特异性识别EGFRvⅢ的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其步骤如下：A、质粒构建、扩增及纯化；B、慢病毒包装：1)培养包装细胞，2)准备DNA?EndoFectin慢病毒混合物，3)转染包装细胞，4)收获慢病毒颗粒；C、T细胞转染：1)培养板预处理；2)病毒离心；3)T细胞转染。CAR?T技术经历了三代发展，现在应用于临床实验的主要是第三代含双共刺激分子CAR。在此基础上，本发明加入了新共刺激分子CD70。在CAR?T细胞中，CD70?CD27的相互作用可诱导CD8+T细胞发挥更强的肿瘤杀伤及融病毒作用。因此，引入CD70的CAR?T有着更加强大的抗肿瘤能力，将延长生存期。
【专利说明】
特异性识别EGFRv I I I的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于基因工程技术领域，涉及一种嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，具体涉及一种特异性识别表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002]嵌合抗原受体修饰T细胞(ChimericAntigen Receptors T cell，CAR_T)技术是将识别肿瘤相关抗原的单链抗体和T细胞的活化序列结合为一体，即将抗体对肿瘤抗原的高亲和性与T淋巴细胞的杀伤机制相结合，通过基因转导方法转染T细胞，使其具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力，由于本方法与其它的肿瘤免疫治疗方法相比，效果确切，因此被认为是肿瘤免疫治疗领域的一项靶向生物治疗的新技术。1989年由Eshhar等首次提出，2006年Rosenberg和Restifo博士等首次应用肿瘤表面受体(TCR)转染T细胞技术靶向治疗17例晚期转移性黑素瘤患者，2例患者的肿瘤完全消退，15例患者病情长期稳定。2010年Rosenberg博士首次应用CAR-T治疗理念对淋巴瘤进行治疗，结果表明，治疗后，患者不仅肿瘤消失，而且存在患者骨髓中的癌细胞前体也被选择性地清除了。次年，June等人又在《NEWENGL J MED》和《SCI TRANSL MED》上发表了应用CAR-T成功治愈慢性淋巴细胞白血病的临床研究报告，因此，这一方法是目前被认为在肿瘤免疫治疗中的一个非常有潜力的治疗手段。CAR-T技术经历了三代发展，现在应用于临床实验的主要是第三代含双共刺激分子CAR。
[0003]⑶70为一种跨膜蛋白，分子量约为50000，包括胞外蛋白结合区、跨膜区以及胞内区三个组成成分。当CD70与CD27结合后，可以起到第二信号的作用，使T细胞进一步活化，在细胞增殖、细胞因子分泌等方面的能力显著提高。而当免疫应答结束时，其表达也随之下调。有研究证实，白介素2、12及肿瘤坏死因子α等可促进CD70的表达，相反的，IL-1SIL-1O抑制CD70的表达。在CAR-T细胞中，CD70-CD27的相互作用可诱导CD8+T细胞发挥更强的肿瘤杀伤及融病毒作用，引入CD70的CAR-T有着更加强大的抗肿瘤能力。但目前没有含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的空缺，本发明加入新共刺激分子CD70，提供一种特异性识别EGFRvII I的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0006]—种特异性识别EGFRvIII的含⑶70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，包括以下步骤:
[0007]A、质粒构建:构建慢病毒包装质粒pEGFP-CD70CAR质粒；
[0008]质粒扩增及纯化:紫外照射细菌室超净台30min，在超净台内剪携有pEGFP-⑶70CAR质粒的滤纸圈的1/3置于离心管中，加入无菌双蒸水浸泡30min，搅拌后离心取上清，置于-20 °C保存备用。
[0009]用于扩增质粒的感受态大肠杆菌DH5a加入到EP管中，加pEGFP-CD70CAR质粒IyL/管，混匀后冰上静置30min，设如下对照:①2yL pcDNA3.1转化的感受态细胞作为阳性对照；②完全不加质粒DNA的感受态细胞作为阴性对照。低温42°C热休克1.5?2min，置于冰中5分钟，加Luria-Bertani培养基，摇床15Orpm振摇45?60miη，使细菌复苏并表达pEGFP-EFGRvIII和pEGFP-CD70CAR质粒氨苄青霉素AMP抗药性，将200μL已转化的感受态细胞转移到氨苄青霉素(Amp+)的固体培养基平板上(平板需37°C温箱预热)，涂布均匀，干燥后，培养12-16小时。
[0010]挑取转化pEGFP-EFGRvIII和pEGFP-CD70CAR后Amp+平板上长出的单菌落放入到已加有3mL Amp+LB的试管中，180rpm振摇12-16小时，依据质粒提取试剂盒质粒提取。
[0011]B、慢病毒包装
[0012]I)培养包装细胞
