一种Cas9核酸内切酶分泌型表达载体及其构建方法和应用
【专利摘要】本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种Cas9核酸内切酶分泌型表达载体的构建及其应用。根据Cas9核酸内切酶基因序列和分泌表达载体pCT7?CHISP6H的序列信息，通过In?fusion的方法构建重组表达质粒pCT7?CHISP6H?Cas9。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行重组表达，获得分泌表达的Cas9核酸内切酶。亲和层析纯化得到了具有生物活性的重组蛋白，该重组蛋白可以在gRNA的指导下，体外切割靶标质粒。具有生物活性的Cas9核酸内切酶重组蛋白的成功制备，对开展基于重组Cas9核酸内切酶的基因组编辑具有重要的理论意义和实践意义。
【专利说明】
一种Cas9核酸内切酶分泌型表达载体及其构建方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体的说一种Cas9核酸内切酶分泌型表达载体及 其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated systems)，全名是常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关 联蛋白系统。2010年，Garneau等发现，在嗜热链球菌Streptococcus thermophilus的type II CRISPR系统中Cas9是唯一能够介导DNA切割的Cas核酸酶。Deltcheva等在酿脓链球菌 S · pyogenes 中发现了 type 11 CRISPR系统中另一重要成分：tracrRNA; tracrRNA参与 tracrRNA与前体crRNA结合成二聚RNA杂交体，并在Cas9和内源RNase III作用下，使前体 crRNA成为成熟crRNA。这两项研究揭示了type II CRISPR系统的三个关键组分：Cas9， crRNA和tracrRNA Jinek与Gas iunas通过实验发现，纯化得到的Cas9蛋白能够在crRNA与 tracrRNA存在时，在试管中能够对靶向DNA进行切割。并且Jinek等根据tracrRNA: crRNA RNA二聚体的结构，将crRNA的靶向定位序列融合到tracrRNA上构建成了嵌合RNA，又称 single guide RNA(sgRNA)。体外切割实验结果表明，sgRNA同样可以介导Cas9对革E1向DNA进 行切割。
[0003] 研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功对哺乳动物基因组上的靶向位点进 行了切割，并且激发了细胞的NHEJ与HDR修复机制，在相关位点完成了基因编辑。并且随后， CRI SPR/Cas9介导的多位点基因编辑也成功实现。相对于TALEN与ZFN，CRI SPR/Cas9具有明 显的优势，其无需设计一系列复杂的DNA结合结构域，研究人员仅需设计与靶位点对应的 crRNA或者sgRNA。这一优势极大的简化了基因编辑前期准备过程。CRISPR/Cas9系统在哺乳 动物细胞的基因编辑中的成功应用，拉开了CRISPR/Cas9作为基因编辑工具的序幕。 CRISPR/Cas9编辑工具的简便性与高效性，使得其迅速应用于一系列动植物基因组编辑研 究中。
[0004] 目前基于CRISPR/Cas9系统对生物体进行基因组编辑的工作，尽管在生物体内行 使最终功能的Cas9蛋白，但是目前采用的CRISPR/Cas9系统进行基因组改造的研究中，其 Cas9主要通过体外合成的Cas9mRNA或者通过重组质粒的方式完成的。利用体外合成的 Cas9mRNA或者通过重组质粒的方式存在较多的缺陷和不足，主要包括以下几方面： Cas9mRNA不稳定，注射到生物体内后容易降解;重组质粒注射生物体后，需要进一步转录成 Cas9mRNA，然后再翻译成Cas9蛋白才能实现其对生物体基因组的编辑，对于细胞分裂周期 较快的物种来说，其难以产生稳定遗传的突变体。利用Cas9蛋白可以解决上述诸多问题，但 目前Cas9蛋白应用较少，其原因主要是Cas9蛋白较大，其预测分子量约为170kD，通过体外 重组的方式不容易实现其重组表达。采用高效分泌型表达载体实现Cas9的高效表达，简化 Cas9蛋白的纯化工艺，对于开展基于Cas9重组蛋白的基因编辑工作具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于为解决目前Cas9重组蛋白来源不足的问题，提供一种Cas9核酸内 切酶分泌型表达载体及其构建方法和应用。
