用于转导脂肪组织的腺相关病毒载体的制作方法

用于转导脂肪组织的腺相关病毒载体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于转导脂肪组织的腺相关病毒载体。本发明还涉及用于产生这种腺相关病毒载体的多核苷酸、质粒、载体和方法。本发明还涉及用于需要调节基因表达水平的疾病的治疗的方法。DSM 2605820120608DSM 2605720120608
【专利说明】
用于转导脂肪组织的腺相关病毒载体
技术领域
[0001] 本发明涉及用于转导脂肪组织的腺相关病毒(AAV)载体。该载体可以以组织特异 性的方式转导白色或褐色脂肪组织。
【背景技术】
[0002] 脂肪组织，除了其作为脂肪库以及能量平衡的调节器的已知作用，近来已被认为 是主要的新陈代谢和内分泌器官。已经提出，减损的白色脂肪组织(WAT)功能，以及降低的 褐色脂肪组织(BAT)活性或BAT质量，是肥胖症(肥胖，obseity)发展的主要因素。在这方面， 已经所描述了人类的脂肪细胞和WAT功能障碍。此外，还报告了 BAT活性和体重指数(BMI)之 间的逆相关。参见Yee J等，Lipids Health Dis.2012，ll:19_30、Ichimura A等，Nature 2012;483:350_354、Mazzatti D等，Arch.Physiol.Biochem.2012;118(3):112_120、Cypess A等，N.Engl.J.Med.2009;360:1509_1517和van Marken Lichtenbelt W等， N.Engl.J.Med.2009;360:1500-1508。
[0003] 肥胖症的发病在过去几十年之中已经显著增加以致达到流行病的比例。据估计超 过5亿人是肥胖的。肥胖症是现今主要的公共卫生问题。参见IASO, "Global Prevalence of Adult Obesity，Report IOTF 2008"（1厶50儿〇11(1〇11，68,2009)。肥胖症自身增加死亡的风险 并且与胰岛素耐受性和2型糖尿病长期强烈相关。参见P e e t e r s A等， Ann · Intern .Med · 2003; 138:24-32和Moller D等，N· Engl · J ·Med · 1991; 325:938-948。此外， 脂肪细胞的功能障碍和肥胖症对于特定类型的癌症和许多其他严重的疾病，如心脏病、免 疫功能障碍、高血压、关节炎和神经退行性疾病而言也是显著的风险因素。见Roberts D等， Annu·Rev.Med·2010;61:301_316、Spiegelman B等，J·Biol·Chem.1993;268(10):6823-6826和Whitmer R等，Curr.Alzheimer Res.2007;4(2):117-122。
[0004] 饮食和锻炼是肥胖症的主要治疗方法，但是越来越多的患者还需要药物治疗干预 以降低并保持体重。然而，药物治疗不会引发非自愿的或显著的体重减轻，并且此外，抗肥 胖药物经常由于它们的全身作用表现出严重的副作用。因此，存在对于预防并对抗当前的 肥胖症流行的新的和安全的途径的急切的需要。在这方面，阐明肥胖症基础的病理事件对 于开发新的抗肥胖症疗法是至关紧要的。候选基因在体内基因转移至白色和褐色脂肪组织 可以提供巨大的潜力以了解肥胖症的发病和发作之下的分子机制。此外，目标为脂肪细胞 的基因治疗途径可以为未来的肥胖症及其相关的失调的治疗，同时最小化全身的反应开创 新的机会。然而，迄今为止转移至白色和褐色脂肪组织的有效的和特定的基因仍然难以确 定。
[0005] 最近，当血清型1的AAV(AAVl)与非离子表面活性剂或雷公藤红素结合时，示出其 适度感染的小鼠体内的歡1'。见組2111?111^!1等，!111111.66116 11^^.2006;17:921-928和21^即？ 等，Gene 11^^.2011;18:128-134。已经报告其他44￥血清型，如44￥6、44￥7、44￥8或44￥9是高 度感染性的，但是它们的脂肪转导效率是不清楚的。参见G a 〇 G等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002;99:11854-11859、Nakai Η等，J.Virol.2005;79:214-224、 Pacak C等，Circ.Res.2006;99:e3-e9、Broekman Μ等，Neuroscience 2006;138:501-510、 Wang Z等，Diabetes 2006;55:875_884、Taymans J等，Hum.Gene Ther.2007;18:195-206、 Bish L等，Hum.Gene Ther.2008;19:1359-1368和Lebherz C等，J.Gene Med.2008;10:375-382。因此，在本领域中存在对于开发使脂肪组织特定转导，以及，此外使特定类型的脂肪细 胞转导的载体的需要。

