水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物及应用
【专利摘要】本发明公开了水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物及应用。
【申请人】通过将携带不同Pita等位基因的水稻品种测序及序列比对在Pita编码区内含子鉴定到一个Pita特异性位点并开发了一套鉴定该目标位点的分子标记引物，分别为：SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT；SR：GCCAAATAGCCAATTCATA；RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT；RR：CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC。利用该引物对水稻种质资源DNA进行PCR扩增，可快速判断待测试水稻Pita的基因型，从而将携带抗性等位基因的材料应用于生产。方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pita基因型鉴定。
【专利说明】
水稻抗稻瘟病基因 P i ta特异性分子标记引物及应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子遗传学领域，具体涉及水稻抗稻瘟病基因 Pita特异性分子标记引 物及应用，本发明提供的Pita特异性分子标记引物适用于在水稻育种中针对Pita基因型的 分子标记辅助选择，实现对现有栽培稻品种稻瘟病抗性的改良；以及从水稻种质资源中鉴 定、筛选新的Pita抗性基因应用于水稻育种与生产，增强栽培稻稻瘟病抗性。 技术背景
[0002] 水稻稻瘟病是危害水稻生产的最严重的病害，同时也是可以利用抗性基因进行有 效控制的病害。稻瘟病每年都会对水稻生产造成巨大的损失，目前主要通过化学药剂进行 防控，不但增加了生产成本，也对环境造成了污染。利用稻瘟病抗性基因选育具有稻瘟病抗 性的水稻品种具有生产成本低、抗性效果强、环境友好等一系列优点，适于大面积推广种 植。但是目前水稻育种中对稻瘟病抗性的筛选还是利用表型鉴定，通过筛选大田中自然诱 发的群体获得抗病品种。由于不同年份和地区稻瘟病发病程度不一，不得不通过多年、多点 试验进行抗性筛选，因此该方法效率低下，成本高，并且筛选到的单株抗性表型不准确，不 宜在生产中推广利用。分子标记辅助选择是一种快速、简便、成本低廉并可在水稻生长早期 进行无损检测的一种技术，通过分子标记筛选可直接将已知的抗性基因导入感病品种，改 良稻瘟病抗性。
[0003] Pita位于水稻12号染色体，是一个具有对稻瘟病生理小种具有广谱抗性的基因， 该基因编码区包含2个外显子和1个内含子，编码蛋白长度928aa，因此通过开发Pita特异性 分子标记，利用分子标记辅助选择将Pita抗性等位基因导入到栽培稻品种，对栽培稻稻瘟 病抗性的改良将具有重要的意义。
[0004] 与传统的利用单个碱基的差异即SNP位点与PCR-CTPP方法设计的引物相比，我们 开发的标记在两条内引物的3'有4个碱基的差异，而传统方法只有1个碱基差异，因此这套 标记特异性更强，不会出现传统方法的由于非特异性结合产生的假阳性和弱阳性条带，并 且该方法更稳定、结果更准确，并且简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择 育种或水稻资源中对Pita基因型鉴定、筛选的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了鉴定水稻抗稻瘟病基因 Pita的特异性分子标记引物，包 ?：SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT；SR：GCCAAATAGCCAATTCATA；RF： CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT; RR: CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC。引物特异性好，扩增效 率高，方法简便易行，可广泛应用于水稻抗稻瘟病基因 Pita的基因型鉴定。
[0006] 本发明的另一个目的是提供了一种水稻抗稻瘟病基因 Pita的特异性分子标记引 物在水稻种质资源中Pita基因型鉴定或水稻抗稻瘟病基因 Pita的分子育种中的应用，利用 该引物可以有效的对水稻资源中抗、感稻瘟病等位基因 Pita进行基因型鉴定，通过鉴定、筛 选新的Pita抗性基因应用于水稻育种与生产，增强现有栽培稻品种稻瘟病抗性。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采取了以下技术措施：
