肪间充质干细胞培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培 养解决方案。
[0064] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1:脂肪组织的预处理 清理离体的脂肪组织块，并利用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗； 步骤2:构造消化腔 使用活检针刺入步骤1处理后的脂肪组织块，切取部分表面组织，丢弃，形成消化腔入 口；更换活检针，通过消化腔入口，以不同角度多次切取内部脂肪组织并丢弃，造成脂肪组 织块内部的消化腔； 步骤3:酶消化 使用注射器将复合酶消化液从消化腔入口注入消化腔进行消化，其中复合酶消化液中 包括质量比为1: 1: 1:1的I型胶原酶、Π 型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶； 步骤4:分离培养脂肪间充质干细胞 使用注射器将消化腔内消化完毕的细胞液吸出，过70um筛网，进行离心洗涤，除去漂浮 的脂肪和油脂，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到脂肪间 充质干细胞，在37 °C 5 % CO2的培养箱中进行培养。2. 根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤 1中清理离体的脂肪组织块包括清理脂肪组织块外部的血管和结缔组织的步骤。3. 根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤 2中使用的活检针为半自动或全自动活检针。4. 根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤 3中复合酶消化液中各个酶的浓度均为lmg/ml。5. 根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤 3中酶消化过程为使用4°C复合酶消化液注入消化腔消化4-20h。6. 根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤 3中酶消化过程为使用37°C预热的复合酶消化液注入消化腔消化10min-2h。7. 根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤 4中培养脂肪间充质干细胞的培养基为DMEM培养基。8. 根据权利要求7所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤 4中培养脂肪间充质干细胞的培养基内还包括10%胎牛血清、5ug/ml胰岛素及lug/ml地塞 米松。9. 根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述双抗 为青链霉素。10. -种根据权利要求1-9任意一项所述的人脂肪间充质干细胞的分离培养方法所培 养的人脂肪间充质干细胞。
【文档编号】C12N5/0775GK105907710SQ201610293918
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】何红葖
【申请人】何红葖