针对淀粉样蛋白β的骆驼科单结构域抗体以及生产其缀合物的方法
【专利摘要】本发明涉及针对淀粉样蛋白β的骆驼科重链抗体的可变结构域及其缀合物。本发明还涉及这些抗体缀合物用于治疗或诊断由淀粉样蛋白β沉积所介导的疾病的用途。CNCM I-481820131112CNCM I-481920131112
【专利说明】
针对淀粉样蛋白β的骆驼科单结构域抗体以及生产其缀合物 的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及针对淀粉样蛋白β的抗体及其缀合物。本发明还涉及这些抗体缀合物 治疗或者诊断由淀粉样蛋白β沉积所介导的疾病的用途。最后，本发明还涉及获得偶联有感 兴趣的物质的VHH(功能缀合物)的偶联方法，以及更通常地，涉及偶联有感兴趣的物质的寡 肽。
[0002] 所有痴呆症病例的约70%是由于阿尔茨海默氏病(AD)，它与对认知重要的脑区和 神经回路的选择性损伤相关。阿尔茨海默氏病的特征是神经纤维缠结，尤其是在海马的锥 体神经元中，以及大量的主要含有淀粉样蛋白沉积的致密核心和漫射晕的淀粉样蛋白斑 块。
[0003] 细胞外神经炎性斑块含有大量占主要地位的纤维状肽称为"淀粉样蛋白β"、"Α-β"、"淀粉样蛋白 Ρ"、"ΑΡ4"、"Αβ"、"M4"、"Ρ-Α4" 或者 "ΑΡ" ；参见 Selk〇e( 1994)， Ann.Rev.Cell Bi〇1.10,373-403;K〇〇(1999)，PNAS 96卷，pp.9989-9990;US 4,666,829或 者Glenner(1984)，BBRC 12，1131。这种β淀粉样蛋白源自"阿尔茨海默前体蛋白/β-淀粉样 蛋白前体蛋白YAPPhAPP是完整的膜糖蛋白（参见Sisodia(1992)PNAS卷89，ρρ·6075)并且 通过质膜蛋白酶α分泌酶在Αβ序列内被内蛋白水解(endoproteolytically)切割。其它分泌 酶活性，特别是β分泌酶和γ分泌酶活性导致淀粉样蛋白β的胞外释放，其中包含不同大小 的蛋白，比如39个氨基酸(Αβ39)、40个氨基酸(ΑΜ0)、42个氨基酸(ΑΜ2)或43个氨基酸(Αβ 43);参见Sinha( 1999)，PNAS 96,11094-1053;Price( 1998)，Science 282,1078-1083;TO 00/72880或者Hardy(1997)，TINS 20，154。注意到Αβ具有若干天然存在的形式，由此人的形 式被称为上述的如39)04〇^041)042和邠43。形式如42具有氨基酸序列（从~端开始） ： DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID Ν0.12)。在Αβ41、Αβ40、Αβ39中， 分别缺失C端氨基酸Α、ΙΑ和VIA。在ΑΜ3的形成中，额外的苏氨酸残基被包含在上述序列的C 端(SEQ ID N0.12KAPP基因的突变可导致Αβ序列的修饰和聚集的Αβ积累增加。
[0004] 这些细胞外神经炎斑块的主要成分是水溶形式的Αβ40或者AM2。然而，最初的焦 点在于将水不溶的纤维状淀粉样蛋白作为AD病理学的中心结构，这在过去15年中得以发 展。这是由于几个突出的发现，比如，在人类大脑中发现寡聚Αβ的水溶性级分(Kuo Υ.Μ.等 人，1996,J Biol Chem，271,4077-81)。这些分离的可溶性寡聚物对培养的神经元是有毒 的。然后，确认了寡聚仙的存在和毒性，并提出了这些结构的名称ADDL(Ai3衍生的扩散配体） (Lambert M.P.等人，1998，Proc Natl Acad Sci U.S.A. ,95,6448-53)。根据条件，ADDL组 合物可以主要包含三聚体-六聚体，较大的结构高达24聚体。ADDL显示重要的区域选择性神 经毒性，幸免了小脑中的神经元，而选择性杀死海马CA1区和内嗅皮质的神经元（Klein W. L.等人，2001，Trends in Neurosciences，24，219-224)。此外，寡聚物能够在大鼠体内 (Walsh D.M.等人，2002，Nature,416,535-9)以及在海马切片中（Wang H.W.等人，2002， Brain Res.，924，133-40;Wang Q.等人，2004，J Neurosci. ,24,3370-8)抑制海马的长时程 增强(LTP)。已经表明，认知缺陷直接归因于少量可溶寡聚形式的淀粉样蛋白β;三聚体，以 及在更小的程度上，二聚体和四聚体尤其活跃(Cleary J.P.等人，2005，Nat Neurosc.，8， 79-84;Townsend Μ·等人，2006，J Physiol,572,477-92)。
[0005] 在阿尔茨海默氏病发作之前很长一段时间（最长30年)就已出现淀粉样蛋白斑块 (Sperling R.A.,2011,Alzheimer's and Dementia,7:280-92；Villemagne V.L.,2013, Lancet Neurol. ,12:357-67)并且根据淀粉样蛋白级联假说，淀粉样蛋白负责导致AD所有 损害的事件的级联(Hardy J.A.，1992,Science,256:184-5)。因而，淀粉样蛋白的早期检测 对于阿尔茨海默氏病的随访及其治疗是重要的。淀粉样蛋白斑块的成像对在动物模型中筛 选新药也是重要的。
[0006] 淀粉样蛋白沉积也和血管病变(淀粉样蛋白血管病)有关。在其它疾病例如唐氏综 合征的过程中，淀粉样蛋白以类似的形式积累。
[0007] 已开发几种方法用以检测淀粉样蛋白疾病的病变，特别是阿尔茨海默氏病。迄今 为止，在人体中，应用最广泛的方法是基于正电子发射断层扫描(PET)成像。例如，可以在患 者体内评价淀粉样蛋白的负荷，但在动物中使用PET放射性配体如 nC-PIB(Klunk W.E.， 2004，Ann Neurol·,55:306-19)或 18F-AV_45(Doraiswamy P.M.，2012，Neurology，79:1636-44)则更加困难。对化合物进行放射性标记的需要是基于PET的方法的主要缺点。在人类中， 这会导致暴露于电离辐射。在临床前研究中，因为只有有限数量的中心允许操纵放射性化 合物，PET检查不能用于新药大规模的评估和用于常规诊断。此外，同位素如 nC(20分钟）的 半衰期短，当使用基于nC的配体比如PIB时，需要在现场有一个回旋加速器。基于 18F的配体 具有更长的半衰期（110分钟），但这种半衰期仍然相对较短。这需要强大的有关放射性示踪 物的供应、处理和管理后勤，放射性示踪物的保质期有限，需要谨慎的部署。此外，PET成像 分辨率低，妨碍其在小的脑尺寸AD动物模型中用于常规临床前研究中的应用。综上所述，可 以说，应找到在患者和在疾病的动物模型中在体内AD和唐氏综合征脑部病变中没有延迟成 像的新替代物。
[0008] 除了 PET成像，核磁共振(匪R)成像或者磁共振成像(MRI)也可用于检测AD脑病变。 在过去十年中，已经做了很多努力来开发能够通过MRI进行斑块检测的新方法。无造影剂的 规程允许观察淀粉样蛋白斑块内由于循环铁自然发生的沉积而导致的一些Αβ沉积。然而， 在淀粉样蛋白沉积中的铁积累在人体中较低(Dhenain Μ. ,2002,匪R Biomed. ,15:197-203)，并且只发生在疾病晚期阶段或者小鼠局灶性脑区（Dhenain M.，2009，Neur〇bi〇l Aging 30:41-53)。有几个规程都是基于采用特定的造影剂。比如，一些小组开发了使用Αβ 衍生肽的造影剂，其磁性标记有IL(Gd)或单晶娃铁氧化物纳米颗粒(ΜΙ0Ν) (Wadghiri， Y.Z.,2003,Magn Reson Med.,50:293-302；Poduslo,J.F.,2002,Neurobiol Dis.,11:315-329)。用这些方法已经实现了离体和体内检测，但仍需要穿透血脑屏障(BBB)，不能以高效 且再现的形式进行，并且可能是有害的（例如，使用甘露醇瞬时打开血脑屏障）。因此，这些 方法受到必须打开血脑屏障的困扰，因此未在非实验的情况下使用过。借助靶向淀粉样蛋 白斑块的抗体，其它小组开发的方法革巴向淀粉样蛋白（Ramakrishnan，M.，2008，Pharm Res. ,25:1861-1872)。最近通过MRI检测淀粉样蛋白斑块的方法基于使用小抗体片段，其中 的小抗体片段展示出增加的穿过BBB的潜能（多胺修饰的Fab片段)并且靶向淀粉样蛋白斑 块。这些抗体连接至造影团（contrastophore)，从而允许通过MRI对其检测(Ramakrishnan， Μ.，2008，Pharm Res .，25:1861-1872)。然而，抗体像其它大的血浆蛋白一样，如白蛋白，不 容易穿过BBB，其通常保持只局限于循环的血浆部分中。增强抗体分子穿过BBB的递送的一 个潜在机制是阳离子化，其中表面的羧基缀合有伯氨基，而抗体的等电点（pi)被提高 (Bickel U等人，2001，Adv Drug Deliv Rev. ,46:247-279)。阳离子化的蛋白的正电荷结合 细胞表面上的负电荷，并且这种相互作用触发阳离子化的蛋白通过吸收介导的内吞作用进 入细胞。相对于免疫球蛋白的阳离子化，最近的研究已经表明，在体外通过分离的脑毛细血 管，这种过程导致增强的吸收介导的内吞作用，以及在体内，这种内吞作用过程导致阳离子 化IgG进入脑的净转胞吞作用。阳离子化抗体应用的主要限制是其抗原结合性能的下降。实 际上，阳离子化的单克隆抗体的亲和性受到影响，因为通常参与抗原结合的精氨酸和赖氨 酸由阳离子化处理而被修饰（Triguero D.等人，1991，J Pharmacol Exp Ther.258:186_ 192)〇
[0009] 常规的免疫球蛋白是异四聚体，由两条重链和两条轻链组成，组合分子量约 150kDa。在胳胳盤科(Came 1 idae)成员中，相当比例的血清抗体是同源二聚体IgG，分子量约 80kD(Hamers_Casterman C.等人，1993，Nature，363:446-448)。这些重链免疫球蛋白（Ig) 包含三个结构域，其可变区被称为VHH。重组VHH(约12至14kD的尺寸）构成完整的抗原结合 结构域并显示出广阔的抗原结合谱。扩大它们的高变区，并表现出独特的特性，如三至四个 (与常规抗体I相互作用的)疏水框架残基被更多亲水性氨基酸取代。为了稳定扩大的CDR， 除了常规的二硫键以外，在单峰骆驼⑶R1和⑶R3之间，在美洲驼的⑶R2和⑶R3之间，VHH可 具有额外的二硫键（（Harmsen，M.M和De Haard H.J.，2007，Appl Microbiol Biotechnol·， 77:13-22;Muyldermans S.，2001，J Biotechnol. ,74:277-302)。扩展的CDR3环可以采取凸 面构象，而常规的互补位被限制在凹的或者平面结构（Muyldermans S. ,2001，J Biotechnol.，74: 277-302)。这些特征允许VHH识别对于常规抗体而言免疫原性较差的独特 表位（Lafaye P.等人，2009，Mol Immuno. ,46 :695-704 ;Wernery U·，2001，J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. ,48:561-568)。尽管VHH被定义为单价抗体，默认排除任 何亲合力效果，然而测量的其体外生物活性如IC5Q，可类似于常规的二价抗体分子(Thys B. 等人，2010，Anti viral Research. ,87:257-264) 〇
[0010] 有人提议，同源二聚体VHH提供了体内免疫诊断的新前景。已经描述了如噬菌体展 示的方法从免疫的骆驼或者美洲驼的VHH库中选择抗原特异性VffiLVHH基因克隆至噬菌体 展示载体中，通过筛选获得抗原结合物，选择的VHH在细菌中表达。与常规抗体片段(Fab或 者scFv)相比，重组VHH具有许多优点，因为只克隆了一个结构域，且因为这些VHH表达良好， 高度溶于水性环境并且在高温下是稳定的。由于VHH的尺寸小，约12-14kDa，它们迅速通过 肾脏过滤，肾脏过滤的截断值约60kDa，导致在血液中快速清除。此外，小尺寸导致快速的组 织穿透。VHH血清半衰期短，约2小时，相较于scFv的4h和IgG的50h而言，这对于使用成像的 体内诊断而言是有利的，并且有利于偶联至感兴趣物质的VHH进行靶向从而用于治疗疾病， 因为人们可以预期非特异结合的VHH将从组织中迅速消除。
[0011] Li T.等人（2012，Faseb J. ,26:3969-3979)获得针对GFAP(-种特异于星形细胞 的中间丝蛋白）的VHH。在活的小鼠中采用颈动脉内注射，作者证实这些天然VHH发挥"转换 体(transbody)"的作用，因为它们天然地能够穿过BBB而在脑组织中的扩散，渗透到星形细 胞中，并特异性结合GFAP表位(又参见国际申请W0 2010/004432)。
[00?2] 更一般地，具有至少8.5等电点的VHH能够通过微胞饮作用(micropinocytosis)和 吸收介导的内吞作用而迀移穿过BBB。这样的VHH可用于肽载体的制备将感兴趣的物质递送 穿过哺乳动物血脑屏障（国际申请W0 2009/004495和W0 2010/004432)。
[0013]国际申请W0 2004/044204公开了能够在体外特异性结合淀粉样蛋白β肽42(AM2) 的骆骆驼科单链抗体(VHH)可变片段的文库制备。已经通过用AM2免疫羊驼Lama pacos而 获得这些VHH。这些VHH当中，已经描述了一个特定的VHH，称为VHH V31-1，通过ELI SA特异性 识别纤维状形式的AM2肽(AM2)的羧基端，以及通过免疫组织化学识别神经元内AM2沉 积。然而，在国际申请W0 2009/004494中，W0 2004/044204的发明人已清楚地通过免疫组织 化学显示，不同于W0 2004/044204中描述的，VHH V31-1不识别水溶纤维状形式的AM2,但 特异性识别AM2的水溶性低分子量寡聚物（即，单_、二_、四-和十二聚体）（还参见Lafaye Ρ·等人，2009，M〇1 Immunol. ,46:695-704)。在国际申请 W0 2009/004494 中，W0 2004/ 044204的发明人进一步研究WO 2004/044204中公开的两种VHH，即VHH 61-3和VHH L1-3。他 们通过免疫组织化学显示，染色的AD脑组织切片显示非常微弱的神经元内对VHH 61-3的免 疫反应，对VHH L1-3无法检测到神经元内的免疫反应。
[0014] Rutgers K.S.等人（2011，Neurobio 1 .Aging，32:1774-83)报道，通过菌体展不 从未免疫的和免疫的库中筛选特异于淀粉样蛋白β的8个美洲驼来源的重链抗体片段 (VHH)，通过噬菌体ELISA、免疫组织化学和表面等离子体共振确定其对淀粉样蛋白β的亲和 性和特异性。作者表明在体外8个VHH识别不同的淀粉样蛋白β表位，这与不同的免疫原相一 致。作者还表明，这些VHH中的三个识别血管的和实质的（parenchymal)淀粉样蛋白β沉积， 而剩下的5个VHH特异性识别血管的淀粉样蛋白β(未结合到实质的淀粉样蛋白β)。作者认 为，血管的和实质的淀粉样蛋白β沉积在表位的存在/可用性方面是异质的 (heterogeneous)，并且特异于淀粉样蛋白β的VHH可以用作体内成像的试剂来区分血管的 及实质的淀粉样蛋白β沉积。
[0015] Nabuurs R.J.A.等人（2012年，PLoS 0ne，7:e38284)进一步在体内表征了Rutgers 等人公开的两种VHH，即VHH ni3A和pa2H。作者发现，和Rutgers等人报道相反的是两种VHH 对实质的和血管淀粉样蛋白β沉积均显示亲和性。事实上，Rutgers K.S等人报道在人体组 织上进行的免疫组织化学中ni3A特异性地仅仅靶向血管淀粉样蛋白^Nabuurs R.J.A.等 人进一步报道，对于用于体内成像而言，VHH ni 3A和pa2H的脑摄取太低。
[0016] 因此，需要提供通过体内神经成像来诊断淀粉样蛋白β沉积介导的疾病特别是阿 尔茨海默氏病和唐氏综合征、以及监测这类疾病的疾病进展的手段和方法。也有必要提供 用于治疗这些疾病的手段和方法。
[0017] 在产生本发明的研究框架内，本发明人用AM2免疫羊驼。他们已获得称为R3VQ和 R3VE的两种VHH。R3VQ和R3VE分别具有氨基酸序列SEQIDN0.4和SEQIDN0.5，两种均包含 氨基酸序列SEQ ID Ν0.1所示的CDR1 (互补决定区1)、氨基酸序列SEQ ID勵.2所示的0?2 和氨基酸序列SEQ ID N0.3所示的CDR3。R3VQ和R3VE相差仅一个第7位的氨基酸序列:R3VQ 和R3VE的残基7分别是谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(EhVHH R3VQ和R3VE氨基酸序列的前三个氨 基酸残基(M-A-E)和最后两个氨基酸残基(S-S)可以被删除，而不改变这些VHH的性质。缺乏 这些氨基酸残基的VHH R3VQ和R3VE被无差别分别称为R3VQ和R3VEA3VQ和R3VE具有类似的 性质。
[0018] 当体外通过ELISA和免疫组织化学评估时，R3VQ和R3VE对Αβ有相似的结合特性。 VHH R3VQ能够特异性识别淀粉样蛋白邱勺纤维状形式，但不识别寡聚（即，非-纤维)形式。采 用免疫组织化学技术，发明人已发现这种VHH(以及VHH R3VE)特异性地标记存在于人AD脑 组织样本以及来自携带淀粉样蛋白沉积的专用小鼠模型的脑切片中的淀粉样蛋白斑块。 [0019] VHH R3VQ也能在体内穿过哺乳动物未被破坏(non-compromised)的血脑屏障。 [0020] 此外，按照以下两种策略，将VHH R3VQ缀合至感兴趣的物质，如MRI造影剂和螯合 剂：
