一种用于动脉血栓的分子标记物和试剂及其应用
【专利摘要】一种用于动脉血栓的分子标记物和试剂及其应用。本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种用于动脉血栓诊断的分子标志物，尤其涉及血液中的分子标志物Atf3基因及Atf3基因表达产物在制备动脉血栓试剂中的应用，以及用于诊断动脉血栓的试剂。所述分子标记物为激活转录因子Atf3基因和/或Atf3基因的表达产物。所述试剂包括激活转录因子Atf3基因和/或Atf3基因的表达产物。本发明发现了Atf3基因表达与动脉血栓的相关性，通过检测受试者中Atf3基因的表达，可以判断受试者是否患有动脉血栓症、或者判断受试者是否存在患有动脉血栓症的风险，从而将其应用在制备诊断动脉血栓的试剂中。
【专利说明】
一种用于动脉血栓的分子标记物和试剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种用于动脉血栓诊断的分子标志物， 尤其涉及一种用于动脉血栓诊断的分子标志物激活转录因子3 ( a c t i V a t i n g transcription factor 3，Atf3)基因及Atf3基因表达产物，在制备动脉血栓试剂中的应 用，以及用于诊断动脉血栓的试剂。
【背景技术】
[0002] 动脉血栓大多是在动脉粥样硬化的基础上形成的。由于动脉中血流速度高，所以 即使凝血过程被激活，在局部也不能积蓄足够的凝血酶，只有在动脉粥样硬化斑块破溃、内 皮细胞受到损伤时才会使血小板黏附、聚集，造成管腔狭窄，使得局部积蓄有效浓度的凝血 酶。凝血酶使纤维蛋白原转变成纤维蛋白而形成血栓。动脉粥样硬化除了与一些先天性因 素相关外，大多与饮食生活习惯有关。饮食结构不合理，大量摄入高脂肪、高糖食物会增加 患病几率。另外，吸烟、酗酒、缺乏运动也是动脉血栓形成的重要因素。
[0003] 血管源性动脉瘤、动脉硬化时动脉硬化粥样物质形成的栓塞。大的栓塞可来源于 大的动脉粥样物质、血栓和胆因醇结晶的混合物，脱落到动脉循环。小的栓塞由于胆因醇结 晶的释放或由于溃疡性动脉硬化斑点脱落引起。许多报道说明周围动脉栓塞最常病因是心 源性。栓塞来自心脏病者占94 %，其中77 %伴有心房颤动。动脉硬化性的冠状动脉心脏病， 包括心肌梗塞、房颤、充血性心力衰竭和室壁动脉瘤约占60 %，风湿性心脏病占20%。风湿 性心脏病和冠状动脉性心脏病，二者都有左心内的血栓形成。患病人群主要为中老年人;高 血压、高血脂、高(血液)粘度、高烟瘾的人;冠心病、发作心梗的人、房颤的人、动脉粥样硬化 和腹主动脉瘤的人是高发动脉栓塞人群。
[0004] 为了提高动脉血栓的治疗有效率，降低患者和国家的经济负担，寻找一种用于动 脉血栓早期诊断的方法是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的现有技术的问题是:现有技术中并没有针对动脉血栓的快速检测 产品，动脉血栓发现时往往都是后期，给病人带来极大的危害。
[0006] 为了解决上述问题，本发明人在锐意研究之后，发现一种用于动脉血栓早期诊断 的分子标记物，即Atf3基因及其编码的ATF3蛋白（转录激活因子，Activating transcription factor 3)，通过研究发现动脉血栓患者中Atf3基因的表达水平明显增高。 相比传统的动脉血栓的诊断方法，使用基因标志物来诊断动脉血栓具有及时性、特异性、灵 敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险大小采取相应的预防和治疗措 施。
[0007] 具体而言，本发明提供了如下技术方案：
[0008] -方面，本发明提供了一种用于动脉血栓的分子标记物，所述分子标记物为激活 转录因子Atf3基因和/或Atf3基因的表达产物。
[0009] 优选的，所述Aft3基因的表达产物包括Atf3mRNA和/或激活转录因子ATF3蛋白。 [0010] 优选的，所述Atf3基因的序列包括以下任意一种DNA分子：
[0011] (1):序列SEQ ID N0 · 1 所不的DNA序列；
[0012] (2):与序列SEQ ID NO. 1杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0013] (3):与（1)或（2)限定的DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。
[0014] 更优选的，所述Atf3基因的序列与（1)或（2)限定的DNA序列具有具有90%以上同 源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
[0015] 优选的，所述ATF3蛋白包括以下任意一种蛋白质分子：
[0016] (1):序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0017] (2):序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加，且与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所 示的氨基酸序列衍生的蛋白质；
[0018] (3):与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，优选地，与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少为90%至95%的同源性，更优选地，为96 %、97 %、98%、99 %同 源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0019] 更优选的，第(2)种中，所述取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，进 一步优选为1-10个。
