一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光pcr检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用
【专利摘要】本发明提供一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用，涉及分子生物学技术领域，利用本发明的引物、探针组合物以及多重巢式荧光PCR检测试剂盒可以快速鉴定出阿胶中驴、马、牛和猪源成分。本发明针对阿胶中微量DNA或降解DNA，通过巢式PCR及小片段扩增技术，大大提高了引物及探针有效识别靶点的几率，因此大大提高检测准确性和灵敏度；两步PCR扩增在同一体系进行，具有闭管操作、污染率低、检测灵敏度高、特异性好、准确度高、通量大等有益效果。
【专利说明】
一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针、 试剂盒、检测方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种胶类中药动物源性检测技术领域，具体涉及一种阿胶中驴、马、牛 和猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用，属于分子生物学技术领 域。
【背景技术】
[0002] 阿胶为马科动物驴的皮，经煎煮、浓缩制成的固体胶，原产自山东省泛东阿区，始 载于《神农本草经》，与人参、鹿茸并称为"滋补三宝"，至今已有近三千年历史。阿胶补血圣 药，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，长期服用可补血养 血、美白养颜、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力，适用人群广泛。李时珍著《本草纲目》载："阿胶 《本经》上品。
[0003] 2015版《中国药典》明确规定阿胶为马科动物驴(Equus animusL.)的皮熬制而成 的阿胶为正品阿胶。然而随着胶类市场的不断发展，随着熬胶原料供应紧张和价格上涨，由 于阿胶功效独特，市场供不应求，掺假伪劣产品层出不穷，并不断被媒体曝光。这些劣质阿 胶多采用牛、马、骡子、猪、羊等动物皮、骨、结缔组织熬制，用肉眼难以鉴别，《中国药典》通 过驴的特征态测驴源成分，已不能满足鉴别杂皮源的需求。伪劣阿胶在临床使用后不仅达 不到治疗效果，给消费者健康安全带来巨大隐患。为了取缔和预防假冒伪劣阿胶产品，需要 质量监管部门加大执法力度，而首要前提是具备科学可靠的检测方法。
[0004] 传统的巢式PCR反应由于有2次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶点的可能性，增加 了检测的敏感性和可靠性，主要应用于分子生物学领域和医学检测研究中。而检测结果需 要电泳及凝胶成像系统才能看到结果，从PCR到检测结果出来大约需要5h，而且存在交叉污 染的可能性。由于阿胶经过多个工序的高温煎煮，导致线性基因组DNA断裂成小片段，甚至 降解掉，虽然环状线粒体DNA对高温的耐受力相对线性基因组DNA较强，但阿胶经过深度加 工后都会对DNA不同程度的破坏，如何解决降解DNA成为基于DNA检测技术来检测阿胶真伪 的一大瓶颈。中国专利（CN 104988231. A)利用半巢式PCR技术鉴别阿胶真伪，扩增片段 700bp左右，对于深度加工的胶类中药来讲，DNA已高度破坏，大片段扩增很难成功，加上需 要两轮PCR扩增，不但耗时、开管操作极易造成交叉污染导致假阳性及结果的不准确性所以 不能满足阿胶真伪检测的要求。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢 式荧光PCR检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用，该试剂盒检测灵敏度高、特异性好，可 以实现阿胶中驴、马、牛和猪源性成分快速定性检测;该检测方法快速简便、准确度高。
[0006] 为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
[0007] -种同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测引物、探针 组合物，包括：
[0008] (1)多重巢式荧光PCR检测驴、马、牛和猪源性通用外侧引物，该引物扩增片段为 202bp，其核苷酸序列如下：
[0009] 正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA 3'，如SEQ N0.1 所示；
[0010]反向引物序列：5，TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3，，如SEQN0·2所示 ；
[0011] (2)多重巢式荧光PCR检测驴、马、牛和猪源性通用内侧引物，该内侧引物扩增片段 为143bp，其核苷酸序列如下：
[0012] 正向引物序列：5 'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC 3 '，如SEQ N0· 3所示；
[0013] 反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQN0·4所示 ；