[0021] -第一个策略是利用非位点特异性的方法，并且包括螯合剂和根据本发明的VHH或 者VHH衍生物的赖氨酸残基的缀合步骤，其中螯合剂如1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7， 10-四乙酸(D0TA)，随后是将获得的配体和感兴趣的物质进行螯合的步骤，其中感兴趣的物 质如MRI造影剂、如顺磁剂钆(Gd)。当通过IHC和MRI体内评估时，R3VQ-N-(DOTA/Gd)η '缀合 物(图9，化合物2)能够识别脑室内注射后小鼠中的淀粉样蛋白斑块。
[0022] -第二个策略是使用位点特异性的方法，其涉及通过硫代加成，用携带感兴趣的物 质的巯基反应性化合物对VHH R3VQ进行缀合(缀合步骤），更一般地是对在C-或Ν端包含半 胱氨酸残基的任何VHH进行标记，其中携带感兴趣的物质的巯基反应性化合物优选为携带 感兴趣的物质的马来酰亚胺化合物。
[0023]-非位点特异性缀合需要初始缓冲液的交换，而R3VQ-SH 3与马来酰亚氨基(D0TA/ Gd)3 4之间的位点特异性缀合可以直接在PBS/氯化钠/咪唑缓冲中实施。在温和的条件可 以有效控制半胱氨酸上的特异性硫代加成，所述策略允许减少反应的步骤数并改进工艺的 总产率，而没有A.Papini等人Int.J.Pept.Protein Res. ,1992,39,348-355;B.Rudolf等 人，J.Organomet · Chem，1996，522,313-315 ;J.Paulech 等人，Biochim.Biophys .Acta, 2013， 1834,372-379中先前提到的任何潜在副反应。因而，令人惊讶地，以如此显著的方式改善了 总产率，而在VHH赖氨酸或组氨酸上没有任何副反应，并且整体保持了 VHH的功能和三维结 构。
[0024]-重组蛋白经常和His-标签一起表达，His-标签允许通过固定化金属亲和性色谱 (IMAC)将其纯化。当使用Ni2+次氮基三乙酸树脂时，它们通常在含有500mM咪唑的PBS缓冲液 中被洗脱。在非位点特异性的方法中（图9A)，咪唑的氮可以促进NHS酯的水解（即降解反应 物），并由此干扰缀合（G.T.Hermanson, Biocon jugate Techniques，Academic Press ,2013; P.Cuatrecasas等人，Biochemistry，1972，11,2291-2299)。因此，缓冲液交换步骤必须包括 在上游亲和性纯化和缀合之间的过程中从而除去咪唑。总产率范围从60至67 %。还在缓冲 液交换（图9B，方法1)之后进行第一位点特异性实验（图9B)，以70%的产率产生缀合物 R3VQ-S-(D0TA/Gd)3 5。如以前几个小组所报道的，其中显示了组氨酸侧链烷基化，预期咪 P坐和马来酰亚胺基团之间副反应(A.Papini等人;B.Rudolf等人;J.Paulech等人）。尽管如 此，在亲和柱洗脱缓冲液中马来酰亚胺(D0TA/Gd) 3 4可直接缀合至R3VQ-SH VHH 3(图9B， 方法2)，马来酰亚胺试剂的过量有限，尽管咪唑过量很多摩尔。这第二个策略给出83%的总 产率。
【发明内容】
[0025]因此，本发明提供一种针对淀粉样蛋白辟千维状形式的分离的骆骆驼科重链抗体 的可变结构域(称为VHH)，特征在于其氨基酸序列从N端到C端包含氨基酸序列SEQ ID NO. 1 (对应着CDR1)、氨基酸序列SEQIDN0.2(对应着CDR2)以及氨基酸序列SEQIDN0.3(对应 着CDR3)〇
[0026] 在一个优选的实施方式中，所述VHH包含选自以下的氨基酸序列或者由选自以下 的氨基酸序列组成：
[0027] -SEQ ID从).4，对应1?3￥〇的全长形式，
[0028] -SEQ ID N0·5，对应R3VE的全长形式，
[0029] -SEQ ID从).6，对应1?3￥〇的短形式，以及
[0030] -SEQ ID N0·7，对应R3VE的短形式，
[0031] 优选地，选自SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6。
[0032] 如此处所用，术语"分离的"涉及VHH，其已经从它的天然环境中分离出来。在一些 实施方式中，例如通过电泳(如，SDS-PAGE、等电聚焦（IEF)、毛细管电泳)或色谱(如，凝胶过 滤、离子交换或者反相HPLC)所确定的，VHH被纯化至高于95%或者99%的纯度。针对综述抗 体纯度评价的方法，参见例如Flatman等人，2007，J · Chromatogr · B 848:79-87。
[0033] 如此处所用，术语"VHH"涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗 体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19,921-930; ]\11171(161'1]1&118 3.，2001，了13;[(^6(3111101.，74,277-302以及综述￥&111&11(18(3110(^?.等人， 2011，Antiviral Research 92，389-407) dVHH也可称为纳米抗体(Nanobody) (Nb) 0
[0034] 有利的是，根据本发明的VHH具有碱性的等电点，优选8.5至9.5。
[0035] 本发明包括如上述所限定的天然、重组或合成的VHH。
[0036] 如此处所用，术语"重组"涉及采用遗传工程的方法(克隆、扩增)来生产所述VHH。
[0037] 如此处所用，术语"合成"涉及通过体外化学的或者酶促的合成来生产所述VHH。 [0038]根据本发明的VHH能够是单体的形式或者同源多聚体的形式，如同源二聚体或同 源三聚体。
[0039] 本发明还提供一种分离的骆骆驼科血清，优选羊驼血清，其包含根据本发明的 VHH〇
[0040] 本发明还提供式P-C-Z或者Z-C-P所示的寡肽，优选P-C-Z，其中：
[0041 ] -P是8至800个氨基酸的肽，所述P不含有还原的半胱氨酸残基，
[0042] -C是半胱氨酸残基，
[0043] -Z代表1至10个氨基酸的间隔序列，优选1至10个中性的或带负电的氨基酸的间隔 序列，其中Z的氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中Z不含半胱氨酸残基。
[0044] 有利的是，氨基酸间隔序列Z的氨基酸残基选自：丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，优选地丙氨 酸、缬氨酸和丝氨酸。
[0045]在一个优选的实施方式中，寡肽具有式P-C-Z或者Z-C-P，优选地P-C-Z，其中：
[0046] -P是8至800个氨基酸的肽，所述P不含有还原的半胱氨酸残基，
[0047] -C是半胱氨酸残基，
[0048] -Z 代表
[0049] a)2至10个氨基酸的间隔序列，优选2个氨基酸的间隔序列，其中Z的氨基酸残基选 自：丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)和甘氨酸(G)，更优选丝氨酸(S)、丙氨酸(A)和缬氨酸 (V)，其中Z的至少两个氨基酸残基是不同的，或
[0050] b) 2至10个氨基酸的间隔序列，优选2至10个中性的或带负电的氨基酸的间隔序 列，其中Z包括二肽丝氨酸-丙氨酸(S-A)或丝氨酸-缬氨酸(S-V)，并且其中Z不包含半胱氨 酸残基。
[0051 ]有利的是，半胱氨酸残基C是立体上可接触的。
[0052]有利的是，当Z如a)中所限定的，则氨基酸间隔序列Z包含1个或者至少1个丝氨酸。 [0053]有利的是，当Z如a)中所限定的，则氨基酸间隔序列Z仅由丝氨酸和丙氨酸残基组 成，或者仅由丝氨酸和缬氨酸残基组成。
[0054]在这种寡肽的一个优选实施方式中，氨基酸间隔序列Z由2个氨基酸的序列组成， 如氨基酸序列S-A或者S-V。
[0055] 按照递增的优选顺序，氨基酸肽P还可以是50至800、100至800、100至700、100至 500、100至400、100至300、或100至250个氨基酸的肽。
[0056]有利的是，氨基酸肽P包含肽P'或者由肽P'组成，其能够选择性地结合抗原。P'优 选地选自：骆骆驼科重链抗体的可变结构域（V Η Η )、常规抗体的F a b片段、常规抗体的F (ab)'2片段、常规抗体的Fv片段、常规抗体的scFv片段、免疫球蛋白新抗原受体（IgNAR)、 nanof it in、DARPin、anti calin、亲合体、affilin、avimer、单体(monobody)和库尼茨结构 域。
[0057]常规抗体的Fab、F(ab) '2、Fv和scFv片段是本领域技术人员公知的。IgNAR综述于 Dooley H.等人，2006，Dev Comp Immunol · JOjS-SGaNanofitin(如affitin)综述于 Mouratou B.等人，2007，Proc Natl Acad Sci U.S.A. ,104:17983-8 JARPin 综述于 Binz H.K.等人，2003, J .Mol .Biol. ,332:489-503 jnticalin 综述于 Skerra A，2008，FEBS J.， 275 :2677-83 c^Affibody 综述于 Nord K.等人，1997，Nature Biotechnol.，15: 772-777〇 Affil in 综述于 Ebersbach H.等人，2007, J .Mol .Biol ·，372:172-185 Jvimer 综述于 Silverman J.等人，2005，Nature Biotechnol ·，23:1556-1561。单体（或adnectin)综述于 Koide A.等人，1998，J.Mol.Biol. ,284:1141-51。库尼茨结构域综述于Lehmann A.，2008， Expert opinion on biological therapy，8:1187-99。
[0058] 在一个优选的实施方式中，P'是VHH，比如根据本发明的VHH。
[0059] 式P-C-Z的寡肽的氨基酸肽P在其C端具有1至10个氨基酸的间隔序列Y，优选地，1 至10个中性的或者带负电的氨基酸的间隔序列，其中所述氨基酸间隔序列Y的氨基酸残基 是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸间隔序列Y不含半胱氨酸残基。
[0060] 式z-c-ρ的寡肽的氨基酸肽P在其N端具有1至10个氨基酸的间隔序列Y，优选地，1 至10个中性的或者带负电的氨基酸的间隔序列，其中所述氨基酸间隔序列Y的氨基酸残基 是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸间隔序列Y不含半胱氨酸残基。
[0061] 有利的是，氨基酸间隔序列Y的氨基酸残基选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，优选丙氨酸、 缬氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
[0062] 优选，氨基酸间隔序列Y代表4个中性氨基酸的间隔序列，比如氨基酸序列G-G-G-S (SEQ ID N0.11)。
[0063] 式P-C-Z的寡肽的氨基酸肽P还在其N端具有1至50个氨基酸的序列X，其中所述氨 基酸序列X的氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸序列X不包含半胱氨酸残 基。
[0064] 式Z-C-P的寡肽的氨基酸肽P还在其C端具有1至50个氨基酸的序列X，其中所述氨 基酸序列X的氨基酸残基是相同的或不同的，并且其中所述氨基酸序列X不包含半胱氨酸残 基。
[0065] 氨基酸序列X包含标签和酶切位点，所述标签比如6XHis标签(SEQ ID N0.9)，所 述酶切位点比如氨基酸序列LVPRGS(SEQIDN0.10)所示的凝血酶切位点。
[0066] 在一个优选的实施方式中，根据本发明的寡肽具有式？'-^、？'-￥-(：-2、乂-?'-(：-Z、X-P ' -Y-C-Z、Z-C-P '、Z-C-Y-P '、Z-C-P ' -X或者Z-C-Y-P ' -X，其中P ' 优选是VHH，比如根据 本发明的VHH。
[0067]本发明还提供一种VHH衍生物，其由包含根据本发明的VHH的多肽组成，只要包含 在所述多肽之中的所述VHH能够结合淀粉样蛋白邱勺纤维状形式。
[0068]在一个具体的实施方式中，所述VHH衍生物从N端至C端包含氨基酸标签比如6 X His标签、酶切位点比如凝血酶切位点、VHH、氨基酸间隔序列、半胱氨酸和第二氨基酸间隔 序列。这种VHH衍生物对应着具有式X-P ' -Y-C-Z的根据本发明的寡肽，其中P '是VHH。
[0069]在一个优选的实施方式中，所述VHH衍生物具有氨基酸序列SEQ ID N0.8(R3VQ-SH)〇
[0070] 本发明还提供一种分离的多核苷酸，其编码根据本发明的寡肽、VHH或者VHH衍生 物。
[0071] 编码根据本发明的VHH衍生物的多核苷酸的示例是序列SEQ ID N0:17(编码R3VQ-SH的核苷酸序列）。
[0072] 一种根据本发明的多核苷酸，其是通过重组DNA技术和/或化学DNA合成的公知方 法获得的。
[0073] 本发明还提供一种重组表达盒，其包含在转录启动子控制下的根据本发明的多核 苷酸，转录启动子允许在宿主细胞中调节所述多核苷酸的转录。所述多核苷酸还可以连接 至适当的控制序列，控制序列允许在宿主细胞中调节其翻译。
[0074] 本发明还提供一种重组载体(例如，重组表达载体），其包含根据本发明的多核苷 酸。有利的是，所述重组载体是包含根据本发明的表达盒的重组表达载体。
[0075]如此处所用，术语"载体"涉及能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。术语包 括作为自我复制的核酸结构的载体，以及并入宿主细胞基因组的载体，其中所述载体引入 所述宿主细胞中。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。这种载体此处被称为 "表达载体"。
[0076] 本发明还提供一种宿主细胞，其包含根据本发明的重组表达盒或重组载体。宿主 细胞是原核或真核宿主细胞。
[0077] 术语"宿主细胞"涉及在其中引入有外源性核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿 主细胞包括"转化体"和"转化细胞"，其包括初始的转化细胞及其衍生后代，而不考虑传代 次数。在核酸含量方面，后代可能不完全和母细胞相同，但可能包含突变。在原始转化的细 胞中筛选或选择的具有相同功能或者生物活性的突变后代也包括在此处。
[0078] 一种表达氨基酸序列SEQ ID No.4所示的VHH R3VQ的原核宿主细胞，其于2013年 11月12日以1-4818的编号保藏在法国巴黎邮编15，Dr Roux街75724的国家培养物和微生物 保藏中心(CNCM)。
[0079] 一种表达氨基酸序列SEQIDNo.8所示的VHHR3VQ-SH的原核宿主细胞，其于2013 年11月12日以1-4819的编号保藏在法国巴黎邮编15，Dr Roux街75724的国家培养物和微生 物保藏中心(CNCM)。
[0080] 本发明还提供一种用于在如上述所限定的宿主细胞中生产根据本发明的式P-C-Z 或Z-C-P所示寡肽的方法，包括步骤：
[0081] -提供含有根据本发明的重组表达盒或重组载体的宿主细胞，
[0082]-培养所述宿主细胞，
[0083]-以及，任选地，纯化式P-C-Z或Z-C-P所示寡肽。
[0084] 用于纯化寡肽的方法是本领域公知的，比如色谱(如离子交换色谱、凝胶渗透色谱 和反相色谱）。
[0085] 本发明还提供了一种诊断或者治疗剂，其包含直接或者间接、共价或非共价连接 至感兴趣的物质的根据本发明的VHH、VHH衍生物或寡肽。
[0086] 根据本发明的感兴趣的物质能够或不能穿透哺乳动物或者人类血脑屏障。如果感 兴趣的物质穿透所述血脑屏障，则利用根据本发明的VHH、VHH衍生物或寡肽可以允许增强 所述感兴趣的物质穿过血脑屏障的递送。
[0087] 在一个实施方式中，所述感兴趣的物质是诊断或者治疗化合物。
[0088] 在另一个实施方式中，所述感兴趣的物质是包含诊断或者治疗化合物的脂质体或 者聚合实体(A.J.L.Villaraza等人，Chem Rev.2010，110,2921-2959)〇
[0089] 有利的是，所述诊断化合物选自：
[0090] -酶，比如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶或者β-半乳糖苷酶；
[0091] -荧光团，比如绿色荧光蛋白（GFP)、在光谱紫外(UV)部分的波长处激发的蓝色荧 光染料(例如AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸）；AlexaFluor^350)、在蓝光处激发的绿 色荧光染料(如？11^、0 72^1以&?1前1^488)、在绿光处激发的红色荧光染料(例如罗丹明、 德克萨斯红、Cy3、AlexaFluor?染料546、564和594)、或者远红光激发的染料(如Cy5)，通过 电子探测器(CCD相机、光电倍增管)进行可视化；
[0092]-放射性同位素，如可用于PET成像的 18F、nC、13N、150、68Ga、 82Rb、44Sc、64Cu、86Y、89Zr 、124工、152Tb，或者可以用于spECT/^烁扫描研究的 2<3111、155113、1951^，或者可用于放射自显影或原位杂交的 14(：、3!1、355、3￥、1251，或者可用于标 记化合物的 211At-、212Bi-、75Br-、76Br-、 131I-、mIn、177Lu-、212Pb-、 186Re-、188Re-、153Sm-、90Y;