[0020] 更优选的，第(3)种中，与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少为90%至95%的同 源性，进一步优选为96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0021] 另一方面，本发明提供了用于动脉血栓的试剂，所述试剂包括激活转录因子Atf3 基因和/或Atf 3基因的表达产物。
[0022] 优选的，所述试剂包括芯片、试剂盒、试纸和高通量测序用试剂。
[0023] 优选的，所述试剂包括用于序列SEQ ID NO. 1扩增的引物序列SEQ ID N0.3和SEQ ID NO .4所示。
[0024] 优选的，所述试剂通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量 测序平台制得。
[0025] 优选的，所述试剂的作用对象包括血液、组织液、尿液、唾液或脊髓液。
[0026] 优选的，所述Atf3基因的序列包括以下任意一种DNA分子：
[0027] (1):序列SEQ ID N0 · 1 所不的DNA序列；
[0028] (2):与序列SEQ ID NO. 1杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0029] (3):与（1)或（2)限定的DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。
[0030] 更优选的，所述Atf3基因的序列与（1)或（2)限定的DNA序列具有具有90%以上同 源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
[0031] 优选的，所述ATF3蛋白包括以下任意一种蛋白质分子：
[0032] (1):序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0033] (2):序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加，且与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所 示的氨基酸序列衍生的蛋白质；
[0034] (3):与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，优选地，与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少为90%至95%的同源性，更优选地，为96 %、97 %、98%、99 %同 源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0035] 更优选的，第(2)种中，所述取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，进 一步优选为1-10个。
[0036] 更优选的，第(3)种中，与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少为90%至95%的同 源性，进一步优选为96 %、97 %、98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肽。第三方面，本 发明提供了以上任一项所述的分子标记物在制备诊断和/或治疗动脉血栓的试剂中的应 用。
[0037]本发明人经过锐意研究发现了 Atf3基因和/或其表达产物作为动脉血栓诊断的分 子标记物，并将其应用在制备诊断动脉血栓的试剂或工具中。
[0038] 进一步，上面所提到的试剂或工具包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原 位杂交、芯片或高通量测序平台检测Atf3基因表达水平以诊断动脉血栓的试剂。
[0039]其中，用RT-PCR获得的试剂至少包括一对特异扩增Atf3基因的引物；用实时定量 PCR的方法获得的试剂至少包括一对特异扩增Atf 3基因的引物；
[0040] 用免疫检测方法获得的试剂包括与Atf3蛋白特异结合的抗体;用原位杂交方法获 得的试剂包括:与Atf 3基因的核酸序列杂交的探针;用芯片方法获得的试剂包括:蛋白芯片 和基因芯片。其中，蛋白芯片包括与Atf3蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与Atf3基因 的核酸序列杂交的探针。
[0041] 随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便利的工 作。通过对比疾病患者和正常患者的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。 因此，在高通量测序中获知Atf3基因的异常与动脉血栓相关也属于Atf3基因的用途，同样 在本发明的保护范围之内。
[0042] 本发明中的芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固 定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测Atf3基因转录水平的针对 Atf3基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的Atf3蛋 白的特异性抗体;所述基因芯片可用于检测包括Atf3基因在内的多个基因（例如，与动脉血 栓相关的多个基因）的表达水平。通过将多个与动脉血栓的标志物同时检测，可以大大提 高动脉血栓诊断的准确率。
