一种鉴定食品中拟枝孢镰刀菌的检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于鉴定食品中的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒，其包括特异性引物组、Bst DNA聚合酶、反应缓冲液和核酸染料。本发明还提供了一种鉴定食品中拟枝孢镰刀菌的LAMP检测方法。使用本发明的试剂盒或检测方法具有高特异性、耗时短、灵敏度高、鉴定简便等优点，值得推广和使用。
【专利说明】
一种鉴定食品中拟枝孢镰刀菌的检测试剂盒及检测方法
[00011 本发明是申请号为201610265458.9、申请日为2016年4月26日、发明名称为"一种 鉴定食品中拟枝孢镰刀菌的检测试剂盒及检测方法"的专利的分案申请。
技术领域
[0002]本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种用于鉴定食品中的拟枝 孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0003] 拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)属于枝孢组镰刀菌，菌丝生长迅速， 气生菌丝旺盛，菌落呈放射状，白色至粉红色，菌落背面酒红色至红褐色。气生菌丝上产生 有复杂分枝的分生孢子梗，其中大型分生抱子呈镰刀形或纺锤型，通常为3-5个分隔，略弯 曲，寄主有黄瓜、玉米、棉花、番痴、辣椒等。
[0004] 拟枝孢镰刀菌能够产生对人、畜威胁很大的镰刀菌毒素，包括T-2毒素，后者是单 端孢霉烯族化合物中的A族，是该类化合物中毒性最强、污染水平较高的毒素之一，可以抑 制DNA、RNA及蛋白质合成，诱导细胞凋亡，引起白细胞缺乏等。人类误食了大量污染该类毒 素的谷物或蔬菜后，除表现呕吐、腹痛、腹泻等急性症状外，可有白细胞缺乏、坏死性咽峡 炎、骨髓发育不良、食管和胃严重坏死等，病死率高(死亡率高达50%_60%)。二战期间前西 伯利亚阿穆尔地区数千人因进食了被镰刀菌污染的越冬小麦而发生食物中毒。蒋兆光等曾 报道过因食用感染拟枝孢镰刀菌的饲料玉米而导致黄牛中毒的案例。因此，出于食品安全 的考虑，有必要开发出检测食品中是否存在拟枝孢镰刀菌的方法或试剂盒。
[0005] 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA, LAMP)是日本学者Notomi于2000年建立的一种新型的核酸扩增技术。该技术针对靶基因6个 区域设计4条引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增 靶基因，产物是两端带有茎环结构的哑铃状DNA分子。与实验室常规检测的PCR方法相比， LAMP技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势，在食品、动植物检验检疫中被广泛应 用于各种病原检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于鉴定食品中的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒 及检测方法。
[0007] 为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种用于鉴定食品中的拟枝 孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒，其包括特异性引物组、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染 料，其中所述特异性引物组的核苷酸序列如下所示：
[0008] 外引物F3:CCACATCTTCGGGTCTGTTG(SEQ ID N0:1)
[0009] 外引物B3:CCTTGGTGCCAACTTCCATT(SEQ ID N0:2)
[0010] 内引物FIP:TGGGAAACGGGCATTTGCTTG-CAGTGCCAAGTCAGCTCAT(SEQ ID NO:3)
[0011]内引物BIP:ACCATATTCGAAAGCGGACGCG-GCAGTCTGGGTAACGACAG(SEQ ID N0:4)。
[0012] 优选地，所述反应缓冲液由2mM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和 6mM Mg2+组成。
[0013] 优选地，所述核酸染料为1000XSYBR Green I。
[0014] 优选地，本发明的试剂盒进一步包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照，所述 DNA提取试剂例如CTAB抽提缓冲液。
[0015] 在另一个方面中，本发明提供了特异性引物组在制备用于鉴定食品中的拟枝孢镰 刀菌LAMP试剂盒中的应用。所述特异性引物组如序列SEQ ID NOs: 1-4所示。
[0016] 在又一个方面中，本发明还提供一种鉴定食品中的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测方 法，其中使用本发明的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒，所述方法包括以下步骤：
[0017] (1)向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA;
[0018] (2)在PCR管中制备25μ1反应体系，其包括0·2μL?〇1/μ1的外引物F3 1μ1、0·2μL?〇1/μ 1的外引物Β3 1μ1、1·2μL?〇1/μ1的内引物FIP 1μ1、1·2μL?〇1/μ1的内引物ΒΙΡ ΙμL、反应缓冲 液2.5μ1、8υ/μ1的Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水补充至25μ1，并以拟枝孢镰刀菌基 因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
[0019] ⑶将步骤⑵中的PCR管于63°C恒温反应60min;
[0020] (4)分析判断反应产物结果：在（3)中所得反应产物中加入ΙμL核酸染料SYBR Green I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，食品中不含拟枝孢镰刀菌，如反应液颜色 为绿色，表示结果为阳性。