[0006] 为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
[0007] 一种Cas9核酸内切酶分泌型表达载体，分泌型表达载体为含有Cas9核酸内切酶基 因和分泌表达载体序列。
[0008] 具体，所述分泌型表达载体pCT7-CHISP6H-Cas9:
[0009] 以 pCT7-CHISP6H-Cas9F/pCT7-CHISP6H-Cas9R 为引物对，以 Cas9P-lEA 为模板，进 行PCR扩增，电泳后切胶回收；
[0010] 利用PmaC I对质粒pCT7-CHISP6H进行酶切，电泳后切胶回收相应片段，与上述回 收的PCR产物进行in-fusion连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选单克隆，即 得构建的重组载体；
[0011] pCT7-CHISP6H~Cas9F:CATCACCATCACCACGACAAGAAGTACAGCATCGGCCT；
[0012] pCT7-CHISP6H~Cas9R:AAGCTTCGAATTCACTCACACTTTGCGCTTTTTCTTGG〇
[0013] 一种Cas9核酸内切酶分泌型表达载体的构建方法，以pCT7-CHISP6H-Cas9F/pCT7-CHISP6H-Cas9R为引物对，以Cas9P-lEA为模板，进行PCR扩增后回收；
[0014] 利用PmaC I对质粒pCT7-CHISP6H进行酶切，回收相应片段，并与上述回收的PCR产 物进行in-fusion连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选单克隆，即得构建的 重组载体；
[0015] pCT7-CHISP6H-Cas9F:CATCACCATCACCACGACAAGAAGTACAGCATCGGCCT；
[0016] pCT7-CHISP6H~Cas9R:AAGCTTCGAATTCACTCACACTTTGCGCTTTTTCTTGG〇
[0017] 一种Cas9核酸内切酶分泌型表达载体的应用，所述分泌型表达载体在高效分泌表 达Cas9核酸内切酶中的应用。
[0018] 将所述重组表达质粒PCT7-CHISP6H-Cas9转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，用IPTG进行 诱导表达，离心收集上清液，得到含有重组Cas9核酸内切酶的溶液，而后以金属螯合层析柱 进行一步法纯化，进而获得纯化的重组Cas9核酸内切酶。
[0019] 本发明所具有的优点：本发明获得了一种Cas9核酸内切酶分泌型表达载体，并在 大肠杆菌中实现其高效分泌表达以及一步法纯化重组Cas9核酸内切酶。所得重组Cas9核酸 内切酶可以在gRNA的指导下对靶标基因进行切割，为开展基于Cas9重组蛋白的基因编辑工 作提供了基础。具体的说本发明重组Cas9核酸内切酶的获得对开展基于Cas9重组蛋白的生 物体基因组编辑具有重要的理论意义和实践意义。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例提供的重组表达Cas9的Western blot分析图；其中，Μ为蛋白 标准分子量;1为诱导前的上清液;2为诱导6h后的发酵上清液。
[0021] 图2为本发明实施例提供的重组表达Cas9蛋白经亲和层析纯化色谱图；图中方框 处标注的吸收峰即为通过分段洗脱得到的重组Cas9。
[0022] 图3为发明实施例提供的亲和层析纯化后的重组蛋白脱盐结果；图中方框处标注 的吸收峰即为脱盐后得到的重组Cas9。
[0023] 图4为本发明实施例提供的重组Cas9白的体外活性检测分析图；其中1为ΙμL的10μ g/mL重组Cas9切割目的片段的结果；2为ΙμL的500yg/mL重组Cas9切割结果；3为ΙμL的lmg/ mL重组Cas9切割结果;4为ΙμL浓度为lmg/mL的BSA对照实验。
【具体实施方式】
[0024] 下面实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0025]实施例1 :Cas9核酸内切酶分泌型表达载体的构建与表达
[0026] 根据载体Cas9P_lEA中Cas9的序列信息，结合大肠杆菌高效分泌表达异源蛋白的 载体PCT7-CHISP6H序列构建了含有Cas9基因的分泌型表达载体pCT7-CHISP6H-Cas9。
[0027] (1)根据Cas9P-lEA中Cas9核苷酸序列信息，结合分泌表达载体pCT7-CHISP6H和 In-fusi:〇n?HD Clontech kit使用说明书，设计引物扩增其成熟肽序列，引物序列如下：
[0028] pCT7-CHISP6H-Cas9F: CATCACCATCACCACGACAAGAAGTACAGCATCGGCCT(下划线部分 序列为与线性化载体PCT7-CHISP6H匹配的15bp序列）
