基于fta卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊dna的方法

基于fta卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊dna的方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于FTA卡提取DNA的方法，具体涉及一种基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法。提取步骤如下：收集经隐孢子虫卵囊感染成功后的犊牛粪便，获得隐孢子虫卵囊，定量污染粪便；将奶牛粪便涂抹于FTA卡上，常温晾干FTA卡，打孔获得FTA圆片；将获得的FTA圆片分别放入离心管内，去污并清洗，加入FTA卡清洗液，室温孵育后加入1×TE溶液，室温孵育，将清洗后的FTA圆片完全干燥，完成粪便中隐孢子虫卵囊DNA的提取。本发明只需携带FTA卡到养殖场采集粪便样本，经FTA洗脱液和其他有机溶液清洗后，可将FTA卡片用作DNA模板进行PCR扩增，成本低廉，方便快捷。
【专利说明】
基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于FTA卡提取DNA的方法，具体涉及一种 基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 隐孢子虫病是由隐孢子虫引起的新发人兽共患传染病，被世界卫生组织列为全球 六大腹泻病之一。隐孢子虫可以感染包括人在内的280多种动物，其卵囊广泛存在于动物和 环境中，常通过水或食物传播造成大规模暴发流行。隐孢子虫病可在奶牛群中广泛传播流 行，引起奶牛的体重下降，产奶量减少，给奶牛业的发展造成严重的经济损失，同时能传播 多种人畜共患病，存在较高的公共卫生风险，对人和动物健康造成严重威胁。因此快速、简 便、准确的发现隐孢子虫是该病防治的关键。
[0003] 目前，隐孢子虫的检测方法有粪便学、免疫学、分子生物学等方法。
[0004] 隐孢子虫的粪便学检查方法，主要有染色法和漂浮法，由于隐孢子虫体积微小，直 径在4.5μπι-5.5μπι，在显微镜下很难辨别，检出率低且易导致误判。目前，国内外已建立了对 隐孢子虫病的多种免疫学检测方法，现有的检测方法主要有:酶联免疫吸附实验(ELISA)、 免疫荧光法（IFA)、免疫印迹技术(Western blotting)等。随着分子生物学的发展，国内外 一些学者相继利用聚合酶链式反应(PCR)、基因芯片等分子生物学技术，对隐孢子虫核酸分 子进行了大量的研究，并取得重要进展，且在隐孢子虫卵囊检测、隐孢子虫病的诊断、流行 病学调查及虫种鉴定和虫株分型中得到广泛应用。
[0005] 隐孢子虫卵囊DNA的提取量与纯度，直接影响着下游PCR的扩增效果，其DNA的提取 主要受卵囊裂解程度和杂质洗脱能力两方面的影响。而奶牛粪便中存在大量肠道脱落上皮 细胞、食物残渣、腐殖酸、蛋白质等PCR抑制因子。因此权衡一种最佳的奶牛粪便中隐孢子虫 卵囊DNA的提取方法，对粪便隐孢子虫检测有着十分重要的作用。目前国内外主要通过商业 化粪便DNA提取试剂盒，来获得奶牛粪便中隐孢子虫卵囊DNA，然而，这种方法提取DNA步骤 繁琐，耗时较长，在DNA提取过程中易形成交叉污染，从而影响到检测准确性。此外，使用大 量化学试剂，对环境造成污染。
[0006] FTA(Flinders Technology Associates)是一种经化学特殊处理的棉纤维卡片， 目前被广泛应用于目前国内外分子生物学研究的DNA模板制备中。FTA滤膜是将变性剂和螯 合剂渗透在纤维基质上，当捕捉到微生物或者细胞后能自动将其裂解，样品DNA吸附在FTA 卡上，通过缓冲液洗涤，去除样品中的其他成分，而吸附了 DNA的FTA卡可直接作为模板用于 PCR反应。而且样品中的传染性病原体在FTA卡上5秒钟内就可完全失活，具有较高的生物安 全性。
[0007] 近年来，国内外关于FTA/PCR法检测隐孢子虫卵囊的应用研究仅局限于饮料、地表 水等水源性隐孢子虫卵囊，而粪便样品中含有的大量的腐殖酸、食物残渣、脱落的肠道上皮 细胞、蛋白质等杂质严重抑制了以FTA卡为DNA模板的PCR扩增。依据Whatman公司推荐的常 规洗脱方法无法清洗掉上述PCR抑制因子，无法基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA。