[0021] 本发明的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒及其检测方法能够将拟枝孢镰刀菌与 其他镰刀菌菌种区分开来，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结 果，无需电泳和紫外观察等步骤，无需使用热循环仪等仪器，成本低、操作简单、鉴定简便， 适于对食品中或田间的拟枝孢镰刀菌进行基础实验室和现场检测，值得推广应用。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本领域技术人员应当 领会的是，可以在不偏离本发明精神的情况下进行多种修改，这些修改将包含在本发明的 范围内。
[0023]实施例1本发明的试剂盒的制备
[0024] 1.1试剂
[0025]引物由天根生化科技(北京)有限公司合成;Bst DNA聚合酶和lOXThermoPol反应 缓冲液购自NEB;SYBR Green I购自Invitrogen;其余PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所需 的试剂购自Sigma。
[0026] 1.2试剂盒的制备：
[0027] 获得以下试剂，以制备本发明的试剂盒：
[0028] CTAB抽提缓冲液：按照以下配方配制：100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1M NaCl、1 % (v/v) β-巯基乙醇、2 % CTAB，调整pH值至7 · 0-7 · 5;
[0029] 反应缓冲液:按照以下配方配制：2mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜 菜喊、6mM MgSCU;
[0030]引物：外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；外引物B3,其核苷酸序列如 SEQIDN0:2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示，内引物BIP，其核苷酸序 列如SEQ ID如:4所示。其中外引物?3和外引物83的浓度为0.2以111〇1/^1，内引物？1?和内引 物BIP的浓度为1.2μηιο1/μ1。
[0031] 浓度为8UAU的Bst DNA聚合酶；
[0032] 核酸染料：1000 XSYBR Green I;
[0033] 阳性对照:拟枝孢镰刀菌基因组DNA;
[0034] 阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
[0035] 实施例2拟枝孢镰刀菌特异性检测
[0036] 2.1 LAMP特异性检测
[0037] 待测植株包括从河北省廊坊市田间采集的镰刀菌病害植株共12株。其中包括经指 示生物法和菌丝体传统形态学鉴定确认感染拟枝孢镰刀菌的黄瓜4株、苜蓿2株以及感染腐 皮镰刀菌的黄瓜2株、感染禾谷镰刀菌的玉米2株和感染水生镰刀菌的番茄2株。上述病害植 株的病变部位均可见霉层或菌丝。
[0038] 使用实施例1制备的试剂盒按照以下步骤进行检测：
[0039] (1)挑取病害植株病变部位的霉层或菌丝，接种于TOA平板上，划线培养后，收集并 离心，加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA;
[0040] (2)在PCR管中制备25μ1反应体系，其中四种引物各ΙμL、反应缓冲液2.5μ1、8υ/μ1 的Bst DNA聚合酶ΙμL、步骤（1)所得模板DNA 2μ1，加水补充至25μ1，并以拟枝孢镰刀菌基因 组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
[0041 ] (3)将步骤(2)中PCR管于63°C恒温反应60min;
[0042] (4)分析判断反应产物结果:在(3)中所得反应产物中加入ΙμL 1000 XSYBR Green I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
[0043] 2.2检测结果
[0044]确认感染拟枝孢镰刀菌的6株病害植株的PCR管中均呈现绿色，而其余菌株的PCR 管显色结果均为橙色，表明引物具有很强的特异性，能够将拟枝孢镰刀菌与其余类型的镰 刀菌区分开来。
[0045]实施例3拟枝孢镰刀菌灵敏度检测
[0046] 3.1 LAMP灵敏度检测
[0047] 按照实施例2的步骤（1)提取拟枝孢镰刀菌DNA，并以10倍浓度系列稀释法稀释成 100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg共 7 个梯度。
[0048] LAMP反应体系和反应条件以及结果分析同实施例2的步骤(2)-(4)。
[0049] 3.2检测结果
[0050] 除了 DNA浓度为100fg的PCR管显示橙色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表 明本发明的检测方法的最低检测极限达到lpg DNA，灵敏度很高。
【主权项】
1. 一种用于鉴定食品中的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，可以包括特 异性引物组、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核苷酸序列如下所 示： 外引物F3:CCACATCTTCGGGTCTGTTG(SEQIDN0:1) 外引物B3:CCTTGGTGCCAACTTCCATT(SEQ ID NO:2) 内引物FIP: TGGGAAACGGGCAITTGCTTG-CAGTGCCAAGTCAGCTCAT(SEQ ID NO: 3) 内引物BIP:ACCATATTCGAAAGCGGACGCG-GCAGTCTGGGTAACGACAG(SEQ ID N0:4)。2. 根据权利要求1所述的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒，其中所述反应缓冲液由2mM dNTP、10 X ThermoPo 1反应缓冲液、0 · 6mM甜菜碱和6mM Mg2+组成。3. 根据权利要求1或2所述的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒，其中所述核酸染料为 1000XSYBR Green 1〇4. 根据权利要求1-3任一项所述的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒，其进一步包括DNA 提取试剂以及阳性对照和阴性对照。5. 根据权利要求4所述的拟枝孢镰刀菌的LAMP检测试剂盒，其中所述DNA提取试剂是 CTAB抽提缓冲液。
【文档编号】C12Q1/04GK105907885SQ201610527870
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】张梅
【申请人】张梅