[0008] 本发明技术方案采取以下思路:Pita位于水稻12号染色体，编码区包含2个外显子 和1个内含子，编码蛋白长度928aa，通过对已知的分别包含Pi ta抗病等位基因与感病等位 基因的水稻品种的Pita编码区进行PCR扩增、测序与序列比对（图1，表1)，在编码区的+ 2001bp即内含子中鉴定到一处特异性编码序列（图2A)，其中抗病等位基因的核苷酸序列为 GCC，而对应感病等位基因序列为CTAT，因此，通过设计特异性引物对该目标位点特异性扩 增即可实现Pita等位基因的鉴定。
[0009] 引物设计原理如下（图2B):在设计抗病等位基因鉴定引物时，首先以鉴定到的抗 病等位基因特异性序列GCC作为反向引物的3'端设计反向引物RR，在上游设计正向引物RF， 因此，RR的3 '端无法与感病等位基因的对应序列CTAT结合，从而只能扩增抗病等位基因，获 得一条104bp的条带;在设计感病等位基因鉴定引物时，则以目标特异性序列CTAT作为正向 弓丨物的3'端设计正向引物SF，在下游设计反向引物SR，因此，SF的3'端无法与感病等位基因 的对应序列GCC结合，从而只能扩增感病等位基因，获得一条179bp的条带;两对引物等量混 合扩增便可实现对水稻Pita抗感基因型的鉴定，并且两种基因型均有一个240bp的共有条 带，此外，该标记还是共显性标记，杂合基因型将扩增出104bp、179bp和240bp共3条条带。4 条引物名称、序列、Tm值及扩增片段长度见表2所示。
[0010] 鉴定水稻抗稻瘟病基因 P i t a的特异性分子标记引物，包括：S F : GCAGGTTATAAGCTAGCTAT；SR：GCCAAATAGCCAATTCATA；RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT；RR： CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC 〇
[0011] 水稻抗稻瘟病基因 Pita特异性分子标记引物的应用，包括以下步骤：
[0012] 1)水稻DNA的提取
[0013] 2)合成表2所示的引物序列。
[0014] 3)PCR 扩增
[0015] PCR反应体系为20yL，含2.0yL 10XBuffer，1.0yL dNTPs(10mmol/L)，4条引物均 为0.2μΜ，0.2yL Taq酶(5U/yL)，2. OyL模板DNA，双蒸水补足余量;PCR反应程序:94 °C预变性 5min ;94°C变性lmin，62°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个循环;72°C延伸lOmin，扩增产物 在3 %琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
[0016] 4.结果判断
[0017] 4条引物SF、SR、RF与RR等量混合扩增，根据扩增条带类型判断基因型，含有抗病纯 合Pita等位基因类型水稻品种扩增出104bp和240bp条带，感病等位基因类型品种扩增条带 为179bp和240bp条带，杂合型品种的扩增条带为104bp、179bp和240bp条带。
[0018] 表1 Pita基因组编码区测序引物及相关参数
[0019]
[0020] 表2 Pita特异性分子标记引物序列及相关参数
[0021]
[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0023] 1.本申请在Pita基因组编码区设计了3对覆盖编码区的重叠引物S1、S2和S3(图 2A)，引物序列见表1，利用这3对引物测序以及序列比对在Pita内含子+2001bp处（图1，图 2A)鉴定到一个Pita基因特异性位点（该位点处Pita抗病等位基因序列为GCC，感病等位基 因序列为CTAT)，利用两对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP)方法开发出鉴定该目标位点的共显性标记，如图2B所示，在特异性位点的上游104bp、 下游179bp设计两条外引物RF和SR，以目标特异性位点的4个差异碱基作为引物3 '端分别设 计两条内引物SF和RR，将4条引物等量混合并利用待测品种基因组DNA进行PCR扩增，根据扩 增条带类型鉴定Pita基因型，抗病纯合Pita等位基因扩增出104bp和240bp条带，感病等位 基因类型扩增条带为179bp和240bp条带，杂合型的扩增条带为104bp、179bp和240bp条带。 