一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n1078f及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体N1078F及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。本发明将米根霉的丙酮酸羧化酶的N1078位点突变成了苯丙氨酸，得到的突变体酶活提高了16.5％。在敲除PDC1和ADH1的基础上敲除基因FUM1，同时过量丙酮酸羧化酶突变体N1078F，发现延胡索酸产量提高了20.5％。该发明有效强化了碳代谢流由丙酮酸进入延胡索酸的合成途径，为构建工程酵母高效生产延胡索酸及其它二元羧酸创造了条件，具有很好的工业应用价值和前景。
【专利说明】
一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体N1078F及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体N1078F及其应用，属于遗传工 程和发酵工程领域。
【背景技术】
[0002] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有:遗传 信息丰富，代谢改造操作方便;营养需求简单，分离提取工艺成本低廉;在低pH条件下(甚至 口!1〈3.0)生长良好 ；能够耐受高浓度的底物；被？04认证为61^3(66116^11^8&^6(1八8 Safe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产羧酸(乳酸、丙酮酸、苹果酸、延 胡索酸、琥珀酸、α_酮戊二酸等)的潜在最适微生物。然而，酿酒酵母在高浓度糖及通风的条 件分批发酵产生大量的乙醇，对于以羧酸为目标产物来说，乙醇的大量积累使得碳流大量 的损失，且酿酒酵母本身不具备羧酸的合成途径。通过弱化乙醇途径中的关键酶的活性，可 以减少通往乙醇的碳代谢流，从而减少碳流的损失;在此基础上，可通过阻止或弱化目标羧 酸的进一步代谢，来构建目标羧酸的合成途径。
[0003] 丙酮酸羧化酶的作用是将丙酮酸转化为草酰乙酸，进而可将碳流引入到目标羧酸 的合成途径，因此，丙酮酸羧化酶的作用可形象地描述为"生物阀门"，如何强化丙酮酸羧化 反应，将碳流更有效地引入到目标羧酸的合成途径，成为代谢工程改造酿酒酵母生产羧酸 的一个关键问题。已有研究表明细胞中丙酮酸羧化酶活性的高低对苹果酸、琥珀酸、谷氨酸 的积累有着重要作用。任何以二元羧酸为目标产物的酿酒酵母发酵工艺，都将面临同样一 个问题:如何强化丙酮酸羧化反应，促进碳流由丙酮酸流向目标羧酸的合成途径？
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种提高丙酮酸羧化酶活性的方法，为代谢工程 改造酿酒酵母高效生产延胡索酸及其它二元羧酸打下基础(注:丙酮酸羧化酶在酿酒酵母 高效生产二元羧酸中的共同作用是将碳流由丙酮酸引入到目标产物的合成途径）。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种丙酮酸羧化酶突变体，所述突变体是在氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示的亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基础上，对第1078位的氨基酸进行了 突变。
[0006] 所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是将第1078位的天冬酰胺突变成为苯 丙氨酸。
[0007] 编码所述亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基因，在本发明的一种实施方式中，其核苷 酸序列是SEQ ID N0.2所示的序列。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。
[0009] 所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是以酿酒酵母为宿主。
[0010] 所述酿酒酵母，在本发明的一种实施方式中，同时缺失了编码丙酮酸脱羧酶PDC1、 乙醇脱氢酶ADH1、延胡索酸酶FUM1的基因。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶基因 PDC1的核苷酸序列如Gene ID: 850733所示，乙醇脱氢酶基因 ADH1的核苷酸序列如Gene ID: 854068所示，延胡索酸酶基 因 FUM1的核苷酸序列如Gene ID:855866所示。
[0012] 本发明的第三个目的是提供一种利用表达所述突变体的基因工程菌发酵生产二 元羧酸的方法。
[0013] 所述二元羧酸，包括延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等。
[0014] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是用于促进延胡索酸的积累。