[0014] (3)驴特异性探针，其核苷酸序列如下：
[0015] 5，CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT 3，，如SEQ N0 · 5所示；
[0016] (4)马特异性探针，其核苷酸序列如下：
[0017] 5 ' CAAGATAGGGATAATCCAAAAACTGTTG 3 '，如SEQ N0 · 6所示；
[0018] (5)牛特异性探针，其核苷酸序列如下：
[0019] 5，TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC 3，，如SEQ N0 · 7所示；
[0020] (6)猪特异性探针，其核苷酸序列如下：
[0021 ] 5，CCTCGCACACGCTTACATCAGTA 3，，如SEQ N0 · 8所示；
[0022]其中，所述驴、马、牛和猪特异性探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基 团，所述报告基团为?41、册乂、了411^、1?(^工￥5中的任一种，所述淬灭基团为0&1^71、8即1、 BHQ2中的任一种。
[0023]本发明还可以具有以下附加技术特征：
[0024]优选的，各探针修饰的报告基团和猝灭基团为：
[0025]驴特异探针序列为：
[0026] 5，J0E-CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT-BHQ2 3，JnSEQN0.5K*;
[0027] 马特异探针序列为：
[0028] 5，R0X-CAAGATAGGGATAATCCAAAAACTGTTG-BHQ2 3，JnSEQN0.6K*;
[0029] 牛特异探针序列为：
[0030] 5 'FAM-TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC-BHQ13，，如SEQ N0 · 7所示；
[0031]猪特异探针序列为：
[0032] 5，CY3-CCTCGCACACGCTTACATCAGTA-BHQ2 3，JnSEQN0.8K*。
[0033] 优选的，还包括内标质控体系，构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，所述内标 质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：
[0034] (1)质控体系引物：
[0035]与驴、马、牛和猪源性成分共用一对外侧引物，上游引物序列如SEQ NO. 1所示，下 游引物如SEQ N0.2所示；
[0036] (2)质控体系探针：
[0037] CntP: 5，TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT 3，，如SEQ N0 · 9所示；
[0038] (3)质控体系序列：
[0039] CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT GGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如 SEQ NO · 10所示；
[0040] 其中，质控体系探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述报告基团 为卩厶1、册乂、了六11^、1?(^、0￥5中的任一种，所述淬灭基团为〇31^71、8即1、8即2中的任一种。 [0041 ]进一步的，质控体系探针修饰为：5 ' CY5-TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-BHQ23'JnSEQN0.9K*。
[0042] 本发明还提供一种同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光PCR检 测试剂盒，包括上述的同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测引 物、探针组合物，以及阿胶DNA提取液和多重巢式荧光PCR反应所需试剂。
[0043] 优选的，还包括驴、马、牛和猪阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。
[0044] 优选的，所述多重巢式荧光PCR反应所需试剂包括:多重巢式荧光PCR反应缓冲液2 X qPCRMaster Mix，Taq热启动酶，镁离子浓度2. OmM，4种dNTP的终浓度各为200μΜ，Tris-H2S04pH 9.0终浓度各为300mM，终浓度为600mM的KC1，终浓度为5M/L的甜菜碱和超纯水;所 述试剂盒优先选用20μ1的PCR扩增体系，2XqPCRMaster Mix 10μ1，外侧引物对ΙΟμΜ取ΙμL， 内侧引物对1〇μΜ取ΙμL，探针用量Ρ1 (驴）、Ρ3(牛)和Ρ4(马）终浓度0.25uM，P2猪探针终浓度 为0.5-luM，DNA用量l-50ngAU取2μ1，用双蒸水补足20μ1。
[0045] 优选的，所述试剂盒的PCR扩增步骤为两步:第一步反应优先扩增外侧引物，反应 条件为95°C lOmin; 95°C 10s，70°C，35s，在此收集荧光信号，10个循环;第二步反应优先扩增 内侧引物，反应条件为95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集荧光信号，40个循环。