由于该位点在编码区内部，因此与传统的利用连锁标记鉴定的方法相比结果更加精确。 [0024] 2.与传统的利用单个碱基的差异即SNP位点与PCR-CTPP方法设计的引物相比，我 们开发的标记在两条内引物的3'有4个碱基的差异，而传统方法只有1个碱基差异，因此这 套标记特异性更强，更容易区分两种不同的基因型，不会出现传统方法中利用SNP位点设计 的引物中由于非特异性结合产生的假阳性和弱阳性条带，因此该方法更稳定、结果更准确。 [0025] 3.与传统的利用大田诱发或温室接种鉴定稻瘟病抗性等位基因不同，本发明利用 基因编码区的特异性序列，通过设计引物开发出仅利用PCR电泳技术即可鉴定亲本及F2子 代Pita基因型的共显性分子标记。
[0026] 4.在利用Pi ta基因对水稻稻瘟病抗性改良时，利用本发明的方法可准确实现子代 基因型检测，筛选携带目的基因的个体连续回交后自交纯合从而完成品种改良；因此，该方 法具有简单、准确、成本低并可以在水稻生长早期进行非破坏性检测等一系列优点，适于在 育种中对Pita基因型的大量筛选以及对于水稻种质资源中Pita等位基因型鉴定。
【附图说明】
[0027]图1利用已知的包含抗病与感病Pita等位基因的水稻品种对Pita基因组编码区序 列扩增、比对图示。
[0028] 其中9311和日本晴为已知的含有感病Pita等位基因的水稻品种，IRBLta-CPl、 11^1^&-(^2、11^1^3-1(1小-128-1为已知的含有抗病？^3等位基因的水稻品种。（11^1^&-CPl、IRBLta-CT2、IRBLta-Kl、F-128-l均为国际水稻研究所构建的稻瘟病单基因系）
[0029] 图2 Pita基因组编码区结构示意图及利用Pita基因组特异性序列对水稻Pita抗、 感基因型扩增示意图。
[0030] 图3为利用本发明开发的Pita分子标记引物检测具有不同等位基因亲本的电泳 图。
[0031] M:DL500DNA marker;如图所示，泳道1-17对应水稻品种依次分别为：霸王鞭1、白 壳花螺、洞庭晚籼、南雄早油、旱麻稻、细白粘、中农4号、红谷、三颗寸、三镑七十箩、齐头白 谷、紫米、鸡血糯、泽谷、麻谷糯、马尾粘、寸谷糯;基因型的R与S分别表示对应水稻品种包含 抗病等位基因或者感病等位基因，其中泳道4、13、14对应水稻品种含有抗病Pita等位基因， 其余均含感病Pita等位基因。
[0032]图4为利用本发明开发的Pita分子标记引物检测目标位点分离的F2群体电泳图。 [0033] M:DL500DNA marker;泳道1、2为目标位点分别为含有Pita抗病等位基因的亲本 IRBL ta-CPl与含有Pita感病等位基因的亲本Nipponbare，泳道3-24为利用两亲本构建的 随机选取的部分F2单株，各材料所属基因型标注于对应泳道下方，S代表感病等位基因类 型，R代表抗病等位基因类型，Η代表杂合类型。
【具体实施方式】
[0034]本实施例中未特别说明的实验方法即为分子生物学常规方法。本申请所用Taq酶 及dNTP产自上海博彩生物科技有限公司，其余均为常规生化试剂。
[0035] 实施例1:
[0036] -种鉴定水稻抗稻瘟病基因 Pita的特异性分子标记引物，包括：SF: GCAGGTTATAAGCTAGCTAT;SR:GCCAAATAGCCAATTCATA;RF:CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT和RR: CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC 〇 [0037] 实施例2:
[0038]水稻抗稻瘟病基因 Pita特异性分子标记引物的应用：
[0039] 1)生物材料
[0040] 从143份水稻微核心种质材料中随机选取了 17份材料，对应图3泳道1-17依次分别 为:霸王鞭1、白壳花螺、洞庭晚籼、南雄早油、旱麻稻、细白粘、中农4号、红谷、三颗寸、三镑 七十箩、齐头白谷、紫米、鸡血糯、泽谷、麻谷糯、马尾粘、寸谷糯。（17份水稻品种信息见文 献：Zhang，Η·，Zhang，D·，Wang，Μ·，Sun，J·，A core col lection and mini core collection of Oryza sativa L.in China,Theor Appl Genet.,2011,vol.122,no.1, pp.49-61.)