[0093] -NMR或者MRI造影剂，比如顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Μη)，以及基于铁氧化物的 超顺磁剂(如MI0N、SPI0或者USPI0)或基于铂铁的超顺磁剂（SIPP)，以及X-核比如 18F、13C、 23Na、170、15N;
[0094] -纳米颗粒，比如金纳米颗粒（B.Van de Broek等人，ACSNano,卷5，1'1〇.6,4319-4328，2011)或者量子点（A. Sukhanova 等人，Nanomedicine ,8(2012)516-525)。
[0095] 在一个优选的实施方式中，所述诊断化合物是MRI造影剂，更优选地钆。
[0096] 当诊断剂用于检测，它可以包括用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如99Tc或者 1231，或者用于核磁共振(匪1〇成像(还称为1?1)的自旋标记，比如 13(：、平心、6(1、1231、111111、 Mn、15N 或者 70。
[0097] 有利的是，所述治疗化合物选自：肽、酶、核酸、病毒和化学实体。它可以是止痛化 合物、抗炎化合物、抗抑郁化合物、抗惊厥化合物、细胞毒性化合物或者抗神经退行性化合 物。
[0098] 如上述所限定的感兴趣的物质可以直接且共价地或者非共价地连接至根据本发 明的VHH、VHH衍生物或者寡肽，或者连接至所述VHH、VHH衍生物或者寡肽的末端之一 (N或者 C端），或者连接至所述VHH、VHH衍生物或者寡肽的氨基酸之一的侧链。感兴趣的物质还可以 通过间隔序列的方式间接且共价地或者非共价地连接至所述VHH或VHH衍生物，或者连接至 所述VHH或VHH衍生物的末端之一，或者连接至所述VHH或VHH衍生物的氨基酸之一的侧链。 传统的将感兴趣的物质连接至肽尤其是抗体的方法，是本领域中已知的（比如，参见 TERNYNCK and AVRAMEAS，1987, "Techniques immunoenzymatiques''Ed.INSERM，Paris或者 G. T. Hermanson, Biocon jugate Techniques，2010，Academic 出版社）。
[0099] 许多化学交联方法是本领域已知的。交联剂可能是同双功能的（即，有两个官能团 进行相同的反应)或异双功能的（即，有两个不同的官能团）。大量的交联剂是市售可获得 的。它们使用的详细说明很容易从商业供应商获得。多肽的交联和缀合物制备的一般参考 是：WONG，Chemistry of protein conjugation and cross_linking，CRC Press(1991)〇
[0100] 使用本领域公知的常规的有机化学技术，根据本发明的VHH、VHH衍生物或者寡肽 可标记有特异性的放射性同位素或者NMR或MRI造影剂或荧光团或纳米颗粒或酶，参见例如 March，J.ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY:REACTI0NS，MECHANISMS，AND STRUCTURE(第三版， 1985)或者G · T · Hermanson，Biocon jugate Techniques，2010，Academic 出版社。
[0101] 此外，通过本领域公知的多种方法，直接通过重氮碘对重氮化的氨基衍生物进行 碘化（参见Greenbaum，1936，F.Am. J.Pharm.，108:17)、或者通过将不稳定的重氮化胺转换 成稳定的三氮烯、或者通过将非放射性卤代前体转换成稳定的三烷基锡衍生物，随后三烷 基锡衍生物转化成碘代化合物，根据本发明的VHH、VHH或者寡肽衍生物还可以标记有任何 合适的放射性碘同位素，例如但不限于 1311、1251、或者1231。参见Satyamurthy和Barrio， 1983，J.Org.Chem.，48:4394;Goodman等人，1984, J.Org.Chem.，49:2322，以及Mathis等人， 1994，J.Label 1 .Comp.and Radiopharm.，905;Chumpradit等人，1991，J.Med.Chem.，34: 877 ; Zhuang等人，1994，J · Med · Chem. 37 :1406; Chumpradit等人，1994，J .Med · Chem. 37 : 4245 〇
[0102] 尤其是，通过任意的本领域公知的多种技术，根据本发明的VHH、VHH衍生物或者寡 肽可以标记有123I以便用于SPECT。参见，例如Kulkarni，1991，Int·J·Rad·Appl·&Inst· (Part B)18：647〇
[0103] 根据本发明的VHH或VHH衍生物还可以被放射标记有已知的金属放射性标记，比如 锝99m(99mTc)。修饰取代基从而引入结合这种金属离子的配体，这可以由放射标记领域的普 通技术人员实现，而无需过度实验。根据本发明的金属放射性标记的VHH或者VHH衍生物，然 后可以用于检测淀粉样蛋白β沉积。制备 99mTc放射性标记的衍生物是本领域公知的。参见例 如Zhuang等人，1999，Nuclear Medicine&Biology，26 : 21 7-24; Oya等人，1998，Nuclear Medicine&Biology，25:135-40;Horn等人，1997，Nuclear Medicine&Biology，24:485-98〇
[0104] 本发明还涉及用于获得直接或者间接偶联有感兴趣的物质的根据本发明的VHH或 者VHH衍生物(功能性缀合物)的偶联方法。
[0105] 根据第一种策略，通过使用非位点特异性方法，将根据本发明的VHH或者VHH衍生 物缀合至感兴趣的物质。所述非位点特异性方法包括将感兴趣的物质和根据本发明的VHH 或者VHH衍生物进行缀合的步骤。
[0106] 当感兴趣的物质是金属时，如NMR或者MRI造影剂（例如，顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和 锰(Μη)，以及基于铁氧化物或者铂铁的超顺磁剂，以及X-核，比如 比如金属放射性同位素(例如，，、〃^严⑶^^^^^批^啪^非位点特异性的方 法采用螯合剂，并包括以下步骤：
[0107] (i)将以酯或酸酐形式激活的螯合剂，优选以酯形式激活的螯合剂，和根据本发明 的VHH或者VHH衍生物的赖氨酸残基进行缀合，以及
[0108] (ii)将步骤(i)的配体和感兴趣的物质进行螯合。
[0109] 替代采用螯合剂的非位点特异性方法的方法，是这样一种方法，在其中感兴趣的 物质用螯合剂进行"预螯合"，这种方法包括以下步骤：
[0110] (η将感兴趣的物质和以酯或酸酐形式激活的螯合剂，优选以酯的形式激活的螯 合剂，进行螯合，以及
[0111] (ii '）将步骤(i '）的预螯合的感兴趣的物质和根据本发明的VHH或者VHH衍生物的 赖氨酸残基进行缀合。
[0112] 步骤（i)或（ii'）的缀合期间，温度可以从1变化到40°C，并且优选从4至20°C。溶液 可以搅拌1至6小时。优选地，步骤⑴或（i i '）缀合期间的pH保持在7至8.5。
[0113] 在有咪唑或者没有咪唑的PBS/NaCl中进行缀合步骤(i)或（ii'），优选存在咪唑。
[0114] 缀合步骤（i)或（ii'）期间，以酯或酸酐形式激活的螯合剂可以溶解在缓冲液中， 如磷酸盐缓冲(PBS)溶液。
[0115] 在一个优选的实施方式中，以酯或酸酐形式激活的螯合剂和VHH或者VHH衍生物的 赖氨酸残基的氨基官能团之间的摩尔比范围从1至1 〇，优选是4。
[0116] 缀合步骤（i)和螯合步骤（ii)之间、或者螯合步骤（i'）和缀合步骤（ii'）之间，可 以有通过渗透过滤或者透析进行的缓冲液交换步骤。有利的是，溶液是渗透过滤的，例如采 用Vivaspin?装置。这种缓冲液交换步骤期间，在范围从1至5°C的温度冷却介质。这种缓冲 液交换步骤期间，例如用醋酸钠溶液交换缓冲溶液，优选搅拌〇至6个小时，更优选2至3小 时。
[0117] 螯合步骤(ii)或（i'）期间，溶液搅拌1至4小时，优选2至3小时。优选，在1至60°C进 行螯合步骤，更优选在4°C。
[0118] 然后，可以有通过渗透过滤或者透析进行的第二缓冲液交换步骤。有利的是，溶液 是渗透过滤的，例如采用Vivaspin?装置。此第二缓冲液交换步骤期间，在范围从1至5°C的 温度冷却介质。第二渗透过滤步骤期间，例如用混合物PBS/NaCl交换缓冲溶液，并且通过相 同的方法进行浓缩(渗透过滤）。
[0119]根据赖氨酸的数量，每VHH或者VHH衍生物的感兴趣的物质平均密度可以从0至赖 氨酸的数目+1之间变化。优选，每VHH或者VHH衍生物的感兴趣的物质平均密度可以从0至5 之间变化。
[0120]根据本发明的非位点特异性方法适用于根据本发明的VHH或者VHH衍生物，并且可 以扩展至其它VHH。
[0121] 根据第二策略，通过位点特异性方法将根据本发明的寡肽，优选地包括根据本发 明的VHH衍生物，缀合至感兴趣的物质。位点特异性方法有以下优点：
[0122] -标记的寡肽是化学上明确的，因为这种方法提供明确的缀合物，这是针对人类使 用的一个基本特征(质量控制、安全性…），
[0123] -方法简便且标准，因为用感兴趣的物质来标记寡肽可以在单一步骤中进行，反应 时间短且程序简单。无需在线监测，并且在标记程度和结合性能之间不用实现权衡。对于进 一步的优化、实验重复性和生产规模的扩大有关键的优势，
[0124] -该方法不影响寡肽的关键性质：例如，当P包含VHH或由VHH组成，在最终样本中缀 合物的pi维持在8.5以上，从而应当允许穿过BBB。此外，不存在可能和缀合物竞争靶标的剩 余未标记寡肽;反应时间短且处于生理性pH的温和条件防止寡肽免于潜在的降解和/或活 性损失，
[0125] -该方法具有通用性，因为它允许灵活且模块化的方法，在其中可分别制备各种寡 肽和造影剂、或其它感兴趣的分子，然后在单一步骤中进行组合。因此，轻易获得一组缀合 物用于优化以及通过IHC和MRI进行的下游评价，以及上述所有，
[0126] -该方法允许提高总产率，同时降低反应步骤数，在VHH的赖氨酸或组氨酸上没有 副反应，并且整体维持VHH的功能与三维结构。
[0127] 根据本发明的位点特异性方法包括根据本发明的寡肽和感兴趣的物质之间的缀 合步骤，其中感兴趣的物质带有巯基反应官能团。
[0128] 在位点特异性方法的一个优选实施方式中，在根据本发明的寡肽和巯基反应性化 合物之间进行缀合步骤，其中所述巯基反应性化合物带有所述感兴趣的物质。
[0129] 有利的是，带有感兴趣物质的巯基反应性化合物是马来酰亚胺化合物，优选是以 下限定的式(I)或（Γ)所示的马来酰亚胺化合物。
[0130] 可以在范围从0至20°C的温度，优选4 °C，例如从2至4小时，进行寡肽的半胱氨酸和 巯基反应性化合物之间的硫代加成。
[0131]优选在范围从4至7.5,更优选在6.8的pH，实现寡肽的半胱氨酸和巯基反应性化合 物之间的硫代加成，其中巯基反应性化合物，比如以下限定的式(I)或（Γ)的马来酰亚胺化 合物。低于pH = 4反应不工作，而超过7.5则反应不是特异性的(在赖氨酸上反应）。为了调节 pH，缀合步骤（i)或（i i '）可以在有或没有咪唑的PBS/NaCl中进行，优选存在咪唑。鉴定马来 酰亚胺化合物对蛋白的硫代加成的特定条件是出乎意料的，因为其允许节省步骤并提高过 程的总产率，其中蛋白直接洗脱自纯化柱。
[0132] 然后，可以有通过渗透过滤或者透析进行缓冲液交换步骤。有利的是，溶液是渗透 过滤的，例如采用Vivaspin?装置。然后，通过相同的方法浓缩溶液(渗透过滤）。
[0133] 然而，当缀合步骤（i)或（i i '）在有咪唑的PBS/NaCl中进行时，优选不进行随后的 渗透过滤或者透析步骤(为了不除去咪唑）。
[0134] 无论是对于非特异性的方法还是特异性的方法，感兴趣的物质如上述所限定的。
[0135] 根据一个优选的实施方式，感兴趣的物质是上述所限定的治疗或者诊断化合物， 优选诊断化合物选自：上述所限定的荧光团、放射性同位素、和NMR或MRI造影剂。
[0136] 本发明人发现，当感兴趣的物质是匪R或MRI造影剂时，合成的缀合物保留了未标 记的VHH的关键功能特性。
[0137] 根据优选的实施方式，感兴趣的物质是NMR或MRI造影剂，比如顺磁剂钆(Gd)、镝 (Dy)和锰(Μη)，以及基于铁氧化物的超顺磁剂(如MI0N、SPI0或者USPI0)或基于铂铁的超顺 磁剂(SIPP)，以及X-核比如 1￥、13(：、23似、170、1力，以及更优选感兴趣的物质是匪1?或1?1造影 剂，其选自顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Μη)。
[0138] 螯合剂选自：1，4,7，10_四氮杂环十二烷-1，4,7，10-四乙酸(D0TA)、二乙三胺五乙 酸(DTPA)、1，4,7-三(羧甲基氮杂）环十二烷-10-氮杂乙酰胺(D03A)、次氮基三乙酸(ΝΤΑ) (Chong等人，2008，19，1439)、D-青霉胺(Pen)、2，3-二巯基丁二酸(DMSA)、2，3-二巯基-1-丙 磺酸（DMPS)(0.Andersen，Chem.Rev.，1999，99，ρρ· 2683-2710)、2,3-二巯基丙醇（BAL)、三 乙稀四胺（Trien)、四硫代钼酸铵（ΤΤΜ)阴离子（G. J.Brewer，F.K.Askari，J.Hepatol ·， 2005，42，ρρ· S13-S21)、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-(p-异硫氰酰苄基)-6-甲基-二乙三胺五乙 酸（IB4M) (Nwe等人，J. Inorg·Biochem，2011，105，722)、羟基吡啶酮（Η0Ρ0) (Villaraza等 人，Chem.Rev.，2010，110,2921)〇
[0139] 当感兴趣的物质是钆时，优选D0TA是螯合剂。
[0140]本发明还提供如上限定的式P-C-Z或Z-C-P所示寡肽，其中所述的半胱氨酸残基C 通过硫化物键(sulphide bond)优选通过硫醚或二硫键连接至少一种感兴趣的物质。有利 的是，所述的半胱氨酸残基C通过巯基反应性化合物连接至少一种感兴趣的物质，其中巯基 反应性化合物带有所述感兴趣的物质。
[0141]在本发明的意义内，巯基反应性化合物是马来酰亚胺、卤代乙酰基、烷基卤或氮杂 环丙烷化合物、丙稀酰衍生物、芳基化剂或疏基-二硫键交换剂（thiol-di sulfide exchange reagent)(Bioconjugate Techniques,G.T.Hermanson,2010,Academic Press)。
[0142] 在本发明的意义内，马来酰亚胺化合物是带有至少一个马来酰亚胺官能团的化合 物，优选1至6个马来酰亚胺官能团，更优选一个马来酰亚胺官能团。
[0143] 优选地，巯基反应性化合物是通过马来酰亚胺官能团的C-C双键和半胱氨酸残基C 发生反应的马来酰亚胺化合物。
[0144] 本发明的马来酰亚胺化合物可以是以下式(I)所示的：
[0145]
[0146] 其中：
[0147] 3、8'1、8'2和矿是相同的或不同的，其各自独立地是选自以下的单键或间隔序列 ： 多元醇，比如聚乙二醇(PEG)，其优选具有2至12个氧乙烯(0E)单元;聚烯烃，其优选具有2至 12个芳香环;聚烷基，其优选具有2至12个碳原子；乙烯基聚合物，比如聚（甲基丙烯酸烷基 酯），其优选具有2至12个甲基丙烯酸基团；聚醛，其优选具有2至12个羰基;聚酸酯，其优选 具有2至12个酯基，
[0148] _D、D'和D"是相同的或不同的，其各自独立地是选自胺、酰胺、氨基醇、尿素、硫脲、 氨基甲酸酯、碳酸酯、酯、醚、硫醚、芳基、杂芳基比如三唑、肟基，
[0149] -A是单键或者螯合剂，
[0150] -SI是感兴趣的物质，
[0151] -X'是酸、胺、酰胺、酯、醚、烷基、烯基、炔基、芳基或者杂芳基官能团，以及
[0152] -n = l 至 100,优选地 n = l、2 或者 3。
[0153] 在本发明的意义之内：
[0154] -烷基选自（&-&2)烷基，并且优选(Q-C6)烷基，比如甲基、乙基、η-丙基、异丙基、 η-丁基、仲丁基、叔丁基和异丁基；
[0155] -烯基选自2至12个优选2至6个碳原子的烃链，有至少一个碳碳双键。烯基的示例 包括乙烯、丙烯、异丙烯、2,4_戊二烯；
[0156] -炔基选自2至12个优选2至6个碳原子的烃链，有至少一个碳碳叁键；
[0157] -芳基表示衍生自至少一个简单芳香环的任何官能团或者取代基;芳香环对应着 具有离域η系统的任何平面环形化合物，在所述离域η系统中环的每一个原子包括Ρ轨道，所 述Ρ轨道彼此重叠。更具体地说，术语芳基包括但不限于苯、联苯、1-萘、2-萘、蒽基、芘基、及 其取代的形式。本发明的芳基优选地包括4至12个碳原子，更优选地5或者6个碳原子；
[0158] -杂芳基表示衍生自至少一个如上限定的芳香环的任何官能团或者取代基，并且 含有选自P、S、0和Ν的至少一个杂原子。术语杂芳基包括但不限于呋喃、吡啶、吡咯、噻吩、咪 唑、吡唑、噁唑、异噁唑、三唑、噻唑、异噻唑、四唑、吡哒唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、苯并呋 喃、异苯并呋喃、吲哚、异吲哚、苯并噻吩、苯并[c ]噻吩、苯并咪唑、吲唑、苯并噁唑、苯并异 噁唑、苯并噻唑、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、嘌呤和吖啶。本发明的芳基和杂芳基 包括优选地4至12个碳原子，更优选5或者6个碳原子；
[0159] 根据本发明的酸、胺、酰胺、酯、醚和硫醚优选具有1至12更优选1至6个碳原子。
[0160] 根据优选的实施方式，A是螯合剂，以及感兴趣的物质SI是NMR或者MRI造影剂。