[0043] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试 剂盒包括用于检测Atf3基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括Atf3蛋白的特 异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方 法检测Atf3基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对Atf3基因的引物 和/或探针。根据Atf3基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测Atf3基因表达水平 的引物和探针。
[0044] 所述高通量测序试剂为检测Atf3基因表达水平的试剂。
[0045] 所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测 Atf 3基因的转录水平。
[0046] 与Atf3基因的核苷酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它 衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结 合，任何长度都可以。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探 针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的 长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效 率。
[0047] 进一步，所述Atf3蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述Atf3蛋白 的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰。只要所述片段能够保留与 Atf3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且 本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
[0048] 用于诊断动脉血栓的Atf3基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、 尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断动 脉血栓的Atf 3基因及其表达产物的来源是血液。
[0049] 本发明所取得的有益效果为：
[0050] (1)本发明首次发现了Atf3基因表达与动脉血栓的相关性，通过检测受试者中 Atf3基因的表达，可以判断受试者是否患有动脉血栓症、或者判断受试者是否存在患有动 脉血栓症的风险，从而指导临床医生给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0051] (2)本发明发现了一种新的分子标记物Atf3基因及其表达产物，利用本发明的分 子标记物制备用于检测动脉血栓的试剂，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、 更灵敏，能够实现动脉血栓的早期诊断，从而降低动脉血栓病症的死亡率。
[0052]下面结合附图和各个【具体实施方式】，对本发明及其有益技术效果进行详细说明。
【附图说明】
[0053]图1为利用QPCR检测Atf3基因 （SEQ ID N0.1)在动脉血栓患者和正常人中的表达 差异图。
[0054] 图2为利用Western Blot检测Atf3蛋白（SEQ ID N0.2)在动脉血栓患者和正常人 中的表达差异图。
[0055] 图3显示利用Western Blot检测Atf3蛋白（SEQ ID N0.2)在动脉血栓患者和正常 人中的表达差异图。
【具体实施方式】
[0056] 如上所述，本发明提供了一种用于动脉血栓的分子标记物Atf3基因和/或Atf3基 因表达产物，以及它们在制备诊断或治疗动脉血栓的试剂中的应用和诊断或治疗动脉血栓 的试剂。
[0057] 其中，在一种优选实施方式中，本发明提供了一种用于动脉血栓的试剂，所述试剂 包括DNA序列SEQ ID N0.1。
[0058] 在另一种优选实施方式中，本发明提供了一种用于动脉血栓的试剂，所述试剂包 括蛋白质序列SEQ ID N0.2。
[0059] Atf3基因序列SEQ ID Ν0· 1为：
[0060]
[0062] Atf3蛋白序列SEQ ID N0.2序列：
[0063] MMLQHPGQVSASEVSASAIVPCLSPPGSLVFEDFANLTPFVKEELRFAIQNKHLCHRMSSALESVTVSD RPLGVSITKAEVAPEEDERKKRRRERNKIAAAKCRNKKKEKTECLQKESEKLESVNAELKAQIEELKNEKQHLIYML NLHRPTCIVRAQNGRTPEDERNLFIQQIKEGTLQS
[0064] 需要说明的是，本发明中的Atf3基因为广义上的Atf3基因，包括狭义上的Atf3基 因以及任何与狭义上的Atf3基因功能等同的多核苷酸片段。而狭义上的Atf3基因包括与 DNA序列SEQ ID N0.1具有70%以上的同源性，且编码相同功能蛋白的DNA序列。
[0065] 在本发明的上下文中，Atf 3基因表达产物包括Atf 3mRNA和/或ATF3蛋白以及ATF3 蛋白的部分肽段。而本发明中的Atf3蛋白的部分肽段是指ATF3蛋白中与动脉血栓相关的功 能域。
[0066] 本发明中的Atf3蛋白是指广义上的Atf3蛋白，包括序列SEQIDN0.2本身，以及由 序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加，且与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列 衍生的蛋白质;优选地，取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，更优选地是1-10个；以及与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，优选地，与SEQ ID N0.2 所示的氨基酸序列至少为90 %至95 %的同源性，更优选地，为96 %、97 %、98 %、99 %同源性 的氨基酸序列构成的多肽。