【发明内容】

[0008] 本发明要解决的技术问题是按照常规洗脱方法，无法基于FTA卡从粪便中提取隐 孢子虫卵囊DNA，提供一种清洗载有隐孢子虫DNA的FTA卡片，具体为基于FTA卡从粪便中提 取隐孢子虫卵囊DNA的方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法，提取步骤如下：
[0011] (1)收集经隐孢子虫卵囊感染成功后的犊牛粪便，粪便经纯化沉淀后，获得隐孢子 虫卵囊，经血细胞计数板计数，记录卵囊浓度；
[0012] (2)定量污染奠便，将步骤⑴获得的卵囊倍比稀释成1 X 10-VmL-l X 105/mL个卵 囊，取倍比稀释后的卵囊悬液lmL，均匀混入lg经检测后为隐孢子虫阴性的奶牛粪便中；
[0013] (3)将步骤(2)中的奶牛粪便涂抹于FTA卡上，常温晾干FTA卡，用单孔打孔器，在载 有隐孢子虫阳性粪便样品的FTA卡上打孔，取得直径2mm的FTA圆片；
[0014] (4)将步骤(3)中获得的FTA圆片分别放入2mL离心管内，加去污剂煮沸5min，除去 污剂溶液后加无水乙醇清洗5min，期间数次轻微震荡，然后除去无水乙醇；
[0015] (5)加入300yL FTA卡清洗液，室温孵育5min，加入500yLl X TE溶液，室温孵育 5min；
[0016] (6)重复步骤(5)-次；
[0017] (7)将清洗后的FTA圆片室温放置1小时或在56°C温箱中lOmin，至FTA圆片完全干 燥，完成粪便中隐孢子虫卵囊DNA的提取。
[0018] 所述步骤(4)中去污剂为质量分数10 %的SDS溶液，加入无水乙醇的体积为500yL。
[0019] 所述隐孢子虫为常见牛源隐孢子虫，如C . parvum、C . andersoni、C.bovis、 C.rynane〇
[0020] 本发明的有益效果为：
[0021 ]①经本发明中的纯化方法清洗后，提高检测敏感度，与巢氏PCR结合后最低检测量 可达到1 X 101个卵囊/克粪便。
[0022] ②操作简便，只需携带FTA卡到养殖场采集粪便样本后，经FTA洗脱液和其他有机 溶液清洗后，即可将FTA卡片用作DNA模板进行PCR扩增。
[0023] ③具有较高的生物安全性，FTA卡特有的螯合剂和裂解剂可以短时间迅速使微生 物和寄生虫卵囊失去活性，降低了有害病原的传播机会，保护了实验操作人员的安全，具有 较高的公共卫生意义。
[0024] ④FTA卡的常规洗脱方法，无法清洗粪便中的PCR抑制因子，本发明通过添加不同 的有机溶剂，改进FTA卡使用说明书中的清洗办法，清洗掉了粪便中的PCR抑制因子，使清洗 后载有隐孢子虫DNA的FTA卡片可直接用作DNA模板，进行后续的PCR扩增等分子生物学研 究，本发明代替了传统商业化粪便DNA提取试剂盒提取DNA时繁琐的步骤和高昂的价格，具 有成本低廉，方便快捷的优点。
【附图说明】
[0025]图1为隐孢子虫巢式PCR反应条件。
[0026] 图2为基于18S rRNA基因位点FTA/PCR法检测奶牛隐孢子虫：阳性粪便样品的敏感 性试验电泳图；其中，Μ表示DNA Marker(DL2000);泳道1-7:1 X 105-1 X 10-1个卵囊/g隐孢子 虫阳性粪便样品;P:阳性对照;N:阴性对照。
[0027] 图3为基于18S rRNA基因位点FTA/PCR法检测奶牛隐孢子虫：阳性粪便样品的特异 性试验电泳图；其中，Μ表示DNA Marker (DL2000);泳道1:微小隐孢子虫阳性粪便样品；泳道 2:安氏隐孢子虫阳性粪便样品；泳道3:贾第虫阳性粪便样品；泳道4:微孢子虫阳性粪便样 品；泳道5:球虫阳性粪便样品；泳道6:含双蒸水粪便样品;P:阳性对照;N:阴性对照。
[0028] 图4为基于18S rRNA基因位点FTA/PCR法检测奶牛隐孢子虫：阳性粪便样品的重复 性试验电泳图；其中，Μ表示DNA Marker(DL2000);泳道1-5:巢式PCR第一套产物电泳图；泳 道6-N:巢式PCR第二套产物电泳图；泳道1-3、6-8:隐孢子虫阳性粪便样品；4、P:阳性对照； 9、N:阴性对照。