[0046] 本发明另提供一种鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分多重巢式实时荧光定量PCR 检测方法，包括以下步骤：
[0047] (1)提取待测样品DNA;
[0048] (2)使用上述引物、探针组合物或试剂盒进行两步PCR扩增:第一步反应驴、马、牛 和猪源性通用外侧引物优先扩增，反应条件为95°C lOmin; 95°C 10s，70°C，35s，在此收集荧 光信号，10个循环;第二步反应驴、马、牛和猪源性通用内侧引物优先扩增，反应条件为95 °C 10s，60°C，35s，在此收集荧光信号，40个循环；
[0049 ] (3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照；
[0050] (4)根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定阿胶中是否含有驴、马、牛和猪 源性成分。
[0051] 优选的，所述多重巢式实时荧光定量PCR检测是将多重巢式荧光PCR检测驴、马、牛 和猪源性通用内、外侧引物以及驴、马、牛和猪特异性探针放入同一反应体系中共同扩增， 无需开管。
[0052]优选的，所述PCR扩增为扩增阶段反应需在至少5通道型号的荧光定量PCR仪上进 行，根据不同型号的定量PCR仪的不同要求可以对标记荧光素进行相应的调整。
[0053]本发明再提供上述引物、探针组合物或试剂盒在鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成 分中的应用。
[0054]本发明多重巢式实时荧光定量PCR检测方法，具体包括以下步骤：
[0055] (1)阿胶中核酸提取利用专利CN. 201410317118阿胶DNA提取技术提取核酸DNA，在 此不再赘述。
[0056] (2)靶基因的选择与引物设计：相比基因组而言，线粒体在组织中拷贝数高，而且 阿胶经过深度加工后破坏程度相对小，所以优先选用线粒体16SrDNA基因。设计驴和猪通用 外侧引物及内侧引物。见表1.
[0057] (3)设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，并设计相应的TaqMan探针(如SEQ ID N0.9所示），其方法为:使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后 没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上游5 '端连接上驴、马、牛和猪源性通用 外侧上游引物（如SEQ ID NO. 1所示），下游3'端驴、马、牛和猪源性通用外侧下游引物序列 (如SEQIDN0.2所示），从而形成lllbp的阳性扩增内标DNA序列（如SEQIDN0.10所示），将 这段扩增内标序列委托人工基因合成，合成片段连接载体PMD18-T，转化感受态DH5a，质粒 提取，并测序验证，得到能与驴、马、牛和猪源性共用一对特异性引物(如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示），从而构建阳性内标DNA的重组质粒。
[0058] 表1.引物探针序列
[0059]
[0060] (3)使用上述试剂盒进行巢式实时荧光PCR检测，是将内外侧引物及探针放入同一 反应体系中共同扩增，无需开管，避免污染。PCR反应体系见表2。
[0061] 表2多重巢式荧光PCR反应体系
[0062]
[0063] (4)PCR扩增条件为两步法:95°C lOmin;95°C 10s，70°C，35s，在此收集荧光信号，10 个循环;95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集荧光信号，40个循环。
[0064] (5)结果分析:每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分 析软件，分析实验结果，给出A Rn(第η个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据不同 探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定阿胶中是否含有驴、马、牛和猪源性成分。
[0065] 本发明与现有的检测技术相比其有益效果在于：
[0066] 迷你巢式实时荧光多重PCR(Mini-NEST_Multiple qPCR)检测技术原理:是一种改 良后的巢式PCR技术结合TaqMan探针法的多重实时荧光PCR检测技术，是在一段200_250bp 左右的待扩增靶序列上设计外侧、内侧两对引物，在内侧靶序列上设计TaqMan探针，然后内 外侧引物及探针同时放入荧光定量PCR反应液中，在荧光定量PCR仪上进行热循环反应，使 内外侧引物同时引导新链合成，获得由外-外，内-内，内-外，外-内组合的聚合酶链式反应 产物，大大提高扩增效率，结合物种特异性TaqMan荧光探针，实现了荧光信号的放大积累与 PCR产物形成完全同步检测。该技术整合了巢式PCR与荧光定量PCR的优势特点，不仅大大提 高了检测灵敏度，闭管操作降低污染，提高了准确性和结果的真实可靠性。特别适用于深度 加工制品导致DNA降解及痕量DNA检材领域研究。本发明提供了一种巢式多重荧光PCR (Multiple nested fluorescence PCR)检测技术同时鉴别阿胶中是否含有驴源、猪源性动 物源性成分，该方法有以下优点：