[0161] 有利的是，螯合剂A选自1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(D0TA)、二 乙三胺五乙酸(0了?4)、1，4,7-三(羧甲基氮杂)环十二烷-10-氮杂乙酰胺(0034)、次氮基三 乙酸(NTA)、D-青霉胺(Pen)、2,3-二巯基丁二酸(DMSA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)、2,3-二巯基丙醇(BAL)、三乙烯四胺(Trien)、四硫代钼酸铵(TTM)阴离子、乙二胺四乙酸(EDTA)、 2-(p_异硫氰酰苄基)-6-甲基-二乙三胺五乙酸（IB4M)或羟基吡啶酮(Η0Ρ0)。
[0162] 有利的是，感兴趣的物质SI是钆，以及螯合剂是D0TA。
[0163] 根据一个尤其优选的实施方式，本发明的马来酰亚胺化合物是式0-)所示：
[0164]
[0165] 其中，8、8'1、8'2、8"、厶、31以及11是上述所限定的。
[0166] 通过固相方法，优选使用Fmoc化学，以及更优选在Fmoc-Gly-Wang树脂上合成式 (I)或（Γ)的马来酰亚胺化合物。
[0167] 式（Γ)的马来酰亚胺化合物：
[0168]
[0169] 其中，8、8'1、8'2、8"^、31以及11如上述所限定的，也属于本发明的一部分。
[0170] 本发明的另一个目的是带有半胱氨酸残基的寡肽，其中半胱氨酸残基连接至至少 一种感兴趣的物质，优选通过巯基反应性化合物更优选通过根据本发明所限定的马来酰亚 胺化合物连接至至少一种感兴趣的物质，所述寡肽是根据本发明的位点特异性方法获得 的。
[0171]本发明还提供通过本发明的非位点特异性方法获得的缀合至感兴趣物质的VHH或 者VHH衍生物，以及缀合至巯基反应性化合物的VHH，其中巯基反应性化合物携带根据本发 明的位点特异性方法获得的感兴趣的物质。
[0172]如果感兴趣的物质是肽，可以通过遗传工程将根据本发明的VHH或者VHH衍生物以 及所述感兴趣的物质制备成融合多肽，其包含根据本发明的VHH或者VHH衍生物以及合适的 肽。可方便地在已知的合适宿主细胞中表达这种融合多肽。
[0173] 通过注射，比如静脉内、动脉内、鞘内（通过脊髓液）、腹腔内、肌肉内或者皮下注 射、或通过滴鼻，将根据本发明的VHH、VHH衍生物、寡肽、治疗或诊断剂可施用至受试者(哺 乳动物或人）。
[0174] 当根据本发明的VHH施用至人受试者时，那么可以进行人源化以便降低在人中的 免疫原性。用于生产人源化抗体或其片段的方法是本领域公知的(Vincke C.等人，2009，J Biol Chem.，284,3273-84)。
[0175] 在诊断或者监测淀粉样蛋白β沉积介导的疾病中，如阿尔茨海默氏病(AD)和唐氏 综合征，根据本发明的诊断剂可用于脑成像。
[0176]本发明还提供一种试剂盒，其包含根据本发明的VHH、VHH衍生物或者寡肽以及上 述所限定的感兴趣的物质。
[0177] 特别是，本发明还提供用于脑成像、或用于诊断或者监测淀粉样蛋白β沉积介导的 疾病如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的试剂盒，其至少包含上述所限定的VHH或VHH衍生物 和诊断剂。
[0178] 本发明还提供根据本发明的诊断剂用于诊断或者监测受试者中由淀粉样蛋白β沉 积介导的疾病如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的用途。
[0179]如此处所用，"受试者"是哺乳动物，优选人，最优选疑似患有淀粉样蛋白β沉积介 导的疾病如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的人。
[0180]本发明还提供在受试者中体外或者离体诊断淀粉样蛋白β沉积介导的疾病如阿尔 茨海默氏病和唐氏综合征的方法，包括步骤：
[0181] a)用根据本发明的诊断剂体外接触来自所述受试者的适当生物样本，以及
[0182] b)在所述生物样本中，确定淀粉样蛋白β沉积比如淀粉样蛋白斑块的存在或者不 存在，
[0183] 所述淀粉样蛋白β沉积的存在表明所述受试者患有淀粉样蛋白β沉积介导的疾病， 如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征。
[0184] 可以通过确定VHH抗原复合物（即，针对淀粉样蛋白β的纤维状形式的VHH)的存在 或者不存在，来进行步骤b)。
[0185] 本发明还提供在受试者中体外或者离体监测淀粉样蛋白β沉积介导的疾病如阿尔 茨海默氏病和唐氏综合征的进展或消退(regress ion)方法，包括步骤：
[0186] a)用根据本发明的诊断剂体外接触来自所述受试者的适当生物样本，
[0187] b)在所述生物样本中，确定淀粉样蛋白邱勺纤维状形式的量，以及
[0188] c)将步骤b)确定的量和所述受试者先前获得的淀粉样蛋白邱勺纤维状形式的量进 行比较，
[0189] 淀粉样蛋白邱勺纤维状形式的量显著增加，构成了淀粉样蛋白β沉积介导的所述疾 病的进展的标志，淀粉样蛋白邱勺纤维状形式的显著降低构成了淀粉样蛋白β沉积介导的所 述疾病的消退的标志。
[0190]如此处所用，术语"显著增加"和"显著降低"分别指的是，相较于来自所述受试者 适当生物样本中所先前确定的并用作参考量的淀粉样蛋白β的纤维状形式的量，在适当的 生物样本中淀粉样蛋白邱勺纤维状形式的量更高或量更低。
[0191 ]还可以通过确定VHH抗原复合物的存在或不存在来进行步骤b)。
[0192] 所述适当的生物样本可以是脑活检或者尸脑组织。
[0193] 根据本发明的方面，其涉及在脑活检或尸检脑组织中检测淀粉样蛋白β沉积的方 法，所述方法可包括用根据本发明的诊断剂溶液孵育福尔马林固定的组织。孵育后，诊断化 合物标记组织中的淀粉样蛋白β沉积，通过任何标准的方法可以检测或观察染色的或标记 的淀粉样蛋白β沉积。这样的检测手段包括显微技术，比如明场、荧光、激光共聚焦和交叉极 化显微镜。定量活检或尸组织中的淀粉样蛋白β的量的方法，涉及例如根据本发明的诊断 剂、或其水溶性、无毒的盐和活检或者尸组织匀浆进行孵育。由本领域公知的方法获得组合 并进行匀浆。尽管其它诊断化合物比如酶、荧光团或者NMR或MRI造影剂也可以使用，有利 地，诊断化合物是放射性同位素标记的化合物。
[0194] 本发明还提供一种在受试者体内成像淀粉样蛋白β沉积的方法，包括步骤：
[0195] a)在受试者中施用可检出量的根据本发明的诊断剂，受试者优选是人，以及
[0196] b)通过成像方法，检测所述受试者中的诊断剂。
[0197] 根据本发明的这种方法允许确定受试者脑中淀粉样蛋白沉积的存在和位置，受试 者优选是人。
[0198] 如此处所用，"可检出量"指的是所施用的诊断剂的量足以能够检测诊断剂对淀粉 样蛋白邱勺结合。
[0199] 如此处所用，"成像有效量"指的是所施用的诊断剂的量足以能够成像所述诊断剂 对淀粉样蛋白邱勺结合。
[0200] 用于检测体内淀粉样蛋白β沉积的成像方法包括非侵入性神经影像学技术，比如 磁共振波谱(MRS)或成像(MRI)、或者伽马成像比如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发 射计算机断层扫描(SPECT)。
[0201] 出于体内成像的目的，可用的检测仪器的类型是选择给定标记的主要因素。例如， 基于钆、铁或者锰的造影剂，可以用来通过磁共振波谱(MRS)或成像(MRI)来检测连接至所 述感兴趣的物质的根据本发明的VHH或VHH衍生物。放射性同位素比如 19F还特别适合本发明 方法中的体内成像。所使用的仪器的类型将指导对感兴趣的物质的选择。例如，所选的放射 性核素必须具有能够被给定类型仪器检测到的衰变类型。另一个考虑涉及造影剂的或者放 射性核素的半衰期。对于放射性同位素，半衰期应该足够长，从而在脑的最大摄取时它仍然 能够被检测到，但是也要足够短从而受试者不维持有害的辐射。可以使用伽马成像检测根 据本发明的放射性标记的VHH或者VHH衍生物，其中检测发射的适当波长的伽马辐射。伽马 成像方法包括，但不限于，SPECT和PET。优选的是，对于SPECT检测，所选择的放射性同位素 将缺乏颗粒发射，但将产生140至200keV范围的大量光子。对于PET检测，放射性标记将是正 电子发射的放射性核素，比如 19F，其湮灭而形成两个511keV的伽马射线，伽马射线被PET相 机检测到。
[0202] 通常，可检测的诊断剂的剂量将取决于以下考虑的不同而不同，比如患者年龄、条 件、性别和疾病程度、禁忌症、如果有，伴随的治疗和其它变量，由本领域的技术人员调整。 对受试者的施用可以是局部的或者系统性的，并通过静脉内、动脉内、鞘内（通过脊髓液)等 实施。根据检查的身体部位，施用还可以是皮内或者腔内。足够的时间过去之后，以便于化 合物与淀粉样蛋白β结合，例如30分钟至48小时，通过常规成像技术比如MRS/MRI、SPECT、平 面闪烁成像、PET、和任何新兴的成像技术等来检查所研究的受试者区域。具体的规程将有 必要地取决于如上所述的患者特定因素，并且取决于所检查的身体部位、所用的施用方法 和标记类型;具体程序的确定对于技术人员而言是常规的。
[0203] 本发明还提供作为诊断剂的连接至诊断化合物的根据本发明的寡肽。
[0204] 本发明还提供一种药物组合物，其包含上述所限定的治疗剂和药学上可接受的载 体。
[0205]如此处所用，"药学上可接受的载体"旨在包含与药学施用兼容的任何和所有溶 剂、分散介质、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。合适的载体描述于最新版本的 Remington's Pharmaceutical Sciences中，这是本领域标准的参考文本。这些载体或者稀 释剂的优选示例包括，但不限于，水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。还 可使用脂质体、阳离子脂质体和非水载体比如固定油。用于药物活性物质的这种介质和试 剂的使用是本领域公知的。除非任何传统介质或试剂和上述限定的治疗剂不兼容，其在本 发明组合物中的使用就可以考虑。
[0206] 本发明还提供根据本发明的VHH、VHH衍生物、治疗剂或者药物组合物作为药物，特 别是用于治疗由淀粉样蛋白β沉积介导的疾病，比如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征。
[0207] 本发明还提供预防或治疗由淀粉样蛋白β沉积介导的疾病比如阿尔茨海默氏病和 唐氏综合征的方法，包括向有需求的受试者施用根据本发明的治疗剂或药物组合物。
[0208] 如此处所用，术语"治疗"包括出于治疗、治愈、缓解、减轻、改变、弥补、改善、提高 或者影响疾病、疾病症状或者患病倾向的目的，向患者施用根据本发明的VHH、VHH衍生物、 治疗剂或药物组合物，其中所述患者患有疾病、疾病症状或者患病倾向。
[0209] 术语"预防"是指由淀粉样蛋白β沉积介导的疾病比如阿尔茨海默氏病的进展得以 降低和/或消除，或者由淀粉样蛋白β沉积介导的疾病比如阿尔茨海默氏病的发作得以延迟 或消除。
[0210] 另一方面，本发明涉及根据本发明的VHH或VHH衍生物用于制备将上述限定的感兴 趣物质递送穿过哺乳动物血脑屏障的肽载体的用途，所述哺乳动物血脑屏障优选是人血脑 屏障。
[0211]本发明还提供作为治疗剂的根据本发明的连接至治疗化合物的寡肽。
[0212]除了前述特征，本发明还包括其它特征，将通过以下描述得以显现，这涉及用于说 明本发明的实施例以及附图。
【附图说明】
[0213]图1显示使用VHH R3VQ在人石蜡切片上进行的淀粉样蛋白斑块的免疫组织化学染 色。6F3D(Akiyama Η.等人，1996，Neurosci lett.，206:169-72)用作参考抗Αβ抗体。
[0214]图2显示使用VHH R3VQ在新鲜人AD脑组织上进行的淀粉样蛋白β斑块的免疫组织 化学染色以和8)。468(町311丨6￥81^1\等人，1996,8.8丨〇(*6111夂，313:575-80)用作参考抗八 β抗体(C和D)。
[0215]图3显示使用VHH R3VQ在新鲜脑转基因 TauPS2APP小鼠组织上进行的淀粉样蛋白 斑块的免疫组织化学染色(A)。468用作参考抗Αβ抗体(B)。
[0216] 图4显示在人脑提取物上以及在Αβ42上进行的Western印记，以VHH R3VQ显色（无 酚红的Ham's F12介质(Gibco)或者含有蛋白酶抑制剂[200μg/ml PMSF、2μg/ml胃酶抑素 A、 4μg/ml亮抑酶肽、30μg/ml苄脒盐酸盐]的缓冲液A[roS，pH 7·4、0·32Μ蔗糖、50mM Hepes、 25mM MgC12、0.5mM DTT])。
[0217] 图5A显示立体定向注射VHH R3VQ之后，在转基因 TauPS2APP小鼠石蜡包埋的切片 中淀粉样蛋白β斑块的免疫组织化学染色。
[0218] 图5Β显不图5Α插图的放大。
[0219] 图6Α显示立体定向注射R3VQ-N-(DOTA/Gd)!-2 2e之后，在转基因 TauPS2APP小鼠石 蜡包埋的切片中淀粉样蛋白β斑块的免疫组织化学染色。
[0220] 图6Β显示图6Α插图的放大。
[0221 ]图6C显示远离注射部位之处，存在于丘脑中的淀粉样蛋白β斑块的标记。
[0222] 图6D显示图6C插图的放大。
[0223] 图6Ε显示在相同小鼠上用4G8抗体标记淀粉样蛋白斑块而进行的对照。
[0224] 图7Α:将转基因 TauPS2APP小鼠的脑浸入抗ΑβνΗΗ-Gd 2e (R3VQ-N-(DOTA/Gd)!-2造 影剂(0.02mg/ml，相当于0.0ImM Gd)溶液之后，体外MR图像显示低信号的点（白色箭头）。
[0225] 图7B显示在相同小鼠上淀粉样蛋白斑块的MRI检测，通过Gd染色进行显色。
[0226] 图7B显示在相同小鼠上淀粉样蛋白斑块的MRI共定位，通过Gd染色进行显色（箭 头)。
[0227] 图7C显示相同小鼠上淀粉样蛋白β斑块的免疫组织化学染色(箭头）。
[0228] 图7D是转基因 TauPS2APP小鼠的脑浸入采用R3VQ-N-(DOTA/Gd)!-2 2e相同浓度的 钆溶液(O.OlmM)的对照。
[0229]图8A:脑室内注射之后，抗ΑβνΗΗ-Gd 2e(R3VQ-N-(D0TA/Gd)!-2;以 lyg/μL的 ΙμL/ 侦U显示海马中离体MR图像上低信号的点（白箭头）。
[0230]图8B显示在相同小鼠上进行的淀粉样蛋白斑块的MRI共定位，通过Gd染色进行显 色(箭头）。
[0231] 图8C显示在相同小鼠上进行的淀粉样蛋白β斑块的免疫组织化学染色(箭头）。
[0232] 图8D是转基因 TauPS2APP小鼠注射采用imQ-rHDOTA/Gdh-2相同浓度的钆溶液 (O.lmM)的对照。
[0233] 图9显示通过非位点特异性方法（A)和位点特异性方法（B)进行的标记的VHH (R3 VQ)的合成。VHH 1和3在roS/NaCl /咪唑缓冲液中洗脱自亲和柱。通过非位点特异性方法 在缓冲液交换之后进行1的缀合(A)，以及，有缓冲液交换(方法1)或者没有缓冲液交换(方 法2)时通过位点特异性方法进行3的缀合(B)。连接位点显示在蛋白上。标记分别产生多分 散混合物（2f显示为示例，以及2e)和化学上明确的缀合物（5显示为示例）。11'=每VHH的 DOTA/Gd的平均量（随机分布在不同位置）。111 =每VHH的DOTA/Gd的精确量(位于单个位点）。 总产率(括号里显示的)包括从亲和柱洗脱缓冲液中的蛋白开始的所有步骤(净肽含量）。马 来酰亚胺_(D0TA/Gd) 3化合物4(C)的固相合成描述于图9(C)。通过传统的固相肽方法采用 Fmoc化学和HATU/DIEA作为偶联剂制备4。总产率表示在括号中。D0TA结构式显示在插图中。
[0234] 图 10显示(A)抗ΑβνΗΗ A7、B10、R3VE、R3VQ和F12的氨基酸序列比对；CDR1、CDR2、 CDR3下划线显示，（B)R3VQ-SH 3的氨基酸序列，（C)R3VE-SH的氨基酸序列。
[0235] 图11显示VHH R3VQ-S-(D0TA/Gd)3的性质分析和评价(化合物5图9)，其是通过位 点特异性缀合获得的。(A)HPLC/MS。（B)IEF。（C) iv注射之后，在脑中通过IHC检测评价VHH的 BBB的穿过。和未缀合的蛋白R3VQ-SH的比较显示在A、B中。
[0236] 图12显示用R3VQ-S-(D0TA/Gd)3体外孵育之后淀粉样蛋白斑块的MRI检测。然而， 在阴性对照PS2APP小鼠脑中没有检测到对比异常（A)，用R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3体外孵育 PS2APP小鼠脑之后，显示若干低信号的点（B，白色箭头）。这些低的信号和淀粉样蛋白斑块 共定位，其中淀粉样蛋白斑块通过Gd染色程序所突出显示，对于通过MRI检测淀粉样蛋白斑 块而言Gd染色程序是金标准阳性对照(C，白色箭头）。在7T光谱仪上实现实验。
[0237] 图13显示iv注射R3VQ-S-(D0TA/Gd)3之后淀粉样蛋白斑块的离体MRI检测。用roS (阴性对照，A-B)或者R3 VQ-S- (DOTA/Gd) 3 以 20mg/kg (C)或 50mg/kg (D) i v注射小鼠，5小时后 处死。在提取的固定的脑中于11.7T时获得MR图像。相较于注射的脑而言(C和D，白色箭头）， 阴性对照不显示强烈的对比异常(A和B)。相较于20mg/kg而言，50mg/kg时这些低信号的点 更强且更多。这些低信号的点和淀粉样蛋白斑块共定位，其中淀粉样蛋白斑块通过阳性对 照程序进行显色(E和F，白色箭头）。
[0238] 图14显示通过位点特异性缀合获得的VHH R3VQ-S-AF488的性质的体外分析和评 价。淀粉样蛋白斑块上的(A)HPLC/MS。（B) SDS-PAGE。（C) IEF。（D) IHC。和未缀合的蛋白R3VQ-SH的比较显示于A、B、C。