[0015] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是:将过表达丙酮酸羧化酶突变体的三基 因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN. PK^-ICAFOCIAADHIAFUMI 的种子液，接种 至发酵培养基，与28-32 °C、150-250rpm条件下进行培养。
[0016]所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是将30°C、220rpm下培养24h的基因 工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于30°C、220rpm条件下培养96h。
[0017] 本发明所提供的突变体可以应用于食品、饲料、化工、药物制备等领域。
[0018] 本发明的有益效果：（1)对米根霉的丙酮酸羧化酶的N1078位点进行饱和突变，得 到了比酶活提高的丙酮酸羧化酶突变体N1078F，其比酶活较亲本提高了 16.5%; (2)构建了 过表达丙酮酸羧化酶突变体的酿酒酵母，能够有效提高二元羧酸的产量，为高效生产延胡 索酸及其它二元羧酸创造了条件，具有很好的工业应用价值和前景;在丙酮酸脱羧酶roci、 乙醇脱氢酶ADH1和延胡索酸酶FUM1同时缺失的酵母菌的中表达RoPYC的突变体N1078F，延 胡索酸产量达到了 388.7 ± 14. lmg/L，较表达野生型的RoPYC提高了 20.5 %。
【附图说明】
[0019] 图l:R〇PYC-GFP蛋白定位观察。
[0020] 图2:丙酮酸羧化酶突变菌株的富马酸产量对比图。
[0021] 图3:RoPYC N1078F位点定点突变对丙酮酸羧化酶活性的影响。
【具体实施方式】
[0022]乙醇、残糖含量及延胡索酸的测定方法:采用高效液相色谱仪(HPLC)检测。发酵液 经处理且上清液经〇.22μπι微孔滤膜过滤后，利用RID(示差折光检测器)检测乙醇和残糖含 量，利用VWD(紫外检测器)检测延胡索酸含量，液相色谱方法如下：高效液相色谱仪为美国 Waters公司产品，型号为 1515,色谱柱为Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)。柱温：35°C ;流 动相：0.0275%(v/v)稀硫酸，经0.2 2μηι滤膜过滤并除气；流速：0.6mL/mi η;检测时间： 25min;进样量：20yL。
[0023]生物量的测定方法(Bio-Rid核酸仪）：用0.1M HC1稀释适当的倍数，设定波长为 600nm，取200yU则定其吸光值。
[0024]种子培养基:葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，去离子水容，pH自然，高压灭 菌（115°C，20min)。
[0025]发酵培养基:无氨基酵母氮源3.4g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分别添加 亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，添加碳酸钙5g/L，装液量为 40mL/250mL〇
[0026]酵母转化方法（质粒）：（1)在3mLYPD液体培养基中接入平板活化的酿酒酵母单菌 落，30 °C、220rpm培养过夜；（2)倒满EP管菌液，在4000rpm条件下进行室温lmin离心；（3)适 量无菌水水洗，在4000rpm条件下进行室温lmin离心；（4)依次加入1 ·0Μ LiAc 36yL，10mg/ mL ssDNA 10yL(ssDNA提前沸水浴5min，冰上放置5min)，质粒500ng，50%PEG 240yL，温和 混勾；（5)42°C热激30分钟；（6)在4000rpm条件下进行室温lmin离心，加 lmL无菌水水洗；（7) 4000rpm离心lmin，留适量水吹吸细胞，涂布选择性平板，30 °C培养3-5d。
[0027] 实施例1 :RoPYC在酿酒酵母中的定位
[0028] 1、TEF1 promoter 和 RoPYC 基因 0RF 克隆到pGFP33 载体
[0029]按照同源重组试剂盒原理，设计两端带有15个碱基以上与载体同源的引物，如表 1，小写字母为同源臂，大写字母为PCR引物。
[0030] 表1扩增RoPYC基因的引物
[0031]
[0032] 以 pY 1 5TEF1-RoPYC为模板（Xu e t a 1 · Fumar i c ac id produc t i on iη Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering，2012)， RoPYC-F、RoPYC-R(序列分别如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示）为引物扩增出TEFlp以及 RoPYC的0RF框(得到的PCR产物含有氨基酸序列SEQ ID NO. 1的序列），将扩增产物连接到 PGFP33载体(一种带有绿色荧光蛋白GFP的低拷贝表达载体，利用荧光显微镜观测荧光可判 断表达蛋白在细胞中的定位情况），转化大肠感受态细胞，涂布添加有氨苄青霉素的LB平 板。菌落PCR验证长出的转化子以及提质粒酶切验证，将正确的转化子进行保菌并测序，质 粒名称命名为pGFP33-RoPYC。
[0033] 2、RoPYC在酿酒酵母中的表达