[0067] (1)鉴于阿胶为深度加工制品，DNA破坏性程度大、本发明在靶基因选择上优先选 用线粒体基因其原因在于拷贝数相对基因组高，环状结构相对线性基因组更稳定的特点， 因此大大提尚检测灵敏度；
[0068] (2)本发明针对阿胶中微量DNA或降解DNA，采用mini -NEST-qPCR技术，通过巢式 PCR及小片段扩增技术，大大提高了引物及探针有效识别靶点的几率，因此大大提高检测准 确性和灵敏度。
[0069] (3)本发明采用mini-NEST-qPCR，闭管操作、污染率低、检测灵敏度高、特异性好、 准确度高、通量大等有益效果。
【附图说明】
[0070] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0071] 图l，J〇E荧光修饰驴源性特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出驴源性成分； [0072]图2，FAM荧光修饰牛源性特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出牛源性成分； [0073]图3，CY3荧光修饰猪特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出猪源性成分；图4， R0X荧光修饰马特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出马源性成分；
[0074]图5, J0E荧光修饰驴源性、FAM荧光修饰牛源性特异探针和CY3荧光修饰猪特异探 针同时有扩增曲线时，说明样本同时检出驴、牛和猪源性成分；
[0075]图6，J0E荧光修饰驴源性、FAM荧光修饰牛源性特异探针同时有扩增曲线时，说明 为样本同时检出驴和马源性成分；
[0076]图7，FAM荧光修饰牛源性特异探针和CY3荧光修饰猪特异探针同时有扩增曲线时， 说明为样本同时检出牛和猪源性成分；
[0077]图8,为试剂盒驴源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为O.lpg;
[0078] 图9,为试剂盒猪源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为O.lpg;
[0079] 图10,为试剂盒马源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为o.lpg;
[0080] 图11，为试剂盒牛源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为o.lpg。
【具体实施方式】
[0081] 以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限 制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备 为本领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。
[0082] 1.下列实施例中，所用实验材料、试剂与仪器如下：
[0083] 实验材料：
[0084] 牛、猪、马、驴、骆驼、牦牛、山羊、绵羊、兔、鱼、鸡、鸭、狗、水貂及狐狸等动物皮张或 新鲜组织，阿胶不同厂家不同生产批次20份，均为济南市购。
[0085]所用试剂：
[0086] 动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。DNA分子量MakerDLlOOO、电泳上样缓冲液等 PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公 司负责合成。2 XTaqMan Master Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院 生物技术中心测序中心完成。
[0087] 所用仪器:ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程 (大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。
[0088] 实施例1
[0089] 基于阿胶样品DNA提取:采用专利201410317118.7(-种从阿胶中快速提取DNA的 试剂盒及其提取方法）中公开的方法进行提取，步骤不再赘述，提取的基因组DNA经紫外分 光光度计测定其纯度和浓度。测定0D260/0D280值均为1.8-1.9左右，浓度在lOng/μΙ以上， 说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。
[0090] 1、靶基因的选择与引物设计:相比基因组而言，线粒体在组织中拷贝数高，而且阿 胶经过深度加工后破坏程度相对小，所以优先选用线粒体16SrDNA基因。设计驴和猪通用外 侧引物及内侧引物，扩增片段小，使引物与靶点更容易结合。引物探针序列见表1.