[0013]在进行转染前，提前两天将1.3?1.5X106的GeneCopoeia 293T细胞移入10厘米细胞板进行培养，板内加入完全培养基(90 % DMEM+10%胎牛血清)，融合率适70?80 %时进行转染。
[0014]2)准备DNA-EndoFectin慢病毒混合物
[0015]往无菌EP管加入pEGFP-CD70CAR质粒和5.0ul LentiPac HIV混合试剂，以Opt1-MEM I培养基稀释至200μ1。在另一无菌EP管内，以Opt1-MEM I稀释15ul EndoFectin转染试剂。边轻柔进行涡旋，边往DNA和LentiPac HIV试剂的混合溶液中滴加以上稀释EndoFectin转染试剂。室温培养该溶液10?25分钟，使DNA-EndoFectin混合物产生。
[0016]3)转染包装细胞
[0017]将DNA-EndoFectin慢病毒复合物直接加入细胞板，轻柔涡旋平板使复合物分散。过夜培养6?8小时，以加入2?5%热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜培养基(90%DMEM+10%胎牛血清)更换旧培养基，培养基中加入1/500体积的TiterBoost试剂。
[0018]4)收获慢病毒颗粒
[0019]转染两天后收集培养基，以500g离心10分钟，可获得含慢病毒颗粒的培养基。离心后，以0.45μπι的低蛋白结合PES过滤膜过滤该培养基。
[0020]C、T细胞转染
[0021]I)培养板预处理
[0022]将20?100yg/ml的重组黏连蛋白Retro Nectin包被在未处理的24孔板上，4°C过夜。用2 %牛血清蛋白BSA封闭半小时。用缓冲液冲洗三遍。
[0023]2)病毒离心
[0024]将病毒上清，即由步骤B获得的含病毒培养基以125?250yl/cm2的浓度加到预处理的24孔板上，4?6h，去除上清用PBS冲洗一次。
[0025]3) T细胞转染
[0026I管中预先加5ml人淋巴细胞分离液，取抗凝血5ml，与生理盐水1:1混勾后，缓慢滴入，以1500转/分离心20分钟，肉眼可见薄膜，吸取此处的单核细胞，放入含生理盐水10毫升的试管中，充分混匀后，以500g离心10分钟。弃液，沉淀经无菌PBS反复洗2次即得所需细胞。将已经提前三天用⑶3刺激抗体0KT3及IL-2激活的T细胞以0.2?I X 15个/ml的浓度加入，以2000g的离心力离心lOmin，孵育72h，即得特异性识别EGFRvIII的含⑶70嵌合抗原受体修饰T细胞。
[0027]CAR-T技术经历了三代发展，现在应用于临床实验的主要是第三代含双共刺激分子CAR。在此基础上，本发明加入了新共刺激分子⑶70。在CAR-T细胞中，⑶70-⑶27的相互作用可诱导⑶8+T细胞发挥更强的肿瘤杀伤及融病毒作用。因此，引入⑶70的CAR-T有着更加强大的抗肿瘤能力，将延长生存期。
【具体实施方式】
[0028]下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0029]本发明提供了一种特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，具体包括以下步骤:
[0030]A、质粒构建:构建慢病毒包装质粒pEGFP-⑶70CAR质粒，⑶70CAR由引导序列、重链可变区、铰链区、轻链可变区、⑶8跨膜区、⑶28结构域、CD137结构域、⑶70结构域及⑶3zeta链构成，根据序列化学合成基因片段；
[0031]质粒扩增及纯化:紫外照射细菌室超净台30min，内置镊子、高压灭菌的器械盒(小镊子、剪刀)、1.5mL无菌离心管、200yL移液器及无菌吸头。在超净台内剪携有pEGFP-⑶70CAR质粒的滤纸圈的1/3置于离心管中，加入适量无菌双蒸水浸泡30min，搅拌后离心取上清，置于-20 0C保存备用。剩下的2/3携有pEGFP-CD70CAR质粒的滤纸封好保存(-80 V冰箱)。
[0032]用于扩增质粒的感受态大肠杆菌DH5a加入到EP管中，加pEGFP-CD70CAR质粒IyL/管，混匀后冰上静置30min，设如下对照:①2yL pcDNA3.1转化的感受态细胞作为阳性对照；②完全不加质粒DNA的感受态细胞作为阴性对照。低温42°C热休克1.5?2min，置于冰中5分钟，加Luria-Bertani培养基，摇床15Orpm振摇45?60miη，使细菌复苏并表达pEGFP-EFGRvIII和pEGFP-CD70CAR质粒氨苄青霉素AMP抗药性，将200μL已转化的感受态细胞转移到氨苄青霉素(Amp+)的固体培养基平板上(平板需37°C温箱预热)，涂布均匀，干燥后，培养12-16小时。