[0067]而本领域技术人员公知的是，通常蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋 白质的功能。本领域技术人员能够得知的是，改变蛋白质中的单个氨基酸或者改变蛋白质 中一定比例(小百分比）的氨基酸或者对蛋白质进行个别氨基酸的添加、缺失、插入、替换等 保守性修饰，只要改变不会引起蛋白质主要功能的改变，仍然是具有相似功能的蛋白质，就 包含在本发明的广义的Atf3蛋白的保护范围之内。其中，通过添加一个氨基酸或多个氨基 酸残基修饰的蛋白质的例子是ATF3蛋白的融合蛋白。对于与Atf3蛋白融合的肽或者蛋白质 没有限制，只要所得的融合蛋白保留Atf3蛋白的生物学活性即可。
[0068]在本发明的上下文中，诊断动脉血栓既包括判断受试者是否已经患有动脉血栓、 也包括判断受试者是否存在患有动脉血栓的风险。
[0069] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。其中，实施例中未注明条件的试验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验手册（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。
[0070] 其中，本发明实施例中所用试剂和试剂盒的型号及厂商如下：
[0071] 血液RNA提取试剂盒，购于北京百泰克生物技术有限公司；
[0072] 逆转录试剂盒，购于：日本Toyobo公司，货号:FSQ_101
[0073] QPCR试剂盒，购于：美国Applied Biosystems公司，货号：4472908
[0074] 蛋白提取试剂盒，购于:美国Sigma公司，货号:PR0TT0T-1KT
[0075] BCA蛋白测定试剂盒，购于:美国Sigma公司，货号:BCA1-1KT
[0076] 实施例一
[0077] QPCR实验验证动脉血栓患者和正常人中差异表达的基因
[0078] 1、研究对象：
[0079] 随机选择已经进行影像学检测确诊为动脉硬化、动脉血栓的患者25例，正常人对 照组20例，年龄50-68岁。问卷方式调查受试者生活方式和健康状况。
[0080] 2、血液总RNA提取
[0081 ] 使用百泰克血液RNA提取试剂盒进行血液总RNA的提取
[0082] (1)取全血250μ1 (或0 · 25g)至RNase-Free过滤柱中，13000rpm离心2min，收集下 液，加入0.75ml裂解液RLS。
[0083] (2)将匀浆样品剧烈震荡混勾，在15-30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分 解。
[0084] (3)可选步骤:4°C条件下12000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无 RNA酶 的离心管中。
[0085] (4)每lml RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下孵育3 分钟。
[0086] (5)于4°C 12000rpm离心10分钟，样品会分成三层:下层有机相，中间层和上层无色 水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加 RLS体积的60%，把水相转移到新管中， 进行下一步操作。
[0087] (6)加入1倍体积70%乙醇，颠倒混匀（可能会有沉淀），得到的溶液和可能沉淀一 起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。
[0088] (7) lOOOOrpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
[0089] (8)加500μ1去蛋白液RE，12000rpm离心45秒，弃掉废液。
[0090] (9)加入700μ1漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
[0091] (10)加入500μ1漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
[0092] (11)将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂 洗液中残留乙醇抑制下游反应。
[0093] (12)取出吸附柱RA，放入一个无 RNA酶的离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的 中间部位加50-80μ1无 RNA酶的超纯水，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
[0094] 3、RNA样品的质量(eppendorf分光光度计）
[0095] Eppendorf分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：0D260/0D280为 1·8_2·2 〇
[0096] 4、逆转录
[0097] 用逆转录缓冲液对lyg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μ1反应体系，每个样品 取lyg总RNA作为模板RNA，在PCR管中按照表1所示，分别加入如下组分，然后在42 °C孵育lh， 72 °C 1 Omin，短暂离心。
[0098] 表1 PCR逆转录体系
[0099]
[0100] 5、QPCR