[0091] 2、多重巢式荧光检测试剂盒的设计:该试剂盒包括上述驴和猪通用外侧引物及内 侧引物组合物，驴和猪特异探针混合物，2 X qPCRMaster Mix(由Taq热启动酶、镁离子浓度 2.5禮、4种(1犯13的终浓度各为25(^1、1^8-!12304?!19.0、甜菜碱3%和超纯水组成），此外还 包括驴和猪阳性标准品、阴性对照品（其他源性DNA)和空白对照(双蒸水）。
[0092] 使用上述试剂盒进行多重巢式实时荧光PCR检测，是将内外侧引物及探针放入同 一反应体系中共同扩增，无需开管，避免污染。PCR反应体系20yL见表2。
[0093] 3、PCR扩增条件为两步法:95°C lOmin; 95°C 10s，70°C，35s，在此收集荧光信号，10 个循环;95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集荧光信号，40个循环。
[0094] 4、结果分析:每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析 软件，分析实验结果，给出A Rn(第η个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据不同探 针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定阿胶中是否含有驴、马、猪和牛源性成分。结果见附图1， JOE荧光修饰驴源性特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出驴源性成分，图2，FAM荧光 修饰牛源性特异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出牛源性成分，图3，CY3荧光修饰猪特 异探针有扩增曲线时，说明待检样本检出猪源性成分;图4，R0X荧光修饰马特异探针有扩增 曲线时，说明待检样本检出马源性成分;图5，J0E荧光修饰驴源性、FAM荧光修饰牛源性特异 探针和CY3荧光修饰猪特异探针同时有扩增曲线时，说明样本同时检出驴、牛和猪源性成 分；图6，J0E荧光修饰驴源性、FAM荧光修饰牛源性特异探针同时有扩增曲线时，说明为样本 同时检出驴和马源性成分；图7，FAM荧光修饰牛源性特异探针和CY3荧光修饰猪特异探针同 时有扩增曲线时，说明为样本同时检出牛和猪源性成分。
[0095]实施例2试剂盒特异性验证
[0096]利用本发明提供的检测试剂盒，分别以牛、猪、马、驴、骆驼、牦牛、山羊、绵羊、兔、 鱼、鸡、鸭、水貂及狐狸等动物皮张或新鲜组织提取基因组DNA为模板，按照上述方法进行多 重巢式实时荧光PCR检测，验证本试剂盒的特异性。检测结果见表5,只有驴、猪、马和牛的基 因组DNA被检出，其余动物源性均未检出，说明本试剂盒检测方法具有很好的特异性。
[0097] 表3特异性验证
[0098]
[0099]
[0100] 实施例3灵敏度实验
[0101] 将驴、猪、马和牛基因组DNA分别定量到5X10-2ng/yl，5pgAU和0.5pgAU，(h05pg/ μL，0.005pgAU每个PCR反应分别加入驴、马、牛和猪不同浓度的DNA为模板，加量为2μ1，即 DNA含量分别为0 · lng，0 · Olng，lpg，0 · lpg，0 · Olpg，按照上述PCR体系及检测方法进行扩增， 结果见图8至图11，从图中可以看出，本发明检测限为O.lpg，检测灵敏度到皮克级，相对普 通巢式PCR扩增检测灵敏度提高了 1000倍。
[0102] 实施例4实际样品检测应用
[0103] 市售样本40份，不同品牌厂家及不同生产批次样本，按照本发明提供的检测方法， 提取DNA，进行多重巢式实时荧光PCR检测，见表6，其中18份样本检出驴源性成分，11份样本 同时检出驴和马源性成分，6份样本同时检出驴和猪源性成分，5份样本未检出驴、马、牛和 猪源性成分，说明本发明提供的检测方法具有很好的应用价值。
[0104] 表4实际样品检测
[0105]
[0106] 上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测引物、探针组 合物，其特征在于，包括： (1) 多重巢式荧光PCR检测驴、马、牛和猪源性通用外侧引物，其核苷酸序列如下： 正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA 3'，如SEQ N0.1 所示； 反向引物序列：5'TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3'，如SEQN0·2所示； (2) 多重巢式荧光PCR检测驴、马、牛和猪源性通用内侧引物，其核苷酸序列如下： 正向引物序列：5'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC3'，如SEQN0.3所示 ； 反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQN0·4所示； (3) 驴特异性探针，其核苷酸序列如下： 5'CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT3'JnSEQN0.5K* ; (4) 马特异性探针，其核苷酸序列如下： 5'CAAGATAGGGATAATCCAAAAACTGTTG3'JnSEQN0.6K* ; (5) 牛特异性探针，其核苷酸序列如下： 5'TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC3'JnSEQN0.7K* ; (6) 猪特异性探针，其核苷酸序列如下： 5'CCTCGCACACGCTTACATCAGTA3'JnSEQN0.8K*; 其中，所述驴、马、牛和猪特异性探针的5 '端修饰有报告基团，3 '端修饰有淬灭基团，所 述报告基团为?41、册父、了六11^、1?(^、0￥5中的任一种，所述淬灭基团为〇31^71、8闕1、8即2中 的任一种。