[0029] pCT7-CHISP6H~Cas9R:AAGCTTCGAATTCACTCACACTTTGCGCTTTTTCTT GG(下划线部分 序列为与线性化载体PCT7-CHISP6H匹配的15bp序列）
[0030] 以 pCT7-CHISP6H-Cas9F/pCT7-CHISP6H-Cas9R 为引物对，以 Cas9P-lEA 为模板 (lng/μL)，进行PCR扩增，具体PCR反应体系和扩增程序如下：
[0031] PCR反应体系为50μ1，包括： Takara PriraerSTAR Max Premix (2X) 25 μ 1 IjCT7-CniSP6ii-Cas9F 〇 0 μ Μ) 1 μ 1
[0032] pCT7-CIITSP6II-Cas9R (10 μ Μ) 1 μ 1 Cas9P-1ΕΑ 质粒（1 ng/ μ 1) 1 μ 1 ddlLO 22 μ 1
[0033] PCR扩增程序:98°C预变性lmin;98°C变性10s，55°C退火5s，72°C延伸2min，共32个 循环;最后72°C延伸lOmin。
[0034] 利用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行电泳分析，切胶回收与预测大小一 致的片段，片段大小为4.2kb左右，利用NanoDrop测定回收片段浓度(75ng/yl)。
[0035] (2)pCT7-CHISP6H质粒的线性化酶切
[0036] 利用PmaC I对质粒pCT7-CHISP6H进行酶切，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析酶切 产物，回收2.5kb左右的酶切片段，并利用NanoDrop测定回收片段浓度(35ng/yl)。
[0037] (3)pCT7-CHISP6H_Cas9 载体的构建
[0038] 根据In-fusi〇n?HD Clontech kit使用说明，将回收的PCR产物和PmaC I酶切的 PCT7-CHISP6H线性化质粒进行反应，具体反应体系与反应条件为：回收的PCR产物ΙμL，回收 的单酶切载体2μ1，5 X In-fusi〇n? HD 2μ1，无菌水5μ1，混匀后，在50°C反应15min后立即 置于冰上，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布含有lOOyg/mL氨苄青霉素 的 LB 固体平板，37 °C 培养过夜，&T7-F/T7-ter(T7-F:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；T7-ter: 5' -TGCTAGTTATTGCTCAGCG-3'）为引物对，利用PCR方法对LB平板上的单克隆进行检测， 将PCR检测阳性克隆经摇菌后进行DNA测序，由此筛选到构建的重组载体，命名为pCT7-重组Cas9的诱导表达
[0039] 抽提pCT7-CHISP6H-Cas9质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，37°C条件下，在含有 l〇〇yg/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中摇菌，待菌体浓度达到0D600为0.6左右，添加 终浓度为ImM的IPTG进行诱导表达ehjtMOOOOg离心10min后，取30μ1上清液加入6μ1的6 X loading buffer，100°C煮沸5min后，进行10%的SDS-PAGE分离，接着将PAGE胶在 GenScript eBlot上进行转膜，8分20秒后取出PVDF膜置于含有2-5%脱脂奶粉的了851'溶液 中封闭lh，然后将其在1 %。鼠抗ant i -Hi s抗体含量的TBST溶液中孵育1 h，TBST溶液洗膜， HRP-DAB显色试剂盒显色5min，检测结果如图1所示。图1结果显示，该重组质粒在大肠杆菌 BL21(DE3)中经IPTG诱导后成功的分泌表达。
[0040]实施例2:重组Cas9核酸内切酶的分离纯化与活性检测
[0041 ] 重组工程菌经Western blot检测后，进行放大实验，放大至400mL体积。发酵液离 心后，在AKTA avant 25蛋白纯化系统上，将上清液直接利用His标签蛋白纯化预装柱 HisTrap?FF Crude(5mL)进行亲和层析法纯化。具体步骤如下：