[0239] 图15显示在2岁的PS2APP小鼠皮质表面局部脑输注R3VQ-S-AF488之后，淀粉样蛋 白斑块和CAA的体内成像。箭头表示CAA的标记。标尺=50μηι。
[0240] 图16显示使用双光子显微镜的R3VQ-S-AF 488体内成像。（Α)在2岁的PS2APP小鼠 中i ν注射R3VQ-S-AF488之后的脑中体内成像，其中采用距离皮质表面360μπι深的投影体积 进行最大强度投影(MIP)重建。TO代表iv注射前的基线成像。标尺为50μπι。空箭头显示血管A β，实箭头表示实质的Αβ沉积。（B)在2岁的PS2APP小鼠中iv注射R3VQ-S-AF488之后，注射后 3.5小时的脑体内成像。空箭头显示血管Αβ，实箭头表示实质的Αβ沉积。（C)在接受了iv注射 R3VQ-S-AF488的PS2APP小鼠中，采用抗His mAb进行的淀粉样蛋白斑块的免疫组织化学染 色。在整个脑观察到由R3VQ的淀粉样蛋白斑块的免疫染色。（D)PS2APP小鼠中i v 10mg/kg和 iv 50mg/kg的R3VQ-S-AF488之间淀粉样蛋白斑块的免疫染色的比较，显示对IHC信号的剂 量依赖效应。
[0241] 图17显示使用双光子显微镜的R3VE体内成像:碱性pi对于VHH穿过BBB是关键的。 (A)R3VQ和R3VE化合物的IEF分析。对于VHH和缀合物而言，R3VE都比R3VQ碱性弱(对于R3VE-S-AF488而言，pi在7.5左右）。（B)相较于接受R3VQ-S-AF488的小鼠，只在接受静脉注射剂量 l〇mg/kg的R3VE-S-AF488的小鼠中观察到脑淀粉样蛋白血管病。（C)在iv注射有R3VQ-S-AF488 10mg/kg和R3VE-S-AF488 10mg/Kg的小鼠中，采用抗His mAb的组织学染色的比较。
[0242] 图18显示在2岁的PS2APP小鼠中iv注射mAb 4G8-AF488(10mg/Kg)之后脑的体内成 像。仅在血管中观察到mAb 4G8的存在。血管外信号是人为的，因为在参考通道中也观察到 了（红色）。
【具体实施方式】
[0243] 实施例1:产生偶联至钆造影剂的抗-AI3VHH及其体外/体内评价
[0244] 材料和方法
[0245] 1. VHH R3VQ的生产、选择和纯化
[0246] 抗原的制备以及在羊驼内体液免疫反应的诱导
[0247] AM2肽(AM2)(lmg Bachem)溶解在900yL H20中并涡旋。添加 100yL PBS 10X，在 使用之前将混合物在室温孵育一个月。250yL混合物和250yL弗氏完全佐剂混合用于首次免 疫，和250yL弗氏不完全佐剂用于随后的免疫。一只年轻的成年雄性羊盤(Lama pacos)在第 0、21和35天用250yg免疫原进行免疫。在第50天，取血清样本，通过ELISA使用AM2作为抗原 监测免疫反应。
[0248] 文库构建与筛选
[0249] 在第50天收集250ml免疫动物的血液，通过在Ficoll(Pharmacia)不连续梯度上离 心来分离外周血淋巴细胞，并保存于-80°C直至进一步使用。按照之前在Lafaye P.等人 (1995，Res Immunol ·，146 : 373-382)中描述的获得总RNA和cDNA，并且使用CH2F0RTA4和 VHBACKA6引物通过PCR扩增编码VHH结构域的DNA片段，所述引物分别退火至VH基因的3'和 5'侧翼区域。使用特异于长铰链同二聚抗体的引物VHBACKA4和VHF0R36或者引物VHBACKA4 和GGACTAGTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3' ) (SEQ ID N0.13)，扩增的产 物用作第二轮PCR的模板。引物互补于扩增产物的5'和3'端，以及在VHH基因的末端并入 Sfil和Notl限制性位点。消化PCR产物并连接至噬菌体表达载体pHENl。获得的文库包含两 个子文库，一个源自没有铰链的VHH DNA编码基因，另一个来自长铰链抗体基因。使用两个 子文库生产和分离菌体，并随后合并。
[0250] 按照先前描述的（Lafaye P.等人，2009，Mol Immunol · 46:695-704)，平行地用生 物素化的Αβ1-42、Αβ1_40或者Αβ1-16肽针对反应性进行文库筛选。通过与各生物素化的肽 在37 °C下轻微搅动孵育1小时、然后在37 °C下用链霉亲和素珠和混合物孵育15 '，进行文库 (1013转导单位)筛选。在三轮筛选中的每一轮分别使用不同的阻断剂:2%脱脂乳、1:4稀释 的Licor、以及4%BSA。在每轮筛选降低所用的生物素化肽的浓度，分别用100nM、50nM和 1〇ηΜ。使用HRP/抗M13单克隆抗体缀合物(GE Healthcare)通过标准的ELISA程序筛选噬菌 体克隆用于检测(见下面）。
[0251] VHH 表达
[0252] 使用Ncol和Notl限制性位点，在载体pHENl中所选纳米抗体的编码序列亚克隆至 含有6-组氨酸标签的修饰细菌表达载体pET23。用IPTG(0.5mM)在16°C过夜诱导后，转化的 大肠杆菌BL21(DE3)LysS细胞在细胞质中表达VHH。根据制造商的说明，通过MAC从细胞质 提取物使用带有Ni 2 +的HiTrap粗提柱（GE Healthcare)分离纯化的VHH，随后是配有 Superdex 75柱的尺寸排阻色谱（GE Healthcare)。在50mM磷酸钠缓冲液、300mM NaCl和 500mM咪唑缓冲液中洗脱VHH(特别是R3VQ(Hi s) -NH2;化合物1，在图9中）。
[0253] 2.VHH R3VQ生化性质的描述
[0254] 免疫印迹
[0255] AM2肽重悬于含有8M尿素的NuPAGESLDS样本缓冲液（Invitrogen)中。用NuPAGE Novex 4-12%Bis-tris凝胶（Invitrogen)通过聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)分离之后，半干 转移到Hybond-C(Amersham)上，使用Xcel 1 II 印记模块（Invi trogen)进行 Western印记。免 疫化学反应之前，在4%脱脂乳溶液中封闭膜。用VHH进行膜的免疫印迹，用兔抗His标签 (eBioscience)多克隆抗体随后是过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白（Abeam)显色。最 后，使用化学发光试剂盒(GE Hea 1 thcare)对过氧化物酶活性进行可视化。
[0256] ELISA
[0257] 在4°C通过用稀释于PBS中的lμg/ml生物素化的Α-β40或者A-M2(优选地Α-β40)孵 育过夜，来包被链霉亲和素包被的微滴定板(Thermo Scientific，丹麦）。用roS中的0.1 % Tween 20缓冲液洗板。VHH R3VQ稀释于roS中的缓冲液0.5%明胶0.1%Tween 20。37°(：孵育 2h之后，分别在添加兔抗His标签多克隆抗体(eBiosciences)以及随后的过氧化物酶标记 的羊抗兔免疫球蛋白（Abeam)之前再次洗板，最后根据制造商规程用0PD(〇-邻苯二胺盐酸 盐，Dako)显色。
[0258] 通过ELISA确定解离常数
[0259] 按照之前描述的（Friguet B.等人，1985，Immunol Methods，77:305-19)，确定VHH 的结合亲和性。简言之，在4°C在溶液中，将各种浓度的Αβ肽(Αβ片段l-16、10-20、15-25、22-35和29-40)和已知量的VHH过夜孵育，直至到达平衡。通过初始ELISA校准确定所用VHH浓 度。各混合物（1〇〇μ1)转移至之前包被有抗原的微滴定板的孔，在4°C孵育20分钟。用PBS中 0.1 %Tween20的缓冲液洗板，通过添加 β-半乳糖苷酶-缀合的羊抗兔Ig(Biosys，Compig gne，法国）和4-甲基伞形酮(methylumbelliferyl)a-D半乳糖苷(Sigma)检测结合的VHH。在 355nm激发之后，在460nm读取焚光(Fluoroskan，Labsystem，芬兰）。通过回归曲线的斜率估 计KD，其中回归曲线是通过结合抗体的分数倒数相对于抗原摩尔浓度的倒数作图而获得 的。
[0260] 序列分析
[0261] 通过GATC Biotech测序VHH的编码DNA，用DNA strider处理序列。
[0262]确定 pi
[0263] 通过等电聚焦使用IEF 2-9凝胶(Invitrogen)确定VHH的pi。使用在正极施加样品 的NEPGHE(非平衡pH梯度凝胶电泳），因为其允许在包括pH 8.5至10.5的碱性凝胶范围进行 最佳蛋白分析。规程详见SERVAGel IEF 3-10说明手册。
[0264] 3.VHH R3VQ偶联至MRI造影剂以及合成造影剂的MRI性质的描述
[0265] 用1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(D0TA)(螯合剂)将VHH R3VQ缀合 至钆(MRI造影剂）。采用基于非位点特异性和位点特异性偶联的两个策略：
[0266] -第一策略包括步骤：（i)将螯合剂D0TA缀合至VHH(R3VQ_NH2 1)的赖氨酸残基，和 (ii)随后与MRI造影剂即钆(Gd)进行螯合（参见图9A)。如反相高效液相色谱/质谱（RP-HPLC/MS)所示，其产生缀合物R3VQ-N-(D0TA/Gd) n 2的复合多分散混合物，其中Gd和Gd:VHH 化学计量范围的分布随机。通过改变D0TA缀合步骤的条件，用不同的DOTA/Gd密度制备多种 缀合物（总产率60-67 % )。通过IHC和MRI进行体内评价时，在脑室内注射之后R3VQ-N-(DOTA/GcOJ^合物能够识别小鼠中的淀粉样蛋白斑块。
[0267] -第二策略采用位点特异性方法，其涉及用马来酰亚胺化合物标记VHH R3VQ(参见 图9B)。Cys-工程化的R3VQ(R3VQ-SH 3)从N至C端含有6-组氨酸标签、凝血酶切位点、R3VQ VHH序列随后是G3S间隔序列和三个额外的氨基酸CSA，Cys-工程化的R3VQ(R3VQ-SH 3)克隆 至载体PET23,从而允许高水平的表达。通过SDS-PAGE和RP-HPLC/MS显示单结构域产物纯化 至同质(homogene i ty)。R3VQ-SH的pI值在8 · 5-9的范围。使用9-荷甲氧羰基(Fmoc)化学通过 固相肽合成来制备马来酰亚胺_(D0TA/Gd)3化合物4。当通过硫代加成缀合至马来酰亚胺-(D0TA/Gd) 3化合物，RP-HPLC/MS显示R3VQ-SH完全转化成明确的化合物R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3 5,其中产率是70%。相较于未标记的R3VQ-SH之一，R3VQ-S-(D0TA/Gd)3的pi略降低。在竞争 性抑制实验中，确定R3VQ-SH和R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3的结合特性，实验涉及结合至ELISA板的 ΑΜ0和可溶的ΑΜ0。对于R3VQ-SH和R3VQ-S- (D0TA/Gd) 3给出50 %结合抑制的Αβ浓度计算得 lμg/ml，表明添加 D0TA/Gd不影响VHH结合特性。此外，根据转基因 B6PS2APP小鼠中VHH-特异 性免疫反应性的分布，抗原修复(retrieval)预处理之后R3VQ-SH在小鼠石蜡切片中显示良 好的免疫检测Αβ斑块的能力。
[0268] 3.1常规合成方法
[0269] 除非另有指明，氨基酸衍生物和试剂分别购自Novabiochem和Sigma-Aldrich。用 6N HC1在110°C水解化合物20小时之后，通过定量氨基酸分析(AAA)使用Beckman 6300分析 仪确定肽和VHH溶液(净蛋白含量）的浓度。在连接有UV检测器2487 (220nm)和Q-Tofmicro? 光谱仪(Micromass)且带有电喷雾离子(正模式)源(Waters)的Alliance 2695系统上进行 RP-HPLC/MS分析。在自动上样器上样本冷却至4°C。用乙腈+0.025%甲酸(A)/水+0.04%TFA +0.05%甲酸(B)进行线性梯度，持续10或者20min。所用的柱是XBridge? BH1300C18(3.5y 111，2.11100111111)(1&七6^)(梯度10-100%厶）。源温度维持在120°(：，去溶剂化温度为400°(：。锥 电压是40V。在添加有Β的各自缓冲液中以0.4-lmg/ml的浓度注射样本。预期的Mr值对应着Ν 端缺失Met和一个二硫键的蛋白平均质量。在相同光谱仪上以正模式通过直接注入(源温度 和去溶剂化温度分别维持在80 °C和250 °C )来记录Mr分析。以5μΜ的浓度，样本溶解在含 0.1%甲酸的水/乙腈（1/1)中。使用带有UV检测器的Agilent 1200栗系统在220nm分析4的 纯度。所用的柱是Kromasil C18(l〇〇 人，5以111，4.6125〇111111)(411')，用乙腈(￥11〇(〇/水+0.1% TFA(VWR) (D)进行梯度 20min。
[0270] 3.2.非位点特异性方法
[0271] 指明相对于反应基团的所有试剂的摩尔当量(5NH2每R3VQ和平均1的D0TA/R3VQ缀 合物）。总产率(参见下表2)包括从亲和柱洗脱缓冲液中的蛋白1开始的所有合成步骤。通过 终产物2a_f的实际量除以预期的量(净蛋白含量)来计算它们。
[0272] 洗脱自亲和柱的R3VQ(His)-NH2 VHH 1在含有300mM NaCl的PBS缓冲液（PBS/ NaCl)中透析。溶于roS/NaCl (120μ1)中的1，4，7，10-四氮杂十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯）（DOTA-NHS) (274yg，相对于氨基而言4eq)添加至1 (480μ1，0.60mg/ml)， 在室温搅拌溶液。每15min取得等份（10μ1)，用100mM Tris缓冲液pH 7.3(90μ1)稀释，通过 HPLC/MS分析来监测反应进程。3h之后，溶液冷却至4°C，使用Vivaspin 500离心过滤装置 (3,000MWC0 PES)(Sartorius)，将缓冲液交换为0.4M乙酸Na缓冲液pH 5。在相同缓冲液(5μ 1)中的GdCl3(149yg，相对于平均D0TA基团而言45eq)添加至获得的D0TA-VHH缀合物(480μ 1)。在室温搅拌溶液2.5小时。采用上述相同的Vivaspin装置，在4°C将缓冲液交换为PBS/ NaCl，浓缩溶液以提供R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)〇-2缀合物2f (105μ1，1 · 48mg/ml)。总产率是 67%〇
[0273] 使用相同规程获得缀合物2e，除了D0TA-NHS是分批（portionwise)添加至1以外 (每45min 0.5eq，相对于氨基而言总共5.5eq)。在室温搅拌溶液8hl5。总产率是60%。
[0274] R3VQ(His)-NH2 1
[0275] AAA：Ala 15.8(16),Arg 9.1(9),Asp+Asn 13.4(13),Glu+Gln 16.0(15),Gly 13.4(14),His 5.7(7),lie 3.1(3),Leu 8.4(8),Lys 4.1(4),Phe 4(4),Pro 6.1(7),Ser 11.3(13),Thr 10.0(ll),Tyr 4.8(5),Val 11.1(11).
[0276] MS： 15753.0996(C681H1053N209O216S4 calcd 15752.3949)
[0277] R3VQ(His)-N-(DOTA/Gd)o-2 2f
[0278] AAA:Ala 16.0(16)，Arg 10.0(9)，Asp+Asn 12.8(13)，Glu+Gln 15.0(15)，Gly 13.8(14),His 6.7(7),lie 3.0(3),Leu 8.2(8),Lys 4.5(4),Phe 4(4),Pro 8.5(7),Ser 10.5(13),Thr 10.1(ll),Tyr 4.8(5),Val 11.1(11).
[0279] MS:16293.1328((DOTA/Gd)i:C697Hi〇76N2i3〇223S4Gd calcd 16293.0263)
[0280] 16833.5586((DOTA/Gd)2：C7i3Hi〇99N2i7〇23〇S4Gd2 calcd 16833.6576)
[0281] 3.3位点特异性方法
[0282] R3VQ-SH 3的生产
[0283] 用Ncol和Xhol限制性位点，将Cys的工程化VHH(R3VQ_SH 3)编码序列克隆至修饰 细菌表达载体PET23。用IPTG(0.5mM)在16°C过夜诱导后，转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS 细胞在细胞质中表达3。根据制造商的说明，通过IMAC从细胞质提取物使用带有Ni2 +的 HiTrap粗提柱(GE Healthcare)分离纯化的VHH。在含有500mM咪唑的roS/NaCl缓冲液中洗 脱3。
[0284] AAA：Ala 16.1(16),Arg 10.2(10),Asp+Asn 13.6(13),Glu+Gln 11.9(ll),Gly 19.1(20),His 6.0(7),lie 3.1(3),Leu 8.5(8),Lys 2.2(2),Phe 4(4),Pro 4.3(4),Ser 15.5(18),Thr 9.5(10),Tyr 4.8(5),Val 12.9(12).