2. 根据权利要求1所述的同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光PCR 检测引物、探针组合物，其特征在于，还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体 系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下： (1) 质控体系引物： 上游引物序列如SEQ NO. 1所示，下游引物如SEQ NO.2所示； (2) 质控体系探针： CntP: 5 ' TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT 3 '，如SEQ NO · 9所示； (3) 质控体系序列： CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTC CATTGGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如 SEQ NO · 10所示； 其中，质控体系探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述报告基团为 卩八1、冊乂、了六11^、1?(^、0￥5中的任一种，所述淬灭基团为〇31^71、8即1、8即2中的任一种。3. -种同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测试剂盒，其特 征在于，包括权利要求1或2所述的同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光 PCR检测引物、探针组合物，以及阿胶DNA提取液和多重巢式荧光PCR反应所需试剂。4. 根据权利要求3所述的同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光PCR 检测试剂盒，其特征在于，还包括驴、马、牛和猪阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。5. 根据权利要求3或4所述的同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光 PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重巢式荧光PCR反应所需试剂包括:多重巢式荧光PCR 反应缓冲液2 X qPCRMaster Mix，Taq热启动酶，镁离子浓度2. OmM，4种dNTP的终浓度各为 200μΜ，Tris-H2S04pH 9.0，终浓度为600mM的KCl，终浓度为5M/L的甜菜碱和超纯水;所述试 剂盒为20ylPCR反应扩增体系：2XqPCRMaster Mix ΙΟμΙ，外侧引物对ΙΟμΜ取ΙμL，内侧引物 对ΙΟμΜ取ΙμL，探针用量驴、牛和马终浓度各0.25uM，P2猪探针终浓度为0.5-luM，DNA用量1-50ngAU取2μ1，用双蒸水补足20μ1。6. 根据权利要求5所述的同时鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分的多重巢式荧光PCR 检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增步骤为两步:第一步反应优先扩增外侧引 物，反应条件为95°C IOmin; 95°C IOs，70°C，35s，在此收集荧光信号，10个循环;第二步反应 优先扩增内侧引物，反应条件为95 °C IOs，60 °C，35s，在此收集荧光信号，40个循环。7. -种鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分多重巢式实时荧光定量PCR检测方法，其特 征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测样品DNA; (2) 使用权利要求1或2所述引物、探针组合物或权利要求3-6任一项所述试剂盒进行两 步PCR扩增:第一步反应驴、马、牛和猪源性通用外侧引物优先扩增，反应条件为95 °C IOmin; 95°C IOs，70°C，35s，在此收集荧光信号，10个循环;第二步反应驴、马、牛和猪源性通用内侧 引物优先扩增，反应条件为95 °C IOs，60 °C，35s，在此收集荧光信号，40个循环； (3) 设立阳性对照、阴性对照及空白对照； (4) 根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定阿胶中是否含有驴、马、牛和猪源性 成分。8. 根据权利要求7所述鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分多重巢式实时荧光定量PCR 检测方法，其特征在于，所述多重巢式实时荧光定量PCR检测是将多重巢式荧光PCR检测驴、 马、牛和猪源性通用内、外侧引物以及驴、马、牛和猪特异性探针放入同一反应体系中共同 扩增，无需开管。9. 根据权利要求7或8所述鉴别阿胶中驴、马、牛和猪源性成分多重巢式实时荧光定量 PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增为扩增阶段反应需在至少5通道型号的荧光定量 PCR仪上进行。10. 权利要求1或2所述引物、探针组合物或权利要求3-6任一项所述试剂盒在鉴别阿胶 中驴、马、牛和猪源性成分中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105907852SQ201610272771
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】张全芳, 刘艳艳, 范阳阳, 步迅
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心