【发明内容】

[0006] 本发明涉及使感兴趣的多核苷酸转移至特定类型的脂肪细胞并且使它们表达的 腺相关病毒载体(AAV)。本发明的脂肪组织特异调控元件的使用限制感兴趣的多核苷酸在 白色脂肪组织或褐色脂肪组织中的表达。此外，已经证明本发明的载体对于脂肪组织相关 的疾病，如，例如2型糖尿病的治疗是有用的。本发明的发明方面在权利要求中公开。
[0007] 微生物保藏
[0008] 质粒 pAAV-mini/aP2-null 和pAAV-mini/UCPl-null 在 2012年6 月8 日分别以登录号 DSM 26057和DSM 26058保藏于DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，InhoffenstraPe 7 B，D_38124 Braunschweig，德意志联邦共和国。
【附图说明】
[0009] 图1.通过AAV的eWAT内部给予的白色脂肪细胞的转导。A-B.在用血清型1、2、4和5 (A)的AAV-CAG-GFP与普兰尼克F88(Pluronics F88)-起或不与普兰尼克F88(Pluronics F88)-起处理eWAT的部分和用血清型6、7、8和9(B)的AAV-CAG-GFP处理eWAT的部分中针对 绿色荧光蛋白（GFP，绿色）的免疫染色。蓝色，细胞核。箭头表示转导的脂肪细胞。初始放大 倍数100X(B，左侧图片)和200X(A;B，右侧图片）<X.用血清型1、6、7、8、S^9AAV-CAG-GFP 处理的eWAT中的GFP含量(n = 5每组）。示出的值是平均值土SEMALU，相对光单位(relative light unit) 接收AAV8-CMV-LacZ的eWAT的全部X-gal着色。X-gal着色分布贯穿整个转 导的eWAT。相反地，在来自用生理盐水溶液处理的动物的eWAT中没有检测到X-gal着色。E. 由用AAV9-CMV-mHKII或AAV〇-CMV-null载体处理的动物的eWAT获得的分离细胞中的相对 mHKII表达水平。F.由来自用AAV9-CMV-nul 1和AAV-CMV-mHKII注射的小鼠的分离的脂肪细 胞摄取的基础的和胰岛素刺激的2[1-3H]脱氧-D-葡萄糖。脂肪细胞获得自至少5小鼠/组。 G.在2 X 10nvg的AAV8或AAV9-CAG-GFP载体的iWAT内部给予两个星期之后在腹股沟白色脂 肪组织（iWAT)部分中的针对GFP(棕色）的免疫染色。初始放大倍数ΧΙΟΟ。!!:注射2X10 nvg 的AAV8或AAV9-CAG-GFP后两个星期iWAT中的GFP表达水平(η = 6)。示出的值是平均值土 SEMjpfO · 05、#ρ〈0 · 01并且*#ρ〈0 · 001;在相同的胰岛素浓度下相对于AAV9-CMV-null#p〈 0.05。所有的分析是在2 X H^vg/eWAT的eWAT内部给予之后两个星期进行的。
[0010] 图2.通过mini/aP2调控区的AAV的eWAT内部给予之后白色脂肪细胞的特异性转 导。A.在接收1012vg/eWAT的AAV8和AAV9-mini/aP2-GFP载体的eWAT中针对GFP(棕色）的免疫 染色。分析是在注射后两个星期进行的。初始放大倍数X40(KB.循环hSeAP水平。将4X l〇 12vg八鼠的剂量的AAV9-mini/aP2-hSeAP载体双侧注射入eWAT并在注射后的几个时间点进 行循环hSeAP水平的测量。RLU，相对光单位。示出的值是平均值土 SEM。η = 3 (生理盐水）以及 n = 4(AAV9-mini/aP2-SeAP)<X.4X1012vg 八鼠的 AAV9-mini/aP2-hSeAP 的 eWAT 内部给予一年 后，肝脏和eWAT中的相对hSeAP表达水平。D.在AAV9-mini/aP2-null和AAV9-mini/aP2-mHKII载体的eWAT内部给予（1.4X10 12vg八鼠）两个星期后评估由eWAT、iBAT和心脏的体内2-[1 -?]脱氧-D-葡萄糖摄取。示出的值是平均值土 SEM。11 = 7只小鼠每组。*p〈0.05。