[0034] 构建三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK^-ICAFOCIAADHIA FUM1 (构建方法可参考申请号201410340560.1的专利申请），将上述构建的重组质粒 pGFP33-RoPYC转化到三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-lCAroClA ADH1AFUM1，转化方法见【具体实施方式】，以期在该菌中过表达氨基酸序列为SEQ ID NO. 1的 RoPYC，进而研究其定位。
[0035] 3、RoPYC 定位研究
[0036]从SD-Ura平板上取活化的基因工程菌菌落接种于3mL SD-Ura液体培养基中，30 °C，220rpm培养过夜。取菌液500yL接入新的4.5mL SD-Ura液体培养基中。培养4h，使细胞处 于对数生长期。取lmL菌液倒入1.5mL EP管中，加入lyL DAPI染液，充分混匀，冰上避光染色 lOminjOOOrpm离心lmin，弃掉部分上清。取适量细胞制片，滴上松柏油，用Nikon80i焚光显 微镜观察。放大100倍，增益值为2.0，曝光时间Is，进行荧光检测，拍下DIC和绿色荧光、蓝色 荧光激发下的照片。每个菌株随机选取3个转化子，用荧光显微镜100X物镜观察DIC视野、 绿光及蓝光下的细胞形态，结果如图1所示，结果表明该酶定位在酿酒酵母细胞的胞质中。 [0037] 实施例2: RoPYC定点突变、表达及延胡索酸的生产
[0038]用PCR方法进行定点突变，以pY15TEFl-R〇PYC质粒为模板、含有突变位点的F和R为 引物、Takara公司高保真酶PrimeSTAR GXL进行PCR扩增出整个质粒。酶切体系包含lyL PCR 产物以及lyLDpn I酶，总体积20yL，37°C酶切过夜。酶切产物进行片段纯化。取纯化产物5yL 转化30yL感受态细胞Trans 1-T1，涂布LA平板，长出的转化子接种LA培养基，提质粒送去上 海生工测序。
[0039] 其中，用于N1078F突变的引物F(Asn)、R(Asn)(序列分别如SEQ ID N0.5、SEQ ID NO.6所示），如表2所示。
[0040] 表2定点突变引物
[0041]
[0042] 注:斜体加下划线的为突变碱基，它们对应的氨基酸在右侧。
[0043] 选择测序正确的突变体，在三基因缺失菌株Saccharomyces cerevi s iae CEN. PK2-1CAH)C1 AADH1AFUM1中过表达该突变体，得到了基因工程菌。进行发酵实验，培 养条件:将30°(：、220印111下培养2411的基因工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于30 °C、220rpm条件下培养96h。结果如图2所示，结果显示表达N1078F的工程菌产量达到了 388.7±14.111^/1^，较表达野生型的1?〇?￥(：提高了20.5%。比较了丙酮酸羧化酶突变体 N1078F及亲本酶的比酶活，结果如图3所示，突变体N1078F的比酶活增加，比亲本增加了 16.5%〇
[0044] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种丙酮酸羧化酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO. I 所示的丙酮酸羧化酶的基础上，对第1078位的氨基酸进行了突变。2. 根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将第1078位的天冬酰胺突 变成为苯丙氨酸。3. 编码权利要求1或2所述突变体的基因。4. 携带权利要求3所述基因的载体或细胞。5. 表达权利要求1或2所述丙酮酸羧化酶突变体的基因工程菌，其特征在于，以酿酒酵 母为宿主。6. 权利要求5所述的基因工程菌在食品、饲料、化工、制药领域的应用。7. 权利要求1-2任一所述突变体在食品、饲料、化工、制药领域的应用。8. -种利用权利要求1或2所述突变体促进延胡索酸积累的方法，其特征在于，是在编 码丙酮酸脱羧酶PDCl、乙醇脱氢酶ADHl和延胡索酸酶FUMl的基因同时缺失的酵母菌中，过 表达所述丙酮酸羧化酶突变体。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶基因 PDCl的核苷酸序列 如Gene ID: 850733所示，乙醇脱氢酶基因 ADHl的核苷酸序列如Gene ID: 854068所示，延胡 索酸酶基因 FUMl的核苷酸序列如Gene ID: 855866所示。10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将过表达丙酮酸羧化酶突变体的三基因 缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN·Pk^-ICAF1DCIAADHlAFUMl的种子液，接种至 发酵培养基，与28-32 °C、150-250rpm条件下进行培养。
【文档编号】C12N1/19GK105907730SQ201610308734
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】徐国强, 蒋伶活, 刘洋, 李佳雨, 刘维瑾
【申请人】江南大学