[0101] 采用25μ1反应体系，按照表2所示的聚合酶链式反应体系和表3所示的引物序列进 行0?〇財广增，扩增程序为:95 ￡€5!1^11，（95°(：158,6〇1€6〇8)42个循环，每个样本设置3个平行 管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。注意各项操作均于冰上进行。
[0102] 表2 SYBR Green聚合酶链式反应体系 「01031
[0104] 表3用于Atf3基因和GAPDH基因扩增的引物序列
[0105]
[0106]
[0107] 以SYBR Green(购于life technologies)作为焚光标记物，在Light Cycler焚光 实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线和电泳确定目的条带，CT法进行相对定量。
[0108] 6、结果
[0109] 结果如图1所示。从图1的结果可以看出，与正常人相比，动脉血栓患者血液中Atf3 基因的mRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0110] 实施例二
[0111] Western Blot实验验证动脉血栓患者与正常人Atf3蛋白表达差异
[0112] 1、研究对象：
[0113] 随机选择已经进行影像学检测确诊为动脉硬化、动脉血栓的患者9例，正常人对照 组7例，年龄50-68岁。问卷方式调查受试者生活方式和健康状况。
[0114] 2、提取蛋白
[0115] (1)取对数生长期的细胞，加入裂解液和蛋白酶抑制剂（100:1)(美国Invitrogen 公司），吹匀，冰上放置30min，期间涡旋4次每次10秒。
[0116] (2)4°C 12000rpm离心10min。
[0117] (3)取上清液，_80°C冻存备用。
[0118] 3、蛋白质浓度测定
[0119] 按BCA蛋白测定试剂盒(美国Sigma公司)操作
[0120] (1)取4支1.5ml EP管，标记1、2、3、空白，各加入含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂 解液25μ1，再取2mgAil标准液(BSA)25yl，加入1号管，混匀后取出25μ1加入2号管，混匀后取 出25μ1加入3号管，混匀后取出25μ1弃去，完成稀释过程。
[0121] (2)取25μ1样品蛋白加入1.5ml ΕΡ管中
[0122] (3)取试剂A=(标准管数+空白管数+样品管数)200μ1，Β=(标准管数+空白管数+ 样品管数)4μ1，将两试剂混匀，配成工作液。
[0123] (4)向1、2、3、空白及样品管中加入200μ1工作液，混匀后置于37°C孵育30min，之后 冷却至室温。
[0124] (5)采用紫外分光光度法，以A = 562nm波长比色，用空白管液调零，以BSA为标准， 计算样品中蛋白质浓度。
[0125] (6)将准备好的样品加入适量的5 X loading buffer，99°C蛋白变性5-1 Omin，获得 蛋白样品，准备SDS-PAGE电泳。
[0126] 4、SDS-PAGE 电泳
[0127] (1)准备
[0128] 将玻璃板彻底清洗干净，固定好之后加水检漏。
[0129] (2)配胶
[0130]分离胶加胶达2/3再加水压胶20_左右，凝胶后倾去水，加浓缩胶至满，装梳子。
[0131] (3)待胶凝固后，拔出梳子在电泳槽中加500μ1 1 Xrunning buffer上样。
[0132] (4)盖上盖子，接通电源，浓缩胶用80V，45min，分离胶用110V，60min，当溴酚蓝刚 好跑出胶或者目的蛋白跑至下胶中央时可终止电泳，准备转膜。
[0133] 5、转膜
[0134] (1)准备三个平皿，分别盛甲醇、超纯水、转膜缓冲液同时裁剪两张 PVDF膜，四张3M 滤纸，与胶大小一致即可。PVDF膜要大于滤纸，提前30min准备，每个皿中浸泡lOmin。
[0135] (2)撬掉玻璃板，裁去上胶，取下胶，将下胶与3M滤纸在转膜缓冲液中浸泡lOmin。 同时将膜依次在甲醇、纯水、转膜缓冲液中浸泡lOmin。从胶上切去需要的部分，记录好加样 顺序，同时标记好PVDF膜的方向。
[0136] (3)用转膜缓冲液浸湿电转仪，从下到上依次为滤纸、膜、胶、滤纸，叠方式要不断 撵去气泡，务使两边滤纸相互接触，以防发生短路。
[0137] (4)盖上金属盖，接通电源，转膜电压25V，转移45min。
[0138] 6、封闭
[0139] (1)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分 钟，以洗去膜上的转膜液。
[0140] (2)用微型台式真空栗吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温 封闭60分钟。
[0141] 7、一抗孵育
[0142] (1)参考一抗的说明书，按照适当比例用Western-抗稀释液稀释一抗。
[0143] (2)用微型台式真空栗吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4°C在侧摆摇 床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4°C缓慢摇动孵育过夜。
[0144] (3)回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗 涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
[0145] 8、二抗孵育
[0146] (1)参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶 (HRP)标记的二抗。
[0147] (2)用微型台式真空栗吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4°C在侧摆摇 床上缓慢摇动孵育一小时。