[0011] 图3.通过AAV的iBAT内部给予的棕色脂肪细胞的转导。A.在用2 X 109vg八鼠的AAV8 或AAV9-CAG-GFP处理的iBAT的部分中，针对GFP(棕色）的免疫染色。初始放大倍数X 200和 X 400(小图）J.接收2 X 109vg八鼠的AAV8或AAV9-CAG-GFP的iBAT中的相对GFP表达水平。示 出的值是平均值土 SEMm = 5只小鼠每组。*p〈0.05。C.接收2 X 101Qvg八鼠的AAV4或AAV8-CMV-RFP或 2 X 1010 vg 八鼠的 AA V1、AA V2、AAV5、AAV6、AAV7、AA V8、或 AAV9-CMV-RFP 的 i BAT 中的相对 红色荧光蛋白（RFP)表达水平。转导模式与eWAT相似。参见图1<^4￥6^4￥7^4￥8和44￥9是用 于转导iBAT最高效的血清型。D.在用10 nvg八鼠的AAV9-CMV-RFP处理的iBAT的部分中针对 RFP(棕色）的免疫染色。初始放大倍数X 200和X 400(小图）。分析是在给予AAV后两个星期 进行的。
[0012] 图4.通过mini/UCPl调控区的AAV的iBAT内部给予之后棕色脂肪细胞的特异性转 导。A.通过注射2X10nvg八鼠的AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP载体后两个星期针对GFP(棕色） 的免疫染色评估棕色脂肪细胞的转导。初始放大倍数X 200和X 400(小图）在给予AAV8-mini/UCPl-null 和 AAV8-mini/UCPl-mHKII 载体（7X101Qvg 八鼠）之后两个星期由 iBAT、eWAT 和心脏摄取的体内2-[1-3!1]脱氧-0-葡萄糖。11 = 6(六六￥8-111；[11；[/1]0?111服11)以及11=10 (AAV8-mini/UCPl-null)只小鼠每组。C-E.递送 2X10nvg 八鼠的 AAV9-mini/UCPl-mVEGFi64 或 AAV9-mini/UCPl-null载体之后两个星期，iBAT中的相对mVEGFi64(C)、总mVEGF(D)和 mPECAMl (E)表达水平。n = 5 只小鼠每组。F.注射 2 X 10nvg 八鼠的 AAV9-mini/UCPl-mVEGFi64 或 AAV9-mini/UCPl-null载体后两个星期，iBAT中针对α-SMA(棕色）的免疫染色。初始放大倍 数X 400。示出的值是平均值+SEM<3*p〈0.05。红色箭头指示毛细结构。
[0013] 图5.通过AAV载体全身递送至瘦鼠的白色和棕色脂肪细胞的转导。A. eWAT部分中 针对GFP (绿色）的免疫染色。蓝色，细胞核。初始放大倍数X 100 (左侧图片）和X 200 (右侧图 片）。B. eWAT中的相对GFP表达水平。C. eWAT中的GFP含量。D. iBAT部分中针对GFP(棕色）的免 疫染色。初始放大倍数X 200和X400(小图）J. IBAT中的相对GFP表达水平。F. iBAT中的GFP 含量。G-H.将载体静脉（iv)给予至ICR小鼠（G)和C57B16小鼠（H) (ICR:对AAV8n = 3并且对于 AAV9n = 5; C57B16: η = 4)之后，腹股沟（iWAT)、腹膜后(rWAT)、肠系膜(mWAT)、eWAT和iBAT中 的相对GFP表达水平。所有的分析是在5 X 1012 vg八鼠的AAV8或AAV9-CAG-GFP载体的尾部静脉 给予之后两个星期进行的。AU，任意单位。RLU，相对光单位。
[0014] 图6.通过全身给予mini/UCPl调控区的AAV之后，棕色脂肪细胞的特异性转导。A. 在接收AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP载体的iBAT中，针对GFP(棕色）的免疫染色。初始放大倍 数X 200和X 400(小图）J-C·在注射两个月后用2 X 1012vg小鼠的AAV9-mini/UCPl-mVEGFi64 或 AAV9-mini/UCPl-null 处理的 iBAT 中的相对 mVEGFi64(B)和总 mVEGF(C)表达水平。D-E.在 静脉给予 8X1012vg 的 AAV9-mini/UCPl-VEGFi64 或 AAV9-mini/UCPl-null(n = 5)-个月后， iBAT中的VEGF164(B)和PECAMl(C)表达水平。F-G.在与B-C相同的组中针对CD105(棕色）（D) 和a-SMA(棕色）（E)的免疫染色。红色箭头指示血管。初始放大倍数X 400和X 1000(小图）。 示出的值是平均值+SEM。!! = 5只小鼠每组，*p〈0.05。