[0029]图5为奶牛粪便样品检测图；其中泳道1-20为待检测样品，Μ表示DL2000Marker，P: 阳性对照;N:阴性对照。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均 按照常规试验。如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russel 1 DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0031] 实施例所用试剂均为市售，所用材料本
【申请人】实验室均有保存。
[0032] 主要试剂：FTA卡（FTATM Classic Card WhatmanTM，lot N〇.3983740，UK);FTA洗 脱液（FTA purification Reagent，WhatmanTM，lot No.9611474，UK);BSA(Bovine Serum Albumin，SIGMATM，lot No · SLBN1377V，USA);无水乙醇（Ethanol absolute，天津市永大化 学试剂有限公司）；SDS(十二烷基磺酸钠，C12H25〇4SNa，GENVIEWTM，lot No.4803010120);打 孔器（打孔直径2mm);DL2000DNA Marker、6 X Loading buff er，TaKaRa生物合成公司； DNAGreen，TIANDZ;K0D-plus、dNTPS，Τ0Υ0Β0。
[0033] 主要仪器:PCR仪，Gene Company Limited，型号9700;稳压稳流电泳仪，北京市六 一仪器厂，型号DYY-5;紫外成像仪，SYNGENE，型号InGenius LHR;数码照相机，佳能公司，型 号IXUS115HS;快速混匀器，GENIE，型号V0RTEX-2;超净工作台，苏州安泰空气技术有限公 司；双重纯水蒸馏仪，上海亚荣生化仪器厂，型号SZ-93;移液器，BRAND。
[0034] 基于FTA卡提取DNA进行PCR检测奶牛粪便中隐孢子虫卵囊的方法，包括敏感性试 验、特异性试验、重复性试验，具体步骤如下：
[0035] (1)敏感性试验：
[0036] ①隐孢子虫卵囊的纯化，收集经隐孢子虫卵囊感染成功后的犊牛粪便，粪便经乙 醚除脂、饱和蔗糖漂浮、不连续浓度蔗糖梯度离心沉淀、氯化铯离心沉淀后获得较为纯净的 隐孢子虫卵囊，经麦克马斯特平板卵囊计数法记得卵囊浓度为1 X 105/mL个卵囊。
[0037] ②定量污染粪便，将步骤①获得的卵囊倍比稀释成1 X 105/mL-l X KTVmL个卵囊， 取倍比稀释后的卵囊液lmL均匀混入lg经检测后为隐孢子虫阴性的奶牛粪便中。
[0038] ③将经隐孢子虫卵囊污染后的奶牛粪便样品涂抹于FTA卡上，常温晾干FTA卡。用 单孔打孔器在载有隐孢子虫阳性粪便样品的FTA卡上打孔取得直径2mm的FTA圆片。
[0039] ④将步骤③中获得的FTA圆片分别放入2mL离心管内，用10% SDS溶液煮沸5min，弃 去SDS溶液，加500yL无水乙醇清洗5min，期间数次轻微震荡，然后弃去无水乙醇。
[0040] ⑤加入300yL Whatman公司的FTA卡清洗液，室温孵育5min。
[0041 ] ⑥加入500yLl XTE溶液，室温孵育5min。
[0042] ⑦重复步骤⑤-⑥一次。
[0043] ⑧将清洗后的FTA圆片室温放置1小时或在56°C温箱中lOmin，至FTA圆片完全干 燥。
[0044] ⑨将步骤⑧得到的FTA卡片作为DNA模板，直接至于0.2mmEP管中，进行巢式PCR扩 增。PCR引物序列参照严若峰基于隐孢子虫18SrRNA设计的引物序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示;对于所有样品，两轮PCR反应均使用50yL体系，PCR反 应体系见表1。在第一轮反应体系中，加入牛血清白蛋白（BSA)用以中和PCR抑制因子，在第 二轮反应中无需添加。PCR反应条件，见图1。
[0045]⑩分别取5yLPCR产物在1 %琼脂糖凝胶电泳液中，以110V电压进行电泳，然后在紫 外凝胶成像分析系统中成像并观察结果。
[0046] PCR扩增产物送至测序公司测序，并分析测序结果。
[0047]表1:隐孢子虫巢式PCR反应体系
[0048]
[0049] 特异性试验：
[0050] 将上述（1)纯化的微小隐孢子虫卵囊和本发明人实验室存放的安氏隐孢子虫卵 囊、贾第虫卵囊、微孢子虫卵囊、球虫卵囊和灭菌双蒸水分别加入粪便样品中混合均匀，然 后涂抹在FTA卡上，接下来的处理步骤与上述（1)中③-⑩步骤相同，PCR引物序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID勵:4所示，？0?反应体系见表1，？0?反应条件见图 l〇