[0148] (3)回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗 涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
[0149] 9、蛋白检测
[0150] 洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒 自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
[0151] 1〇、结果
[0152] Western Blot实验结果如图2和图3所示。其中，从图2和图3的结果可以看出，与正 常人相比，动脉血栓患者的血液中Atf3蛋白的水平明显增加，差异具有统计学意义（P〈 0.05)〇
[0153] 上述实验例的说明只是用于理解本发明的方法及核心思想。应当指出，对于本领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和 修饰，这些改进和修饰也将落入本发明的权利要求的保护范围内。
[0154] SEQUENCE LISTING <110>天津脉络生物科支有限公司 <120 -种用于动脉血栓的分子标记物和试剂及其应用 <13. OICNI60011 < 160 > 6 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 543 <212> DNA <213> .人属（Homo sapiens ) <40Q> 1 atgatgcttc aacacccagg ccaggtctct gcctcggaag tgagtgcttc tgccatcgtc 60 ecGtgcctgt cceetcctgg gtcaetggtg tttgaggatt ttgctaaGct gaegGCCttt 120 gtcaaggaag agctgaggtt tgccatccag aacaagcacc tctgccaccg gatgtcctct 180 gcgctggaat cagtcactgt cagcgacaga cccctcgggg tgtccatcac aaaagccgag 240 gtagcccctg aagaagatga aaggaaaaag aggcgacgag aaagaaaraa gattgcagct 300 gcaaagtgcc gaaacaagaa gaaggagaag acggagtgcc tgcagaaaga gtcggagaag 360
[0155] ctggaaagtg tgaatgctga actgaaggct cagattgagg agctcaagaa cgagaagcag 420 catttgatat acatgeteaa ccttcatcgg cccacgtgta ttglGCgggc tcagaatggg 480 aggactccag aagatgagag aaacctcttt atccaacaga taaaagaagg aacattgcag 540 age 54.3 <210> 2 <211> 181 <212> PRT <213> 人属（Home) sapiens ) <400> 2 Met Met Leu Gin His Pro Gly Gin Val Ser Ala Ser Glu Val Ser Ala 1 5 10 15 Ser Ala lie Val Pro Cys Leu Ser Pro Pro Gly Ser Leu Val Phe Glu 20 2.5 30 Asp Phe Ala Asn Leu Thr Pro Phe Val Lys Glu Glu Leu Arg PLi? Ala 35 40 45 He Gin Asn Lys His Leu Cys His Arg Met Ser Ser Ala Leu Glu Ser 50 55 60 Val 'Thr Val Ser Asp Arg Pro Leu Gly Val Ser lie Thr Lys Ala Glu 65 70 75 80 Val Ala Pro Glu G!u Asp Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Arg Asn 85 90 95 Lys lie Ala Ala Ala Lys Cys Arg Asn Lys Lys Lys Glu Lys Thr Glu 100 105 110
[0156] Cys Leu Gin Lys Giu Ser Glu Lys Leu Giu Ser Va! Asn Ala Glu Leu 115 120 12、 Lys Ala Gin lie Glu Glu Leu Lys Asn GIli Lys Gin His Leu lie 丁yr 130 135 140 Met Leu A§n ,Leu .Hi:$ Arg Pro 丁hr Cy s. lie Val Afg Ala Asn _Gly 145 150 155 160 Arg Thr Pro Glu Asp Glu Arg Asn Leu Fhe lie Gin Gin lie Lys Glu 165 170 175 Gly Thr Leu Gin Ser 180 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉
[0157] <400 3 argatgcttc aacacccagg c 21 <2i0> 4 <21!> 30 <212> DNA <213>人工序列： <220> <223> <400> 4 gctUgcaal gUt^ttctt ttatctgttg 30 <210〉 5 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> <400> 5 tttaactctg glaaagtgga tat 23