[00411 2)水稻DNA提取及引物合成
[0042] CTAB方法提取上述材料的DNA，合成表2所示的引物序列，具体为：
[0043] SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT
[0044] SR：GCCAAATAGCCAATTCATA
[0045] RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT
[0046] RR：CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC〇
[0047] 3)PCR
[0048] PCR反应体系为20yL，含2.0yL 10XBuffer，1.0yL dNTPs(10mmol/L)，4条引物均 为0.2μΜ，0.2yL Taq酶(5U/yL)，2. OyL模板DNA，双蒸水补足余量;PCR反应程序:94 °C预变性 5min ;94°C变性lmin，62°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个循环;72°C延伸10min，扩增产物 在3 %琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
[0049] 4)结果分析
[0050]如图3结果表明，所有水稻品种都扩增出一条240bp的共有条带，其中泳道4、13、14 对应水稻品种扩增出104bp的抗病Pita等位基因特异性条带，其余泳道对应品种扩增出 179bp的含感病Pita等位基因特异性条带;为了验证我们的结论，我们将这17个品种目标编 码区均进行了测序比对，结果表明，分子标记检测结果与测序结果一致。通过温室稻瘟病单 孢接种鉴定，我们也验证了泳道4、13、14对应水稻品种含有抗病Pita等位基因，其余均为感 病Pita等位基因。
[0051]本发明提供的引物，可用于有效的对抗稻瘟病基因 Pita进行基因型选择，既可以 用于水稻资源的筛选鉴定。
[0052] 实施例3:
[0053] 水稻抗稻瘟病基因 Pita特异性分子标记引物的应用，包括以下步骤：
[0054]本实施例是对水稻抗稻瘟病基因 Pita F2群体的单基因分离的检测 [0055] 1)生物材料
[0056] 如图4所示，泳道1、2为目标位点分别为含有纯合Pita抗病等位基因的亲本 IRBLta-CPl与含有纯合Pita感病等位基因的亲本Nipponbare，泳道3-24为利用两亲本构建 的随机选取的部分F2单株，各材料所属基因型标注于对应泳道下方，S代表感病等位基因类 型，R代表抗病等位基因类型，Η代表杂合类型。
[0057] 3)PCR
[0058] PCR体系同实施例2。
[0059] 1)结果分析
[0060] 利用亲本IRBLta-CPl (Pita抗病等位基因）与Nipponbare(Pita感病等位基因）杂 交构建了F2群体，并对96个单株的基因型进行了检测，结果表明，3种不同基因型的分离比 为24SS:52H:20RR，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比（x 2 = l〈x2Q.Q5 = 5.99)，因 此该标记为共显性标记，可以将两种不同的纯合子以及杂合子区分开，检测位点同时表现 为单基因分离(见图4)。
[0061]本发明提供的引物，可用于有效的对抗稻瘟病基因 Pita进行基因型选择，既可以 用于水稻资源的筛选鉴定，又可以用于水稻抗稻瘟病基因 Pita的分子育种。
【主权项】
1. 水稻抗稻瘟病基因 Pi ?α基因型鉴定的特异性分子标记引物，包括：SF : GCAGGTTATAAGCTAGCTAT;SR:GCCAAATAGCCAATTCATA;RF:CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT和RR: CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC 〇2. 权利要求1所述的分子标记引物在水稻抗稻瘟病分子育种中的应用。3. 权利要求1所述的分子标记引物在对水稻资源的Pi M基因型鉴定或筛选中的应用。4. 根据权利要求2或3所述的应用，其应用过程包括PCR反应： PCR反应体系为20yL，含2.0yL 10XBuffer，1.0yL 10 mmol/L 的dNTPs，4条引物均为 0.2_，0.2仙5U/UL的Taq酶，2.0仙模板0嫩，双蒸水补足余量； PCR反应程序：94°C预变性5min;94°C变性lmin，62°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个 循环;72°C延伸lOmin，扩增产物在3%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
【文档编号】C12Q1/68GK105907884SQ201610517576
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】蔡海亚, 徐得泽, 游艾青, 周雷, 焦春海
【申请人】湖北省农业科学院粮食作物研究所