[0285] MS： 15723.4268(C671H1041N213O217S5 calcd 15724.2820).
[0286] 马来酰亚胺_(D0TA/Gd)3 4的合成
[0287]在固相上，分步从?111〇(3-617-￥31^树脂进行4的合成（14311^，0.0931]1111〇1)。使用2-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)(分别1.06和2.9eq)/二 异丙基乙胺（DIEA)(分别2.2和6eq)作为偶联剂，以及二甲基甲酰胺（DMF) (Applied Biosystems)作为溶剂，人工并入构建块1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三-叔丁基-乙 酸-1〇-0-〇-卩111〇。4-￡-乙酰胺-1-赖氨酸）[卩1110。-1^8(00丁厶（(^811)3))-011](1.169) (]\^(：1'〇〇5^1;^8)和6-马来酰亚胺己酸（369)。用0]\0 7中的01(](369)并入?1]1〇(3-617-0!1(369)。 通过Kaiser测试(E.Kaiser等人（1980)Anal ·Biochem. 34,595-598)监测用Lys、Gly和马来 酰亚胺衍生物进行的偶联步骤，分别在3h、2h和lh内完成。用DMF中的20%哌啶除去Fmoc保 护。第三赖氨酸衍生物之后，最后和6-马来酰亚胺己酸的偶联在四分之三的产物 (0.07mmol)上进行。在4°C肽-树脂悬浮于10ml TFA(Applied 13;[085^丨61118)/水/三异丙基娃 烷(95/2.5/2.5v/v/v)中，在RT搅拌4h。树脂过滤后，浓缩溶液，用二乙醚沉淀粗产物。离心 之后，沉淀物溶于水，冻干至119mg粗D0TA-肽的产率，这是通过NMR、MS和RP-HPLC(梯度10-40 % C，保留时间9.2min)分析的。
[0288] 咕匪1?(〇2〇):36.69(8,2!1，01]\^11)，4.18(111，2!1，20^)，4.08(111，1!1，0^)，3.87-3.78(m，6H，CH 2 Gly)，3.74-3.48(b，24H，CH2C0 D0TA)，3.34(t，2H，CH2 6-Mal，J5,6 = 0， 017Hz)，3.30-2.99(b，48H，CH2CH2N D0TA)，3.06(b，6H，CH2e)，2.14(m，2H，CH2 2-Mal)，1.74-1 · 53(m，6H，CH2fs)，1.49-1 · 34(m，10H，CH2s，CH2 3-Mal，CH2 5-Mal)，1 · 29-1 · 18(m，6H，CH2Y)， 1.16-1.06(m，2H，CH2 4-Mal).
[0289] 13C 匪R(D2〇)Jl77.11(lC，⑶NH Mal)，175.15，174.63，174.36(3C，TOLys)， 173.26(2C，C0 Mal)，172.93(lC，C00H Gly)，171.48，171.21(2C，C0 Gly)，163.04-162.68 (4C，C0NH D0TA)，134.22(2C，CH Mal)，120.59，117.69，114.79，111.90(TFA)，55.20-53.10 (12C，CH2raD0TA)，54.04,53.80,53.47(3C，CH a)，52.20-46.80(24C，CH2CH2ND0TA)， 42.38,41.00(3C，CH2 Gly)，39.10(3C，CH2e)，37.37(lC，CH2 6-Mal)，35.04(lC，CH2 2-Mal)， 30 · 48，30 · 24，30 · 23 (3C，CH2f!)，27 · 67，27 · 33，24 · 67 (3C，CH2 3-Mal，CH2 5-Mal，CH2s)，25 · 43 (1C，CH2 4-Mal)，22.43,22.33,22.15(3C，CH2Y)·
[0290] MS: [M+H] + 1925 · 9888，[M+K] + 1963 · 9391 (C82Hi36N22〇3i calcd[M+H] + 1927 · 1195，[M+ K]+1965.2098).
[0291] D0TA-肽中间体（99mg)溶于0.4M乙酸Na缓冲液pH 5(41ml)，添加 Gd(0Ac)3.xH20 (123mg，相对于DOTA而言2eq)。在95 °C搅拌25min之后，冷却溶液并加载至C18反相柱(2g，直 径1.5cm)。用4体积的水洗柱，用三体积的水/乙腈1/1洗脱产物，冻干后获得79mg产物。通过 反相快速色谱（30x200mm)纯化粗D0TA/Gd肽，使用梯度为乙腈+0.1%TFA/缓冲液D持续 40min，从5/95至35/65 (20ml/min，保留时间18min)。主馏分冻干后，获得6lmg的4，总产率 44% (总产率包括所有合成步骤，在基于加载在树脂上的第一Gly残基分离的产物4的净肽 含量上进行计算）。通过MS和RP-HPLC(梯度5-35%C，保留时间12.2min，纯度>90%)分析4。
[0292] MS:2388.8889(C82Hi27N22〇3iGd3 calcd 2388.7901)。
[0293] R3VQ-S-(D0TA/Gd)3 5的合成
[0294] 洗脱自亲和柱的R3VQ-SH VHH 3在含有300mM NaCl的roS缓冲液(PBS/NaCl)中透 析。在水溶液（135μ1)中的4(1.35mg，相对于每VHH的1巯基而言3eq)添加至3(1.5ml，roS/ NaCl pH 6.8中2mg/ml)，溶液在4°C搅拌3h。然后，使用Vivaspin 2000离心过滤装置（3， 000MW⑶PES)(Sartorius)渗透溶液。用缓冲液Β(20μ1)稀释3和5的等份（20μ1)用于RP-HPLC/MS分析。此外，3和5的等份（10μ1)稀释于100mM Tris缓冲液pH 7.3(90μ1)用于ELISA 分析。以70%的产率获得lml的5(2.36mg/ml)。通过终产物5的实际量除以其预期的量(净蛋 白含量)来计算。
[0295] 还在亲和柱洗脱缓冲液(含有500mM咪唑的PBS/NaCl)中直接进行相同反应，得到 83%的总产率。因此，当缀合物直接在亲和柱洗脱缓冲液(PBS/NaCl/咪唑）中进行时，改善 用于获得R3VQ/Gd缀合物的过程：i)步数降低至2,以及ii)总产率提高直至83%。这种过程 改善还用另一 VHH进行了验证(数据未显示）。
[0296] AAA:Ala 14.9(16),Arg 10.2(10),Asp+Asn 12.2(13),Glu+Gln ll.l(ll),Gly 24.6(23),His*(7),lie 3.1(3),Leu 8.5(8),Lys 11.7*(5),Phe 4(4),Pro 4.8(4),Ser 14.9(18)，Thr 9.1(10)，Tyr 5.0(5)，Val 12.6(12)。[*不能确定His，因为和铵共洗脱。因 为在分析条件下和马来酰亚胺衍生物共洗脱，而高估了 Lys]。
[0297] MS：18113.7383(C753Hii68N235〇248S5Gd3 calcd 18113.0720) 〇
[0298] SDS-PAGE 电泳
[0299] 使用NuPAGE Novex 4-12%Bis_Tris凝胶（Invitrogen)根据制造商说明进行聚丙 烯酰氨凝胶电泳(PAGE)。
[0300] pi的确定
[0301 ] 通过等电聚焦使用IEF 2-9凝胶(Invitrogen)确定VHH的pi。使用在正极施用样品 的NEPGHE(非平衡pH梯度凝胶电泳），因为其允许在包括pH 8.5至10.5的碱性凝胶范围进行 最佳蛋白分析。规程详见SERVAGel IEF 3-10说明手册。
[0302] ELISA
[0303] 在4 °C通过用稀释于PBS中的lμg/ml生物素化的Α-β40或者A-M2 (优选地Α-β40)孵 育过夜，来包被链霉亲和素包被的微滴定板(Thermo Scientific，丹麦）。用roS中的0.1 % Tween 20缓冲液洗板。对于非位点特异性策略，R3VQ-NH2 URSVQ-rHDOTA/Gdh-2 2e稀释 于0.5%明胶0.1 %Tween 20的PBS缓冲液中。37°C孵育2h之后，分别在添加兔抗His标签多 克隆抗体(eBiosciences)以及随后的过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白（Abeam)之前再 次洗板，最后根据制造商规程用〇PD(o_邻苯二胺盐酸盐，Dako)显色。对于位点特异性策略， R3VQ-SH 3和R3VQ-S-(D0TA/Gd)3 5稀释于前述相同的缓冲液中，和生物素化Α-Μ0或者Α-β 42(优选地Α-Μ0)孵育之后，加入单克隆抗His标签抗体(H1029-Sigma)，随后是过氧化物酶 标记的羊抗鼠抗体(ab97265-Abcam)，以及通过相同底物显色。
[0304] 亲和性确定
[0305] 通过测量能够对固定化的Α-Μ0或者A-M2 (优选地Α-Μ0)识别给出50 %抑制的可 溶A-M0或者Α-β42(优选地A-M0)肽的量，来确定3和5的结合性质。简言之，在4°C，将各种 浓度的Α-Μ0或者A-M2(优选地Α-Μ0)和确定量的3或5过夜孵育，直至到达平衡。通过初始 ELISA校准推定所用VHH的浓度。各混合物（100μ1)转移至之前包被有抗原的微滴定板的孔， 在4°C孵育15分钟。用含有0.1%Tween 20的PBS洗板后，通过添加抗His mAb(H1029-Sigma) 随后是β-半乳糖苷酶羊抗鼠 Ig和4-甲基伞形酮β-D半乳糖苷检测未结合的VHH。在355nm激 发之后，在460nm读取焚光(Fluoroskan，Labsystem，芬兰）。
[0306] 免疫组织化学
[0307] 在石蜡冠状脑切片（5微米厚)上进行免疫组织化学，所述切片获自淀粉样变性的 转基因小鼠模型(PS2APP小鼠）。用薄片切片机(Microm HM340E)制备切片。在二甲苯中对切 片脱石蜡(5分钟，3次），通过乙醇（100% X2,90和70% ;5分钟/步)再水化和接触水。然后， 用98 %甲酸预处理5分钟，最后浸在水中5分钟。用3 %过氧化氢和20 %甲醇中和内源的过氧 化物酶，以及用TBS-0.5%tween pH8 BSA 2%对非特异性结合位点封闭30min。在下面的步 骤中，步骤之间将切片用TBS-tween漂洗3次，5min/次。然后，切片和稀释于TBS-tween中2μ g/ml的一抗R3VQ-SH在4°C孵育过夜。然后，在室温用小鼠单克隆抗His标签抗体(Η1029-Sigma)处理切片2小时，最后根据制造商规程用Dako REALTM系统Peroxidase/DAB试剂盒 (Glostrup，丹麦）显色。水洗后，用Harri s苏木精复染切片，并在水中再漂洗。封片 (mounted)之前，在分级的乙醇溶液中（70、90和100%)进行切片脱水，在二甲苯中清洗。 [0308] 3.4合成造影剂的MRI性质
[0309] 在配有运行控制台（console running)VnmrJ 2.3界面的7T-光谱仪（Agilent， USA)上评价造影剂的MRI性质。光谱仪配有700mT/m的嗤齿动物梯度插件(rodent gradient insert)。鸟笼式正交线圈（直径：23mm)用于发射和接收。对于浓度0.2、0.15、0.1、0.05、 0.025、0.01和0臟〇1/1而言，根据1?1(8卩1/1'1)和1?2(8卩1/^2)作为造影剂浓度的函数的线性 拟合，通过用如下等式来确定纵和横向弛豫rl和r2 (每单位浓度试剂的弛豫速率的变化，表 示作为1即造影剂的"有效性"）：1?1(〇=1?1(0)+^1(：，其中1?1(〇是含有浓度(：的造影剂的 管中的Rl，R1 (0)是没有造影剂的管中的R1，以及C是造影剂的浓度。R2(C) = R2(0) +r2x C用 于计算r2。在血细胞比容管中进行样本成像。
[0310] T1计算基于七个连续的2D多-片旋转回声图像，其中采用了二十个TR值（TR = 0·021、0·04、0·06、0·08、0·1、0·15、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1、1·5、2、3、4、 5sec)，TE = 14ms，Nex = 4，F0V = 10xl0mm2，Mtx = 64x64，1切片，切片的厚度= 3mm，带宽= 50kHz)。根据指数回归曲线(S=l-exp(-TR/Tl))计算驰豫时间的参数图谱，其中S是信号强 度，TR是重复时间和T1是纵向的驰豫时间（ImageJ，MRI分析计算器，Karl Schmidt)。
[0311 ]通过使用 16个回声时间（TE = 10至160msec); TR = 3300ms ;Nex = 2;带宽=100kHz， F0V= 10xl0mm2，Mtx = 64x64,1切片，切片厚度= 3mm，T2计算基于2D多-回声多-切片旋转回 声图像。根据指数回归曲线（S = exp(-TE/T2))计算驰豫时间的参数图谱，其中S是信号强 度，TE是回声时间和T2是纵向的驰豫时间（ImageJ，MRI分析计算器，Karl Schmidt)。
[0312] 4.通过免疫组织化学、生物化学和体外MRI体外描述VHH R3VQ和VHH R3VQ缀合物
[0313] 受试者
[0314] 来自AD患者(Braak V和VI期）的人皮质脑组织获自NeuroCEB脑库。该库和脑捐献 计划有关，由患者协会财团（consortium of patients associations)(包括法国阿尔茨海 默氏病协会)运行，并根据法国法律的要求由研究和大学部(Ministry of Research and Universities)宣布。根据法国生物伦理法，对脑捐献获得明确的书面同意。
[0315] 在B6TgPS2APP(Richards J.G.，2003，J Neurosci.,23:8989-9003)和APP/PSldE9 (Garcia-Alloza M.，2006，Neurobiol Dis.，24:516-24)转基因小鼠上进行临床前实验。严 格按照EEC(86/609/EEC)和法国国立委员会(法令87/848)针对实验动物护理和使用的推荐 进行动物实验规程。使用高剂量戊巴比妥钠（l〇〇mg/kg)处死动物，然后用10%缓冲的福尔 马林灌注固定。而后，摘除其脑，浸入福尔马林至少24小时，并储存在4°C。
[0316] 组织提取物
[0317] 根据Gong，Y.等人（2003，Proc Natl Acad Sci U S A，100:10417-10422)进行组 织提取。在20体积无酚红的他111'8?12介质(6丨1^〇)或含有蛋白酶抑制剂(20(^8/1111?10^、2 μg/ml胃酶抑素 A，4μg/ml亮抑酶肽、30μg/ml苄脒盐酸盐）的缓冲液A(PBS，pH 7.4、0.32M蔗 糖、50mM Hepes、25mM MgC12、0.5mM DTT)中匀浆来自AD脑的额皮质（0.2g)，以 100,000x g 离心1 h。沉淀在10体积的无酸红的Ham ' s F12介质中或缓冲液A加蛋白酶抑制剂中再勾楽；， 并再离心。确定组合上清的蛋白浓度。然后，使用Centr icon-10浓缩仪将蛋白的等份浓缩至 60μ1或更小的体积。
[0318] 免疫印迹
[0319] 脑提取物或者A-M2肽重悬于含有8Μ尿素的NuPA (i E K L D S样本缓冲液 (Invitrogen)中。用NuPAGE Novex 4-12%13丨8-1：1^8凝胶（111￥；[1：1'08611)通过聚丙稀酰胺凝 胶电泳（PAGE)分离之后，半干转移到Hybond-C(Amersham)上，使用Xcell II印记模块 (Invitrogen)进行Western印记。免疫化学反应之前，在4%脱脂乳溶液中封闭膜。用\^!1进 行膜的免疫印迹，用兔抗His标签(eBioscience)多克隆抗体随后是过氧化物酶标记的羊抗 兔免疫球蛋白（Abeam)显色。最后，使用化学发光试剂盒(GE Healthcare)对过氧化物酶活 性进行可视化。
[0320] 免疫组织化学
[0321 ]在固定的组织（石蜡包埋的或者冷冻切片）上、或者在未固定的新鲜组织(冷冻切 片)上进行免疫组织化学。采用标准IHC规程并根据各组织条件进行调整。因为大多免疫染 色实验是使用石蜡切片进行的，此处给出石蜡包埋材料的详细规程。脑组织的免疫染色在4 Μ厚的石錯切片上进行。使用人和小鼠组织（人AD患者，TauPS2APP小鼠 [Grueninger F.等 人，2010，Neurobiol Dis.，37 :294-306]和PS2APP转基因小鼠[Richards，J.G.，等人2003， Journal of neuroscience 23,8989_9003])。二甲苯中对切片进行脱石錯，通过乙醇 (100 %，90 %和70 % )进行再水化，各个溶液5min，最后带至流动的自来水中进行10min。然 后，在98%甲酸中孵育5分钟，在流动的自来水下再次洗涤，对于内源的过氧化物酶采用3% 过氧化氢和20 %甲醇进行淬灭，最后在水中洗涤。在TBS+0.5 % tween中2 %牛血清白蛋白中 对切片孵育30min来封闭非特异性结合。然后应用适当稀释的一抗(5-10μg/ml的VHH His或 者Strep标签），在室温在潮湿室中过夜孵育切片。用TBS-Tween洗涤切片，并在室温与TBS-Tween中的1/1000二抗兔抗His标签或者自制的生物素化抗strep mAb C23-21孵育1小时。 然后，根据制造商说明用Dako REALTM检测系统Peroxidase/DAB的试剂进行切片的孵育。进 行发色(DAB)显示，直至获得良好信噪比（大约5min)。用TBS-Tween洗涤后，切片用苏木精复 染。为了标记斑块，将生物素化的4G8(Wisniewski T等人，1996，B.Biochem J.，313:575-80)mAb( 1/10000)或 6F/3D(Akiyama H.等人，1996，Neurosci let.，206 :169-72)mAb(l/ 200)用作平行的阳性对照。