[0033]挑取转化pEGFP-EFGRvII I和pEGFP-CD70CAR后Amp+平板上长出的单菌落放入到已加有3mL Amp+LB的试管中(每个试管内只加一个菌落)，180rpm振摇12-16小时，依据质粒提取试剂盒(天根公司，DPl 17)质粒提取:向吸附柱CP6(质粒提取试剂盒提供)中加入2.5ml的平衡液BL(质粒提取试剂盒提供)，8，OOOrpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中O取10ml过夜培养的菌液加入离心管，室温8, OOOrpm离心3min收集细菌，尽量吸除上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液Pl(质粒提取试剂盒提供)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。向离心管中加入8ml溶液P2(质粒提取试剂盒提供)，立即温和地上下翻转6?8次，室温放置5min。向离心管中加入8ml溶液P4(质粒提取试剂盒提供)，立即温和地上下翻转6?8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置1min。8, OOOrpm离心5?1min，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CSl(质粒提取试剂盒提供)中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中。向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中。室温8 ,OOOrpm(?8，228 X g)离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。向吸附柱CP6中加入1ml漂洗液PW(质粒提取试剂盒提供)，8，OOOrpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中O向吸附柱CP6中加入3ml无水乙醇，室温8, OOOrpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CP6重新放回收集管中，8，000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加I?2ml洗脱缓冲液TB(质粒提取试剂盒提供)，室温放置5min，然后室温8，000印111离心21^11。将501111离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5 m I离心管，-2 O °C保存。用核酸蛋白检测仪(NanoDrop 2000)检测所提取质粒pEGFP_CD70CAR的浓度及纯度。
[0034]B、慢病毒包装及滴度测定
[0035]使用慢病毒包装试剂盒(购自GeneCopoeia ,N0.HPK-LvTR-20)包装病毒。
[0036]I)培养包装细胞
[0037]在进行转染前，提前两天将1.3?1.5X106的GeneCopoeia 293T细胞移入10厘米细胞板进行培养，板内加入完全培养基(90 % DMEM+10%胎牛血清)，融合率适70?80 %时进行转染。
[0038]2)准备DNA-EndoFectin慢病毒混合物
[0039]往无菌EP管加入pEGFP-CD70CAR质粒和5.0ul LentiPac HIV混合试剂(由慢病毒包装试剂盒提供)，以Opt1-MEM I培养基(购自Gibco公司)稀释至200μ1。在另一无菌EP管内，以Opt1-MEM I稀释15ul EndoFectin转染试剂(由慢病毒包装试剂盒提供)。边轻柔进行涡旋，边往DNA和LentiPac HIV试剂的混合溶液中滴加以上稀释EndoFectin转染试剂。不可颠倒添加顺序，以免影响转染效率。如体系较大，可使用圆底离心管(如Falcom 5ml或15ml离心管)盛装溶液。室温培养该溶液10?25分钟，使DNA-EndoFect in混合物产生。
[0040]3)转染包装细胞
[0041]将DNA-EndoFectin慢病毒复合物直接加入细胞板，轻柔涡旋平板使复合物分散。过夜培养6?8小时，以加入2?5%热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜培养基(90%DMEM+10%胎牛血清)更换旧培养基，培养基中加入1/500体积的TiterBoost试剂(由慢病毒包装试剂盒提供)。
[0042]4)收获慢病毒颗粒
[0043]转染两天后收集培养基，以500g离心10分钟，可获得含慢病毒颗粒的培养基。离心后，以0.45μπι的低蛋白结合PES过滤膜过滤该培养基。
[0044]5)慢病毒滴度测定
[0045]根据慢病毒颗粒滴度检测试剂盒(购自GeneCopoeia，N0.HPR-LTK-050)进行qRT-PCR检测(ABI 7300实时PCR系统)。绘制标准曲线，计算滴度。
[0046]C、T细胞转染
[0047]I)培养板预处理
[0048]将20?100yg/ml的重组黏连蛋白Retro Nectin(购自Takara公司，TlOOa)包被在未处理的24孔板上，4 °C过夜。用2 %牛血清蛋白BSA封闭半小时。用缓冲液冲洗三遍。封口膜密封，4°C条件下可保存一周。
[0049]2)病毒离心
[0050]将病毒上清病毒上清，即由步骤B获得的含病毒培养基以125?250yl/cm2的浓度加到预处理的培养板上，4?6h，去除上清用PBS冲洗一次。
[0051]3) T细胞转染