[0158] 。 <210> 6 <21]> 20 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223> <400> 6 ggtggaatea tattggaaca 20
【主权项】
1. 一种用于动脉血栓的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物为激活转录因子 Atf3基因和/或Atf 3基因的表达产物。2. 根据权利要求1所述的分子标记物，其特征在于，所述Aft3基因的表达产物包括Atf 3 mRNA和/或激活转录因子ATF3蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的分子标记物，其特征在于，所述Atf3基因的序列包括以下 任意一种DNA分子： (1) :序列SEQ ID NO. 1所不的DNA序列； (2) :与序列SEQ ID NO.1杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列； ⑶：与⑴或⑵限定的DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分 子;优选地，具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。4. 根据权利要求2或3所述的分子标记物，其特征在于，所述ATF3蛋白包括以下任意一 种蛋白质分子： (1) :序列SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (2) :序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加，且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的 氨基酸序列衍生的蛋白质；优选地，取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，更 优选地是1 _1〇个； (3) :与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，优选地，与SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列至少为90 %至95 %的同源性，更优选地，为96 %、97 %、98 %、99 %同源性 的氨基酸序列构成的多肽。5. -种用于动脉血栓的试剂，其特征在于，所述试剂包括激活转录因子Atf 3基因和/或 Atf3基因的表达产物。6. 根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括芯片、试剂盒、试纸和高通量 测序用试剂。7. 根据权利要求5或6所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于序列SEQ ID NO. 1扩 增的引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。8. 根据权利要求5-7中任一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂通过RT-PCR、实时定 量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台制得。9. 根据权利要求5-8中任一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂的作用对象包括血 液、组织液、尿液、唾液或脊髓液。10. 根据权利要求5-9中任一项所述的试剂，其特征在于，所述Atf3基因的序列包括以 下任意一种DNA分子： (1) :序列SEQ ID NO. 1所不的DNA序列； (2) :与序列SEQ ID NO.1杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列； ⑶：与⑴或⑵限定的DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分 子;优选地，具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。11. 根据权利要求5-10中任一项所述的试剂，其特征在于，所述ATF3蛋白包括以下任意 一种蛋白质分子： (1):序列SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (2) :序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加，且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的 氨基酸序列衍生的蛋白质；优选地，取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，更 优选地是1 _1〇个； (3) :与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，优选地，与SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列至少为90 %至95 %的同源性，更优选地，为96 %、97 %、98 %、99 %同源性 的氨基酸序列构成的多肽。12.权利要求1-4中任一项所述的分子标记物在制备诊断和/或治疗动脉血栓的试剂中 的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105907857SQ201610287125
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】刘鹏飞, 王菁蕊, 韩雪, 姬晓兵
【申请人】天津脉络生物科技有限公司