[0322] 体外 MRI
[0323] 在B6TgPS2APP(Richards J.G.，2003，J Neurosci.,23:8989-9003)和APP/PSldE9 (Garcia-Alloza M.，2006，Neurobiol Dis.，24:516_24)转基因小鼠 （n = 2,雌性）的脑上进 行MRI。在配有运行控制台VnmrJ 2.3界面的7T-光谱仪(Agi 1 ent，USA)上记录MRI。光谱仪配 有700mT/m的啮齿动物梯度插件。鸟笼式线圈（RapidBi〇med，GmbH，德国）和小鼠的脑表面线 圈(RapidBiomed GmbH，德国）分别用于发射和接收。
[0324] 膜在Triton 0.2%的roS溶液中透化4小时后，脑样本和待测试造影剂浸在磷酸盐 缓冲液(PBS)溶液中，成像之前在4°C储存至少24小时。针对扫描，脑置于装有Fluoriner， (3M，Cergy-Pontoise，法国）的紧闭塑料管中，其中Fluorinert?是一种提供MR图像黑色背景 的基于全氟碳化物的质子流体。
[0325] MR图像基于3D梯度-回声序列，其用于（FLASH)获取T2*w图像（TR = 40ms，TE = 15ms，FA = 20。，Bw = 50kHz，Nex = 16,矩阵= 512x512x128，F0V= 13x13x13mm2，对于 1 lh 39min的总Tacq而言产生25χ25χ100μπι3的分辨率）。
[0326] Gd染色方法:淀粉样蛋白斑块检测的金标准方法
[0327] 这种方法用于在体外过程之后产生MR图像上所见低信号点之间的共定位，其是一 种显示淀粉样蛋白斑块的金标准方法(Petiet A.等人，2012，Neurobiol Aging，33:1533-44)。简言之，体外实验之后，样本浸入1:200稀释的PBS和0.5MIL特酸葡甲胺的溶液(2.5mM) 中，在成像之前在4°C储存至少24小时。在和体外实验所用的相同条件下获得MR图像。
[0328] 5.VHH R3VQ和VHH R3VQ缀合物的体内评价
[0329] 受试者
[0330] 在之前描述的授权之下，VHH R3VQ和VHH R3VQ缀合物的体内评价在TauPS2APP (Grueninger F.等人，2010，Neurobiol Dis.，37:294_306)转基因小鼠上进行。
[0331] VHH的体内立体定位注射
[0332] 采用每注射2μ1的VHH以0.5μ1/π?η的速率，在TauPS2APP(n = 2雌性)转基因麻醉小 鼠上进行立体定位注射。用异氟烷（1-2%)和空气（lL/min)混合物麻醉小鼠。将其置于立体 定位框架中，用Dremel头颜双侧穿孔。Blunt Hamilton注射器用于注射MR造影剂。各个小鼠 在各半球额皮质和海马中接收4次注射。额皮质的立体定位坐标是距离前囱前+0.86mm，距 离中线横向±1.5mm，距离硬脑膜垂直-0.65mm。海马中的立体定位坐标是距离前囱后-2.18mm，距离中线横向± 1 · 5mm，距离硬脑膜垂直-1.8mm。注射后的2或24小时，麻醉小鼠，心 脏内灌注PBS中的4%多聚甲醛(pH 7.6)。摘除脑，然后按照相同的固定方式(fixative)在4 °C进行过夜固定。制备4μπι厚的石蜡切片。使用上述标准的免疫组织化学方法的任一检测脑 组织中VHH的存在。
[0333] 淀粉样变性小鼠模型中VHH的颈动脉内灌注
[0334] 在麻醉的TauPS2APP小鼠 （η = 2，雌性）中进行颈动脉内的VHH施用。通过腹腔内一 次性注射盐酸氯胺酮（Imalgen，1/10稀释的溶液50μ1)和二甲苯(Rompun，1/40稀释的溶液 50μ1)的混合物来进行麻醉。暴露颈总动脉，并用细的硅胶管（PP25_100FT;P 〇rteX， Ashford，UK)进行插管。使用懦动栗（型号PHD 2000;Harvard Apparatus，Boston，MA，USA) 以恒定的速率将VHH输注至颈动脉中。
[0335] 侧尾静脉(lateral tail vein)注身才
[0336] 将小鼠放在适当的倒扣烧杯中，留有孔以供尾穿出。注射前保温动物，尾浸入温水 以便引起静脉的血管舒张。在动物尾静脉中插入导管(27G，Microflex，Vygon，法国）之后， 进行MR图像前的注射，以便确保造影剂的施用适当。溶于200μ1 PBS的2mg VHH、VHH R3VQ-D0TA或者VHH R3VQ-S-(D0TA/Gd)3注射至侧尾静脉。
[0337] 体内 MRI
[0338] 如前所述（参见体外MRI章节），在配有运行控制台VnmrJ 2.3界面的7T-光谱仪 (八8丨161^，1^4)上进行体内1?1。1?1试验期间，用异氟烷(0.75-1.5%)和卡波金(95%02-5 %⑶2)混合物麻醉动物，监测动物呼吸率。卡波金用于降低来自循环血液的信号(Thomas 等人，2003)。
[0339] 使用高分辨率3D-梯度回声序列记录MR图像（29*29*117μπι3，F0V: 15* 15* 15mm3，Mtx = 512*512*128，TR = 30ms，TE= 15ms，翻转角= 20°，Nex = l，带宽= 25kHz，获取时间：32min (Petiet，Α·等人，2012，Neurobiol Aging，33:1533-44) 〇
[0340] T1计算基于七个连续的2D多-切片旋转回声图像，其中采用了 5个TR值(TR = 0.4、 0·75、l·5、2·5和5s，TE=14ms，Nex = l，F0V = 25x25mm2，Mtx = 128xl28,6切片，切片的厚度 =1mm，带宽=50kHz)。根据指数回归曲线(S = 1 -exp (-TR/T1))计算驰豫时间的参数图谱， 其中S是信号强度，TR是重复时间和T1是纵向的驰豫时间（ImageJ，MRI分析计算器，Karl Schmidt)。根据脑的额部分中皮质区测量驰豫时间。
[0341] 离体 MRI
[0342] 体内脑室注射VHH-S-(DOTA/Gd)3(lyg/侧)6h之后，灌注小鼠 （PFA 4%)，进行离体 MR图像之前提取其脑。针对各步骤，通过使用等同的Gd溶液(即O.lmM)进行对照。
[0343] 结果
[0344] 1.特异性抗Af3 VHH的文库构建、和选择
[0345] 通过PCR扩增VHH，并克隆至载体pHENl。后续的转化产生约108克隆的文库。采用生 物素化的Αβ1-42、Αβ1_40或者Αβ1-16肽经过3次筛选循环，通过噬菌体展示选择显示最佳亲 和性的VHH。通过ELISA，从ΑΜ2筛选中测试了46个独立的克隆，从ΑΜ0中测试了 192个克隆 以及从如16中测试了192个克隆。从邠42^04〇和六016筛选中分别发现46/46、11〇/192和 163/192的阳性。测序这些阳性克隆，分别鉴定45、65和118VHH序列。最后，选择VHH的3个家 族(A7/B10、F12和R3VQ)(参见下表1)。分别对生物素化Αβ1-42、Αβ1-40或Αβ1-16进行筛选 后，A7/B10VHH发现了ll、64和117次。对生物素化Am-42和Am-40筛选后，VHHR3VE/Q分别 发现34和1次，而Αβ16筛选后VHH F12发现了 一次。
[0346] 这些VHH亚克隆至载体ρΕΤ23或者载体pASK ΙΒΑ2以便允许VHH分别和His-标签或 者Streptavidin-标签进行高水平表达。获得细菌培养物的l-2mg/l产率。通过SDS-PAGE显 示单结构域产物纯化至同质（数据未显示）；其pi值在8.5以上。随后用两种造影剂进行实 验。
[0347] R3VQ保存在4°C或者用甘油长期保存在_20°C。没有甘油时的冷冻不稳定。
[0348] DLS实验显示R3VQ在纯化之后是单聚体的并且不聚集。
[0349] 抗ΑβνΗΗ A7、B10、R3VE、R3VQ和F12的氨基酸序列比对显示在图10。
[0350] 2.VHH R3VQ识别淀粉样蛋白斑块
[0351] VHH R3VQ对Αβ和淀粉样蛋白损伤的免疫反应
[0352] 检验了人AD脑和转基因 TauPS2APP小鼠中VHH特异性免疫反应性的分布。抗原修复 预处理之后，R3VQ显示出良好的对人石蜡切片中Αβ斑块和脑淀粉样蛋白血管病(CAA)的免 疫检测能力（图1)。用野生型小鼠没有观察到标记。比较石蜡包埋的组织上的结果，显示在 自由活动式的振动切片机上，以及更重要的是在来自AD人脑和来自小鼠脑切片的新鲜组织 上而无需任何抗原恢复预处理，可以轻易实现用R3VQ进行的Αβ免疫检测(数据未显示）（图 2-3)。显著地，采用冷冻切片机上获得的自由活动式切片观察到强的背景信号和低的信/噪 比，对于R3VQ IHC排除了采用这种材料。对于VHH A7/B10和F12没有检测到淀粉样蛋白斑块 的免疫标记，不再用这些VHH进行实验。
[0353] 为了确认脑组织上VHH R3VQ的免疫反应性，在获自AD患者的脑提取物上进行 western-印记免疫分析。用VHH R3VQ免疫检测到四条主要的带，对应着40至55kDa的Αβ寡聚 物。平行地，用ΑΜ2肽，R3VQ识别6至17kDa的三条带，对应着单体、二聚体和三聚体(图4)。
[0354] R3VQ识别AM2的中间区域
[0355] 在采用AM2的抑制分析中，显示VHH R3VQ特异于纤维状的合成AM2肽。VHH R3VQ 的KD为17nM。为了进一步确定VHH R3VQ识别的表位，针对ΑΜ0和对应着不同Αβ片段的肽（1_ 16、10-20、15-25、22-35和29-40)确定了50%抑制（扣50)所需浓度。￥冊1?3￥0不识别片段1-16也不识别29-40。VHH R3VQ对Αβ?6-35的IC50是16ηΜ，表明VHH R3VQ识别位于ΑΜ2中央部 分的表位。使用Roche提供的Η4稳定克隆通过流式细胞术，R3VQ不识别ΑΡΡ(数据未显示）。
[0356] 立体定位注射之后，VHH R3VQ体内标记淀粉样蛋白斑块
[0357] 将2yg的VHH R3VQ立体定位注射至小鼠脑左半球的海马或皮质内（2只小鼠）。注射 后2h或者24h之后，处死动物，收集脑切片。观察到淀粉样蛋白斑块的免疫染色，表明VHH R3VQ在体内标记纤维状Αβ。此外，注意到皮质中的棕色圈，这表明VHH R3VQ扩散至脑组织 (图 5Α 和 5Β)。
[0358] VHH R3VQ体内穿过ΒΒΒ
[0359] 体内测试VHH R3VQ穿过ΒΒΒ的能力。通过左颈动脉注射4mg的VHH，持续60分钟。注 射后，在麻醉小鼠并灌注固定的1小时之前，允许将VHH输注至脑组织。在皮质、海马和丘脑 观察到淀粉样蛋白斑块的免疫染色。在注射的皮质对侧的右半球这种染色微弱。
[0360]实验显示未标记的R3VQ: 1)在缓慢的颈动脉输注之后能够穿过BBB，2)体内特异性 识别淀粉样蛋白斑块，以及3)对于MRI研究而言是良好的候选。
[0361] VHH R3VQ和已知VHH针对淀粉样蛋白β之间的比较
[0362] 下表1总结了通过用肽AM2、偶联至卵清蛋白的肽ΑβΙ-lO或者纤维状形式的AM2 免疫羊驼获得的VHH对淀粉样蛋白β的标记。除VHH R1.3、R1.5和R3.3通过核糖体展示进行 选择之外，通过菌体展示进行VHH的选择。
[0363] 產1:通过用肽AM2、偶联至卵清蛋白的肽ΑβΙ-lO或者纤维状形式的AM2免疫羊驼 获得的VHH对淀粉样蛋白β的标记。VHH 1^-3丄35、61-3、￥31-1公开在1^376?.等人，2009， Molecular Immunology，49:695-704中。通过以上公开的方法获得其它VHH。
[0364]
[0365]
[0366] 结果显示，在受试的27种VHH当中，只有VHH R3VE/Q能够标记淀粉样蛋白血管病和 淀粉样蛋白斑块，但是不标记淀粉样蛋白寡聚物。
[0367] 3.偶联至MRI造影剂的抗体 [0368] 非位点特异性方法:
[0369] 用NHS-激活的D0TA缀合至VHH赖氨酸残基。用Gd进行随后的螯合，从而在蛋白上产 生具有各种D〇TA/Gd比例的缀合物(表2)。通过HPLC/MS监测两个步骤，从而允许优化过程。 在室温几乎能够实现充分的螯合。
[0370] 由于没用甘油而在-20°C储存不稳定，两种起始缀合物(2a和b)没有显示Α?3结合活 性。通过改变实验条件，在0.5-lmg的规模制备了 4种新缀合物，回收良好(64-74%)。相较于 第二系列（2e和f)，第一系列（2c和d)具有更高的DOTA/Gd密度。相较于ELISA中原始VHH ΙΑβ 的识别，2c和2d的结合低（~10%)，而2e和2f的结合几乎不受影响（50至100%)。这种差异 可能是由于DOTA/Gd的整体密度更低和/或VHH的固有稳定性。
[0371] ^j_R3VQ (His)-N_( DOTA/Gd)缀合物的描述
[0372] COj/j」-仕至mm；仃汉胆。
[0374] b通过MS确定的。括号中是微量化合物。
[0375] 位点特异性方法:
[0376] 这种策略涉及用马来酰亚胺_(D0TA/Gd)3化合物4标记Cys-工程化的R3VQ VHH (R3VQ-SH 3)(SEQ ID N0 8)(参见图9B)。
[0377] D0TA表示为单酰半簇(moiety)。总产率表示在括号内。
[0378] 当通过硫代加成缀合4时，RP-HPLC/MS显示3完全转化成明确的化合物R3VQ-S-(D0TA/Gd)3 5,其中产率是79%。相较于未标记的R3VQ-SH之一，5的pi略微降低。在竞争抑 制实验中确定R3VQ-SH和R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3的结合特性，实验涉及结合至ELISA板的ΑΜ0 和可溶的AM0。对于R3VQ-SH和R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3给出50 %结合抑制的Αβ浓度计算得lyg/ ml，表明添加 D0TA/Gd不影响VHH结合特性。此外，根据转基因 B6.PS2APP小鼠中VHH-特异性 免疫反应性的分布，抗原修复预处理之后R3VQ-SH在小鼠石蜡切片中显示良好的免疫检测A β斑块的能力。
[0379] 用C端Cys残基构建R3VQ-SH，用于偶联至马来酰亚胺-D0TA/Gd(图9)。每L培养物表 达15mg的纯化蛋白。然而，此前已经实现了多种构建体，并总结在以下：
[0380] -Strep-R3VQSSfree-Cys-Thr-His从C端至N端含有strep标签、VHH R3VQ其中Cys 突变为Val和Ser、Cys、凝血酶切位点和his标签。这种蛋白以很低的产率表达(yg蛋白/1)。
[0381] -标签-R3VQSSf ree-Cy s 和 Hi s 标签_R3VQSSf ree-Cy s 从 C端至N 端含有标签（Strep 或者His标签）、VHH R3VQ其中Cys突变为Val和Ser、以及Cys;两种蛋白以很低的产率表达(μ g蛋白/1)。
[0382] -标签-R3VQSSfree-Cys-Ser_Ala 从 C 端至 N 端含有标签（Strep 或者 His 标签）、VHH R3VQ其中Cys突变为Val和5虹、078、5虹、以及厶1&。这些蛋白以很低的产率表达化8蛋白/1)。
[0383] -标签-Thr R3VQSSfree-Cys-Ser-Ala从C端至N端含有标签（Strep或者His标签）、 凝血酶切位点、VHH R3VQ其中Cys突变为Val和Ser、CyS、Ser以及Ala。这些蛋白以很低的产 率表达(yg蛋白/1)。
[0384] 4.用缀合有Gd造影剂的VHH R3VQ检测淀粉样蛋白斑块
[0385] 立体定位注射之后R3VQ-N_(D0TA/Gd)(i-2)体内标记淀粉样蛋白斑块
[0386] 将2yg的VHH RSVQ-MDOTA/Gdh-2(2e)立体定位注射至小鼠脑左半球的海马或皮 质（2只小鼠）。注射后4h，处死动物，收集脑切片。观察到淀粉样蛋白斑块的免疫染色，表明 R3VQ-N-(DOTA/Gd) n在体内标记纤维状Αβ (图6A和6B)。图6C和6D显示标记存在于丘脑淀粉 样蛋白β斑块，其远离注射位点。在相同小鼠上用4G8抗体标记淀粉样蛋白斑块来进行对照 (图 6Ε)。
[0387] 体外成像
[0388] 浸入RSVQ-MDOTA/Gdh-2溶液（2e造影剂的终浓度为0.02mg/ml，相当于O.OlmM Gd)的TauPS2APP小鼠的脑成像，显示多个低信号的点（n = 2;图7A，箭头），而这在相同条件 中的对照小鼠脑的图像中不能被检测到(数据未显示），低信号的点和Gd染色方法所显示的 淀粉样蛋白斑块共定位（图7B，箭头）。即便石蜡程序中所导致的失真不允许MRI和IHC之间 点对点的配准（point-to-point registration)，IHC仍证实了VHH-D0TA/Gd的大规模扩散 以及在相同区域中标记淀粉样蛋白斑块（图7C，箭头）。此外，在相同条件中的对照小鼠脑的 图像中（n = 2;数据未显示)或在浸入相同浓度钆溶液的TauPS2APP小鼠脑中（即O.OlmM;图 7D)没有检测到低信号的点。