[0052]管中预先加5ml人淋巴细胞分离液(购自天津灏洋公司)，取抗凝血5ml，与生理盐水1:1混匀后，缓慢滴入，以1500转/分，慢升慢降离心20分钟，肉眼可见薄膜，吸取此处的单核细胞，放入含生理盐水10毫升的试管中，充分混匀后，以500g离心10分钟。弃液，沉淀经无菌PBS反复洗2次即得所需细胞。将已经提前三天用CD3刺激抗体0KT3(购自美天旎公司，130-093-387)及IL-2激活的T细胞以0.2?I X 15个/ml的浓度加入，以2000g的离心力离心lOmin，孵育 72h。
[0053]D、构建特异性识别EGFRvII I的含CD70CAR-T细胞
[0054]转染后的T细胞在荧光显微镜下进行观察，可见有绿色荧光表达，证明特异性识别EGFRvII I的含CD70CAR-T细胞构建成功。
【主权项】
1.一种特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下: A、质粒构建:构建慢病毒包装质粒pEGFP-CD70CAR质粒； 质粒扩增及纯化:在经紫外线照射后的超净台内剪携有PEGFP-CD70CAR质粒的滤纸圈的1/3置于离心管中，加入无菌双蒸水浸泡30min，搅拌后离心取上清，置于-20°C保存备用； 将用于扩增质粒的感受态大肠杆菌DH5a加入到EP管中，加pEGFP-CD70CAR质粒IyL/管，混匀后冰上静置30min;低温42°C热休克1.5?2min，置于冰中5分钟，加Luria-Bertani培养基，摇床150rpm振摇45?60min，使细菌复苏并表达pEGFP-EFGRvI II和pEGFP_CD70CAR质粒氨苄青霉素AMP抗药性，将200yL已转化的感受态细胞转移到氨苄青霉素的固体培养基平板上，涂布均匀，干燥后，培养12-16小时； 挑取转化pEGFP-EFGRvI 11和pEGFP_CD70CAR后Amp+平板上长出的单菌落放入到已加有3mL Amp+LB的试管中，180rpm振摇12-16小时，依据质粒提取试剂盒质粒提取； B、慢病毒包装 1)培养包装细胞 在进行转染前，提前两天将1.3?1.5 X 16的GeneCopoeia 293T细胞移入10厘米细胞板进行培养，板内加入完全培养基，融合率为70?80 %时进行转染； 2)准备DNA-EndoFectin慢病毒混合物 往无菌EP管加入pEGFP-CD70CAR质粒和5.0ul LentiPac HIV混合试剂，以Opt1-MEM I培养基稀释至200μ1;在另一无菌EP管内，以Opt1-MEM I稀释15ul EndoFectin转染试剂;边进行涡旋，边往DNA和LentiPac HIV试剂的混合溶液中滴加以上稀释EndoFectin转染试剂；室温培养该溶液10?25分钟，使DNA-EndoFectin混合物产生； 3)转染包装细胞 将DNA-EndoFectin慢病毒复合物直接加细胞板，分散复合物;过夜培养6?8小时，以加入2?5 %热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜培养基更换丨日培养基，培养基中加入I /500体积的TiterBoost试剂； 4)收获慢病毒颗粒 转染两天后收集培养基，以500g离心10分钟，可获得含慢病毒颗粒的培养基;离心后，以0.45μπι的低蛋白结合PES过滤膜过滤该培养基； C、T细胞转染 1)培养板预处理 将20?100yg/ml的重组黏连蛋白Retro Nectin包被在未处理的24孔板上，4°C过夜；用2 %牛血清蛋白BSA封闭半小时；用缓冲液冲洗三遍； 2)病毒呙心 将病毒上清，即由步骤B获得的含病毒培养基以125?250yl/cm2的浓度加到预处理的24孔板上，4?6h，去除上清用PBS冲洗一次； 3)T细胞转染 管中预先加5ml人淋巴细胞分离液，取抗凝血5ml，与生理盐水1:1混匀后，缓慢滴入，以1500转/分离心20分钟，肉眼可见薄膜，吸取此处的单核细胞，放入含生理盐水10毫升的试管中，充分混匀后，以500g离心10分钟;弃液，沉淀经无菌PBS反复洗2次即得所需细胞;将用CD3刺激抗体0KT3及IL-2激活的T细胞以0.2?I X 15个/ml的浓度加入，以2000g的离心力离心1min，孵育72h，即得特异性识别EGFRvII I的含⑶70嵌合抗原受体修饰T细胞。2.根据权利要求1所述的特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于所述固体培养基平板使用时需37°C温箱预热。3.根据权利要求1所述的特异性识别EGFRvIII的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于所述完全培养基的组成为:90 % DMEM+10%胎牛血清。
【文档编号】C12N5/10GK105907790SQ201610451776
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】林志国, 黄建平, 暴洪博, 金林春, 葛海涛, 慕璐岩, 殷博, 殷一博, 龙宇, 杨昌霖, 夏松松, 王佳斌
【申请人】林志国