[0051 ] 重复性试验：
[0052] 以上述（1)中的步骤处理好的FTA卡片为DNA模板，基于隐孢子虫18S基因位点进行 三次巢式PCR扩增，每次扩增每个样本平行重复三次，以检测FTA/PCR法的重复性或稳定性。 试验步骤与上述（1)中③-⑩步骤相同，PCR引物序列见表1，PCR反应体系见表1，PCR反应条 件见图1。
[0053] 敏感性试验、特异性试验、重复性试验结果分析：
[0054] FTA/PCR法检测奶牛粪便样品中隐孢子虫卵囊敏感性试验，是基于隐孢子虫18S rRNA基因位点，以FTA卡为DNA模板进行的巢式PCR试验。试验将隐孢子虫卵囊以10倍倍比稀 释成105-10- 17个梯度范围，通过琼脂糖凝胶电泳和测序分析的结果显示泳道1-5均出现 250bp左右的目的条带，证明FTA/PCR法检测奶牛粪便样品中隐孢子虫卵囊最低检测量可达 到1X10 1个卵囊/g粪便，结果符合试验预期，满足检测要求。结果见附件图2。
[0055] 通过琼脂糖凝胶电泳和测序分析的结果显示，FTA/PCR法检测奶牛粪便样品中隐 孢子虫卵囊特异性试验中，微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫泳道均出现250bp左右的目的条 带，而其他虫株均未出现条带，证明FTA/PCR法特异性较好，结果见附件图3。试验结果符合 试验预期，满足检测要求。
[0056] 通过琼脂糖凝胶电泳和测序分析的结果显示，FTA/PCR法检测奶牛粪便样品中隐 孢子虫卵囊重复性试验中，泳道均出现250bp左右的目的条带，证明FTA/PCR法重复性较好， 结果见附件图4。实验结果符合试验预期，满足检测要求。
[0057]用本试验建立的方法对四川拜耳公司送检至本发明人实验室的20份奶牛粪便样 品进行检测，检测的隐孢子虫阳性率为10% (2/20)，以商业化粪便核酸提取试剂盒提取的 DNA为模板的PCR扩增隐孢子虫阳性率为10% (2/20)。
[0058]二者检测结果相同（如图5所示），但简化了商业化粪便核酸提取试剂盒提取DNA的 繁琐步骤，并且减少了在提取DNA过程中产生的交叉污染，具有省时、便捷的优点。
【主权项】
1. 基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于:所述提取步骤如下： (1) 收集经隐孢子虫卵囊感染成功后的犊牛粪便，粪便经纯化沉淀后，获得隐孢子虫卵 囊，经血细胞计数板计数，记录卵囊浓度； (2) 定量污染粪便，将步骤（1)获得的卵囊倍比稀释成I X HT1AiL-I X IO5AiL个卵囊，取 倍比稀释后的卵囊悬液ImU均匀混入Ig经检测后为隐孢子虫阴性的奶牛粪便中； (3) 将步骤(2)中的奶牛粪便涂抹于FTA卡上，常温晾干FTA卡，用单孔打孔器，在载有隐 孢子虫阳性粪便样品的FTA卡上打孔，取得直径2mm的FTA圆片； (4 )将步骤(3 )中获得的FTA圆片分别放入2mL离心管内，加去污剂煮沸5mi η，除去污剂 溶液后加无水乙醇清洗5min，期间数次轻微震荡，然后除去无水乙醇； (5) 加入300yL FTA卡清洗液，室温孵育5min，加入500yLl X TE溶液，室温孵育5min; (6) 重复步骤(5)-次； (7) 将清洗后的FTA圆片室温放置1小时或在56°C温箱中lOmin，至FTA圆片完全干燥，完 成粪便中隐孢子虫卵囊DNA的提取。2. 如权利要求1所述的基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在于： 所述步骤(4)中去污剂为质量分数10%的SDS溶液，加入无水乙醇的体积为500yL。3. 如权利要求1所述的基于FTA卡从粪便中提取隐孢子虫卵囊DNA的方法，其特征在 于：所述隐孢子虫为常见牛源隐孢子虫，如C. j〇arra?、C. a/3t/erso/3i、C. rynane〇
【文档编号】C12N15/10GK105907751SQ201610509281
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】王荣军, 张振杰, 张龙现, 张素梅, 王海燕, 菅复春, 宁长申, 胡苏辉
【申请人】河南农业大学