[0389] 脑内、颈动脉内或者IV注射之后的离体成像
[0390] 脑室内注射后，在海马中抗ΑβνΗΗ-Gd SeUSVQ-MDOTA/Gdh-2)在离体图像上显 示低信号的点（图8A，箭头），这对应着淀粉样蛋白斑块，正如通过Gd染色在相同小鼠上所确 定的（图8B，箭头）。即便石蜡程序中所导致的失真不允许MRI和IHC之间点对点的配准，IHC 证实了相同区域内淀粉样蛋白斑块的标记（图8C，箭头）。此外，在和R3VQ-N-(D0TA/Gd) 1-2所 用的相同浓度(〇. ImM)钆溶液注射的转基因 TauPS2APP小鼠中没有检测到低信号的点。
[0391] 通过体外 MRI 评价 R3VQ-S-(D0TA/Gd)3
[0392] 通过上述的位点特异性方法合成R3VQ-S-(D0TA/Gd)3<3HPLC/MS、pI和IHC分析证实 了 R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3的生化特性（即，通过HPLC/MS进行的纯度、pI以及对Αβ的IHC反应性） (参见图11)。
[0393] 如上述，用0. lmg/ml的R3VQ-S-(D0TA/Gd)3体外孵育来自PS2APP小鼠的脑之后，评 价R3VQ-S_(D0TA/Gd)3诱导MR造影改变（contrast modification)的能力（Richards，J·G·， 等人，2003 Journal of neuroscience：official journal of Society for Neuroscience 23,8989-9003)(n = 2)。相较于阴性对照条件下的PS2APP小鼠的脑，7T获取 的图像显示皮质中低信号的点（图12A和B)。为了证实这些低信号的点作为淀粉样蛋白斑块 的性质，脑进行Gd染色方法，其中Gd染色用作MRI检测淀粉样蛋白斑块的金标准方法（图 12C)。分析Gd染色方法之后获得的图像，允许将Gd染色所检测的淀粉样蛋白斑块和R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3所显示的低信号的点进行共配准（co-registration)(图12,白箭头）。这些结果 表明R3VQ-S-(D0TA/Gd) 3被动地扩散至尸检组织中并靶向淀粉样蛋白沉积，从而允许通过 MRI进行体外检测。
[0394] 外周(静脉)注射之后通过离体MRI评价R3VQ-S-(D0TA/Gd)3
[0395] 如上述，18月龄的PS2APP小鼠尾静脉中静脉注射（20mg/kg和50mg/kg)之后，然后 研究R3VQ-S-(D0TA/Gd)3通过MRI显示淀粉样蛋白斑块的能力。在注射后5小时脑提取之后， 获得静脉注射R3VQ-S-(DOTA/Gd) 3的PS2APP小鼠在11.7T时取得的MR图像。不同于对照条件 的MR图像（用PBS注射的PS2APP小鼠）（图13A和B)，接受静脉注射R3VQ-S-(DOTA/Gd) 3的离体 脑上获得的图像显示了多个低信号的点（图13C和D)。这些低信号的点和对比异常配准，其 中对比异常对应着金标准Gd染色方法所检测的淀粉样蛋白斑块（图13E和F)。根据双光子结 果，50mg/kg剂量时的这些点更强，表明R3VQ的脑穿透及其标记脑Αβ损伤的能力是剂量依赖 性的。
[0396] 实施例2:偶联至荧光团试剂的抗AI3VHH的产生及其体外/体内评价
[0397] 1.材料和方法
[0398] 此处除非另有指明，材料和方法和实施例1中所述相同。
[0399] 2.体内靶向Αβ-阳性损伤
[0400] 用AF488荧光团缀合R3VQ-SH
[0401]为了实现R3VQ VHH和荧光团之间的偶联，如前所述进行位点特异性缀合。简言之， 额外的半胱氨酸残基插入R3VQ序列的C端部分(称为R3VQ-SH)，从而允许马来酰亚胺-Alexa Fluor? 488 (AF488)的C端硫代加成。由此，获得明确的缀合物，称为R3VQ-S-AF488，在VHH上 带有单个的AF488(图14)。
[0402] SDS-PAGE和HPLC/MS分析显示预期的分子量(698Da的增加），其对应着分子上添加 AF488。这些数据证实缀合物的标记和纯度（图14A和B)。
[0403] 使用 IEF 3-10 凝胶通过 NEPHGE 分析 R3VQ-SH 和 R3VQ-S-AF488 的等电点（pi)。和 R3VQ的pi相似，R3VQ-SH的pi在8.5至9.5(图14C) AF488添加至R3VQ-SH稍稍降低了其pi，在 8 · 3附近。然而，仍然是碱性的（图14C)。通过DLS测量R3VQ-SH和R3VQ-S-AF488的水力半径 (拖）。尺寸随着时间的分布显示对于1?3￥0-3!1的平均拖为2.66±0.078811111，以及对于1?3￥0-3-AF488的平均Rh为2.34 ± 0.106nm，表明二者在溶液中是单聚的形式。使用来自PS2APP小鼠 脑的切片，通过IHC体外证实了通过R3VQ-S-AF488进行的淀粉样蛋白斑块的免疫染色（图 14D)〇
[0404] 局部脑输注之后的R3VQ-S-AF488扩散(双光子成像)
[0405]在PS2APP小鼠上进行穿颅术，以获得右后皮质上的颅窗。剥离硬脑膜后，将15yg (10μ1)的R3VQ-S-AF488直接施加至暴露的脑。通过双光子显微术跟踪R3VQ-S-AF488扩散约 2小时。脑实质中检测到淀粉样蛋白斑块和CAA的典型特异性染色，表明皮质周输注之后 R3VQ-S-AF488能够扩散并体内检测细胞外和血管Α即日性损伤（图15)。
[0406] 静脉注射之后R3VQ-S-AF488的扩散(双光子成像)
[0407]首先通过MRI检测受试小鼠血脑屏障（BBB)的完整性(参见以下的对照实验）以确 保没有可能会人为地提高静脉注射(iv)的VHH脑渗透的渗漏（leakage)。
[0408] 50-mg/kg剂量的R3VQ-S-AF488注射至一只小鼠的尾静脉。注射之后，使用双光子 显微术在脑窗持续记录3.5小时的脑中缀合物的溢出和染色（z =距离表面达360μπι深）。图 16Α显示相同区域内R3VQ-S-AF488在长达30min之内随着时间的体内成像重构(最大强度投 影-MIP)。在iv注射后几秒，观察到树枝状管的强染色，20min后剧烈降低，只有少数毛细管 仍保留染色。这表明缀合的VHH在循环中半衰期短（10-20min)。注射后立即形成绿色荧光 "云"，并扩散至实质空间，表明和R3VQ立体定位注射之后所观察到的球面扩散的相似性(参 见以上）。在iv注射后30min，开始显示淀粉样蛋白斑块。还观察到血管AKCAA)。红色通道中 没有信号，表明荧光信号是特异性的(数据未显示），并不是因为常规的自发荧光。进一步的 成像显示注射后斑块中Αβ沉积的体内染色以及管的维持长达3.5小时（图16B)，表明R3VQ-S-AF488的脑半衰期扩展至数小时。静脉注射R3VQ-S-AF488后4小时，收集脑，制备5μπι厚的 石蜡切片。然后，用抗His mAb进行IHC以便确认R3VQ-S-AF488的扩散和淀粉样蛋白斑块标 记。整个脑观察到R3VQ-S-AF488的淀粉样蛋白斑块的免疫染色，其伴有棕色背景，这可以对 应着VHH的扩散圈（图16C)。用更低剂量的R3VQ-S-AF488( 10mg/kg)进行其它实验，观察到了 Αβ沉积的体内检测，但是强度降低。这些结果表示R3VQ的脑渗透及其标记脑Αβ损伤的能力 是剂量依赖性的，其被IHC证实了（图16D)。
[0409] VHH的碱性pi是其迀移穿过ΒΒΒ能力的关键因素
[0410] 还制备了马来酰亚胺-AF488缀合的R3VE，其pi是7.5左右（图17A和B) (VHH R3VE如 上述）。将10mg/kg剂量的R3VE-S-AF488静脉注射至PS2APP小鼠。注射后45分钟，只观察到脑 淀粉样蛋白血管病，而没有标记淀粉样蛋白斑块（图17C) A3VE-S-AF488静脉注射后4小时， 收集脑，制备5mi厚的石蜡切片。然后，用抗His mAb进行IHC以便检测脑中固有R3VE-S-AF488的存在（图17D)。相较于采用相同剂量的R3VQ-S-AF488获得的结果(参见上述以及图 16D)，在整个脑只观察到非常有限的淀粉样蛋白斑块标记，表明VHH表面存在的正电荷发挥 这些抗体穿过BBB的脑渗透作用。
[0411]对照实验
[0412]在无淀粉样蛋白的小鼠中的评价
[0413] R3VQ-S-AF488静脉注射至野生型无淀粉样蛋白的C57BL/6小鼠。使用双光子显微 术分析，脑实质中没有观察到特异性体内染色(数据未显示）。
[0414] 和常规IgG抗体的比较
[0415] PS2APP小鼠中iv注射mAb 4G8-AF488仅允许通过双光子成像检测CAA，而不能检测 淀粉样蛋白斑块，这表明这种标准抗Αβ免疫球蛋白没有显著的溢出（图18)。
[0416]用于双光子成像的在小鼠中血脑屏障完整性的评价
[0417] 使用DOTAREM iv注射(0.2ml Gd 500mM)测试用于双光子实验的PS2APP小鼠（2岁） 的BBB渗透。这种MRI造影剂不能穿过BBB，除非病理情况导致局部的屏障渗漏。这种MRI检验 也用于人类，在BBB破裂的区域显示信号的提高（V.M.Runge等人，American Journal of Roentgenology 1994，162，431_435 ;Μ· A. Ibrahim等人，Investigative radiology，1998， 33,153-162)。测试小鼠中信号变化的缺失表明它们BBB的完整性。另两只年龄配对的 PS2APP小鼠用相同方法也进行MRI-评价，没有观察到BBB的破裂(数据未显示）。
【主权项】
1. 一种针对淀粉样蛋白β纤维状形式的分离的骆驼科重链抗体(VHH)可变结构域，特征 在于其氨基酸序列从N端至C端包含：氨基酸序列SEQ ID NO. 1(对应着CDRl)、氨基酸序列 SEQ ID N0.2(对应着CDR2)和氨基酸序列SEQ ID N0.3(对应着CDR3)。2. 根据权利要求1所述的VHH，特征在于其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。3. -种VHH衍生物，其由多肽组成，所述多肽包含权利要求1或权利要求2所述的VHH，只 要包括在所述多肽之内的所述VHH能够结合淀粉样蛋白邱勺纤维状形式。4. 一种VHH衍生物，特征在于其具有氨基酸序列SEQ ID NO.8。5. -种分离的多核苷酸，其编码权利要求1或权利要求2所述的VHH、或者权利要求3或 权利要求4所述的VHH衍生物。6. -种重组表达盒，其包含在转录启动子控制下的权利要求5所述的多核苷酸，所述的 转录启动子允许在宿主细胞中调节所述多核苷酸的转录。7. -种重组载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸或权利要求6所述的重组表达盒。8. -种宿主细胞，其包含权利要求6所述的重组表达盒或权利要求7所述的重组载体。9. 一种诊断剂或治疗剂，其包含直接或者间接、共价或非共价连接至感兴趣的物质的 权利要求1或权利要求2所述的VHH或者权利要求3或权利要求4所述的VHH衍生物。10. 根据权利要求9所述的治疗剂，特征在于所述感兴趣的物质选自肽、酶、核酸、病毒 和化学实体。11. 根据权利要求9所述的诊断剂，特征在于所述诊断化合物选自：酶、焚光团、匪R或 MRI造影剂、放射性同位素、或纳米颗粒。12. 根据权利要求10所述的诊断剂，特征在于所述诊断化合物是NMR或者MRI造影剂，其 选自：顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Mn);以及基于铁氧化物或基于铂铁的超顺磁剂；以及X-核比如 18F、13C、23Na、17O、15N。13. 根据权利要求9或权利要求10所述的治疗剂，特征在于所述治疗化合物选自：止痛 化合物、抗炎化合物、抗抑郁化合物、细胞毒性化合物、抗惊厥化合物或者抗神经退行性化 合物。14. 根据权利要求9所述的诊断剂或治疗剂，特征在于所述感兴趣的物质是包含权利要 求10至13中任一项所限定的诊断或治疗化合物的脂质体或聚合实体。15. -种非位点特异性方法，其用于将权利要求1或权利要求2所述的VHH或者权利要求 3或权利要求4所述的VHH衍生物偶联至感兴趣的物质，所述方法包括将感兴趣的物质和权 利要求1或权利要求2所述的VHH或者权利要求3或权利要求4所述的VHH衍生物进行缀合的 步骤。16. 根据权利要求15所述的非位点特异性方法，其中所述感兴趣的物质是选自以下的 诊断或治疗化合物:肽、酶、核酸、病毒、荧光团、NMR或MRI造影剂、化学实体、放射性同位素 和纳米颗粒。17. 根据权利要求16所述的非位点特异性方法，其中所述感兴趣的物质是选自以下的 诊断化合物:NMR或MRI造影剂和金属放射性同位素。18. 根据权利要求17所述的非位点特异性方法，其包括以下步骤： (i)将以酯或酸酐形式激活的螯合剂，优选以酯的形式激活的螯合剂，和权利要求1或 权利要求2所述的VHH或者权利要求3或权利要求4所述的VHH衍生物的赖氨酸残基进行缀 合，以及 (i i)将步骤(i)的配体和感兴趣的物质进行螯合。19. 根据权利要求17所述的非位点特异性方法，其包括以下步骤： (i'）将感兴趣的物质和以酯或酸酐形式激活的螯合剂，优选以酯的形式激活的螯合剂 进行螯合，以及 (ii'）将步骤（i'）的预螯合的感兴趣的物质和权利要求1或权利要求2所述的VHH或者 权利要求3或权利要求4所述的VHH衍生物的赖氨酸残基进行缀合。20. 根据权利要求18或权利要求19所述的非位点特异性方法，其中所述感兴趣的物质 是匪R或者MRI造影剂，其选自：顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Mn);以及基于铁氧化物或基于 铂铁的超顺磁剂；以及X-核比如 18F、13C、23Na、17O、15N。21. 根据权利要求18或权利要求19所述的非位点特异性方法，其中所述螯合剂选自：1， 4,7，10_四氮杂环十二烷-1，4,7，10-四乙酸(D0TA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、1，4,7-三(羧 甲基氮杂)环十二烷-10-氮杂乙酰胺(D03A)、次氮基三乙酸(NTA)、D-青霉胺(Pen)、2,3_二 巯基丁二酸（DMSA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸（DMPS)、2,3-二巯基丙醇（BAL)、三乙烯四胺 (Trien)、四硫代钼酸铵(TTM)阴离子、乙二胺四乙酸(EDTA)、2-(p-异硫氰酰苄基)-6-甲基-二乙三胺五乙酸（IB4M)和羟基吡啶酮(HOPO)。22. 根据权利要求18或权利要求19所述的非位点特异性方法，其中所述感兴趣的物质 是是钆(Gd)，并且所述螯合剂是D0TA。23. -种缀合至感兴趣物质的VHH，其是根据权利要求15至22所述的非位点特异性方法 获得的。24. -种用于脑成像、或用于诊断或监测淀粉样蛋白β沉积介导的疾病，如阿尔茨海默 氏病和唐氏综合征的试剂盒，所述试剂盒至少包含权利要求1或权利要求2所述的VHH或者 权利要求3或权利要求4所述的VHH衍生物，以及诊断剂。25. 权利要求9至12和14中任一项所述的诊断剂用于诊断或监测受试者中淀粉样蛋白β 沉积介导的疾病如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征的用途。26. -种体外或离体的方法，其用于诊断受试者中淀粉样蛋白β沉积介导的疾病如阿尔 茨海默氏病和唐氏综合征，所述方法包括步骤： a) 用权利要求9至12和14中任一项所述的诊断剂体外接触来自所述受试者的适当生物 样本，以及 b) 在所述生物样本中，确定淀粉样蛋白β沉积比如淀粉样蛋白斑块的存在或者不存在， 所述淀粉样蛋白β沉积的存在表明所述受试者患有淀粉样蛋白β沉积介导的疾病，如阿 尔茨海默氏病和唐氏综合征。27. -种体外或离体的方法，其用于监测受试者中淀粉样蛋白β沉积介导的疾病如阿尔 茨海默氏病和唐氏综合征的进展或消退，所述方法包括步骤： a) 用权利要求9至12和14中任一项所述的诊断剂体外接触来自所述受试者的适当生物 样本， b) 在所述生物样本中，确定淀粉样蛋白邱勺纤维状形式的量，以及 c) 将步骤b)确定的量和所述受试者先前获得的淀粉样蛋白邱勺纤维状形式的量进行比 较， 淀粉样蛋白β的纤维状形式的量显著增加，构成了所述淀粉样蛋白β沉积介导的疾病的 进展的标志，淀粉样蛋白邱勺纤维状形式的显著降低构成了所述淀粉样蛋白β沉积介导的疾 病的消退的标志。28. -种用于在受试者中对淀粉样蛋白β沉积进行体内成像的方法，其包括步骤： a) 在受试者中施用可检量的权利要求9至12和14中任一项所述的诊断剂，受试者优选 是人，以及 b) 通过成像方法，检测所述受试者中的所述诊断剂。29. -种药学组合物，其包含权利要求9、10、13和14中任一项所述的治疗剂，以及药学 上可接受的载体。
【文档编号】A61K51/10GK105916879SQ201480063897
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年11月13日
【发明人】P·拉费, S·贝, B·德拉尔图, M·德南, C·迪克阿尔特, T·李, M·范德斯库乐, C·切赫, F·格吕宁格尔
【申请人】豪夫迈－罗氏公司, 巴斯德研究所, 国家科学研究中心, 原子能和能源替代品委员会