[0042] HisTrap?FF Crude(5mL)柱经10倍柱体积的超纯水冲洗后，用5倍柱体积的结合缓 冲液(结合缓冲液为50mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，300mM NaCl，10mM咪唑） 平衡;发酵液中分别添加5M咪唑母液、3M NaCl母液以及0.3M pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二 氢钠缓冲液至发酵液中各组分浓度与结合缓冲液中一致，混匀，4°C，10000g离心10min，取 上清液上HisTrap?FF Crude柱，流速控制在3mL/min;上样结束后，利用结合缓冲液冲洗10 倍柱体积;而后利用洗脱液(50mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，300mM NaCl， 250mM咪唑)进行梯度洗脱，AKTA avant 25系统自动收集，洗脱目的蛋白如图2所示（图中方 框表示目的蛋白）。亲和层析纯化的含有重组Cas9目的蛋白的组分，利用HiPrep 26/10脱盐 柱在AKTA avant 25上进行脱盐，脱盐结果如图3所示。由图3可以看出，目的蛋白得到充分 分离(图中方框表示目的蛋白）。
[0043] 对分离纯化的样品进行活性检测分析:将实验室构建的含有靶标基因(EcChi4)的 质粒(pMD19-T-EcChi4)、T7体外转录合成靶标基因 EcChi4的gRNA及分离纯化的重组Cas9混 合于缓冲液（20mM HEPES pH 7.5，150mM KCl，0.5mM DTT，0.1mM EDTA，10mM MgCh)中，在 50μ1反应体系，37°C条件下反应90min，65°C条件下ΙμL lOOmg/mL蛋白酶K进行消化5min，立 即加入1〇μ1 6 XDNA上样缓冲液终止酶切反应，1 %的琼脂糖凝胶验证，检测结果见图4。结 果显示重组Cas9目的蛋白能够将含有靶标基因的质粒进行切割，在体外具有酶切活性。
[0044] 本发明提供的具有核酸内切酶活性的重组Cas9为开展基于Cas9重组蛋白的生物 体基因组编辑具有重要的理论意义和实践意义。
【主权项】
1. 一种Cas9核酸内切酶分泌型表达载体，其特征在于：分泌型表达载体为含有Cas^S 酸内切酶基因和分泌表达载体序列。2. 按权利要求1所述的Cas9核酸内切酶分泌型表达载体，其特征在于:所述分泌型表达 以 pCT7-CHISP6H-Cas9F/pCT7-CHISP6H-Cas9R 为引物对，以 Cas9P-lEA 为模板，进行 PCR 扩增，电泳后切胶回收； 利用PmaC I对质粒pCT7-CHISP6H进行酶切，电泳后切胶回收相应片段，与上述回收的 PCR产物进行in-fusion连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选单克隆，即得构 建的重组载体； PCT7-CHISP6H-Cas9F:CATCACCATCACCACGACAAGAAGTACAGCATCGGCCT； pCT7-CHISP6H-Cas9R:AAGCTTCGAATTCACTCACACTTTGCGCTTTTTCTTGG。3. -种权利要求1所述的Cas9核酸内切酶分泌型表达载体的构建方法，其特征在于：以 pCT7-CHISP6H-Cas9F/pCT7-CHISP6H-Cas9R 为引物对，以 Cas9P-lEA 为模板，进行 PCR 扩增后 回收； 利用PmaC I对质粒pCT7-CHISP6H进行酶切，回收相应片段，并与上述回收的PCR产物进 行in-fusion连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选单克隆，即得构建的重组 载体； PCT7-CHISP6H-Cas9F:CATCACCATCACCACGACAAGAAGTACAGCATCGGC CT； pCT7-CHISP6H-Cas9R:AAGCTTCGAATTCACTCACACTTTGCGCTTTTTCTTGG。4. 一种权利要求1所述的Cas9核酸内切酶分泌型表达载体的应用，其特征在于:所述分 泌型表达载体在高效分泌表达Cas9核酸内切酶中的应用。5. 按权利要求4所述的Cas9核酸内切酶分泌型表达载体的应用，其特征在于:将所述重 组表达质粒pCT7-CHISP6H-Cas9转化至大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG进行诱导表达，离心收 集上清液，得到含有重组Cas9核酸内切酶的溶液，而后以金属螯合层析柱进行一步法纯化， 进而获得纯化的重组Cas9核酸内切酶。
【文档编号】C12N9/16GK105907777SQ201610494618
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】张继泉, 宋凤阁, 桂天书, 相建海
【申请人】中国科学院海洋研究所