[0015]图7.AAV的全身给予之后通过mini/aP2调控区和脂肪限制的转基因表达的脂肪细 胞的转导。A.在来自接收AAV8或AAV9-mini/aP2-GFP载体的动物的iBAT部分中，通过针对 GFP(棕色）的免疫染色评估棕色脂肪细胞的转导。初始放大倍数X 200和X 400(小图）3-C. 注射两个星期后通过针对GFP(棕色）的免疫染色评估非脂肪组织的转导。GFP表达在用AAV8 或AAV9-mini/aP2-GFP(B)和AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP(C)处理的动物的肝脏中是最小的 并且不存在于心脏中。初始放大倍数X 100和X 400(小图）。所有的分析是在2 X 1012vg八鼠的 全身注射两个星期后进行的。
[0016] 图8.AAV的eWAT内部给予后，脱靶（off-target)转基因表达。A.来自接收AAV9-CAG-GFP的动物的iBAT中的针对GFP(棕色）的免疫染色。初始放大倍数X 200和X 400 (小 图）J.在来自用AAV9-CAG-GFP处理的动物的iBAT和eWAT中的相对GFP表达水平。示出的值 是平均值土 SEM。η = 5只小鼠每组。*p〈0.05。C.通过针对GFP (绿色）的免疫染色评估非动物 脂肪器官的转导。GFP表达在来自用AAV7、AAV8、或AAV9注射的动物的心脏和肝脏中是明显 的。初始放大倍数X 100。在AAV-CAG-GFP载体(4X 10nvg小鼠）的eWAT内部给予两个星期后 进行分析。
[0017]图9.通过mini/aP2调控区的脂肪组织限制的AAV-介导的转基因表达。在1012vg的 AAV8和AAV9-mini/aP2-GFP载体的局部eWAT内部给予两个星期后，在肝脏和心脏中通过针 对GFP的免疫染色没有检测到GFP表达。初始放大倍数X 100。
[0018]图10.通过AAV载体的iBAT内部给予的非动物脂肪器官的转导。注射两个星期后通 过针对GFP(棕色）的免疫染色评估非脂肪器官的转导。在来自用2X109vg八鼠的AAV8和 AAV9-CAG-GFP载体iBAT内部注射的动物的心脏和肝脏中GFP的表达是明显的。初始放大倍 数 X200。
[0019]图11.AAV的iBAT内部给予之后借助通过mini/aP2调控区和脂肪限制的转基因表 达的棕色脂肪细胞的转导。A. 2 X 10nvg八鼠的AAV9-mini/aP2-GFP载体的iBAT内部递送两个 星期后通过针对GFP的免疫染色(棕色)评估棕色脂肪细胞的转导。初始放大倍数X 200和X 400(小图将AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP载体(2X10nvg八鼠）局部注射iBAT两个星期后 通过针对GFP(棕色）的免疫染色评估非脂肪器官的转导。肝脏中的GFP表达较少。初始放大 倍数X 1 〇〇和X 400 (小图）。
[0020] 图12.AAV的尾部静脉递送之后广泛的转基因表达。通过尾部静脉注射5X1012vg/ 鼠的AAV9-CAG-GFP载体两个星期后，针对GFP(绿色）的免疫染色显示出肝脏、心脏、骨骼肌、 睾丸和肾脏的转导。蓝色，细胞核。初始放大倍数X 200。
[0021] 图13 . AAV载体全身给予至肥胖-糖尿病小鼠之后WAT和BAT的转导。A-B .将3 X l〇12vg的AAV8或AAV9-CAG-GFP载体静脉给予至ob/ob(A)和db/db小鼠（B)之后附睾白色脂肪 组织(eWAT)、腹股沟白色脂肪组织（iWAT)和肩胛间褐色脂肪组织（iBAT)部分中针对GFP(棕 色）的免疫染色。初始放大倍数X 200。（ob/ob:n = 4;db/db:n = 4) <X-D.在来自ob/ob(C)和 db/db小鼠（D)的相同组的腹股沟（iWAT)、腹膜后(rWAT)、肠系膜(mWAT)、eWAT和iBAT库中的 GFP表达。AU，任意单位。所有的分析是在载体递送两个星期后进行的。示出的值是平均值± SEM。相对于AAV9*p〈0 · 05。
[0022] 图14.用mirT序列的肝脏和心脏的高效脂肪细胞转导和转基因表达的去靶(脱靶， de-targeting)。静脉注射 1012vg 的 AAV9-CAG-GFP、AAV9-CAG-GFP-miRT122、AAV9-CAG-GFP-miRTl或AAV9-CAG-GFP-双miRT载体两个星期后附睾白色脂肪组织(eWAT)、腹股沟白色脂肪 组织（iWAT)、肩胛间褐色脂肪组织（iBAT)、肝脏和心脏中的GFP免疫染色。初始放大倍数X 1〇〇(肝脏和心脏）、X 200(eWAT和iWAT)和 X 400( iBAT和小图）。
【具体实施方式】
[0023] 本发明公开了当局部给予时，能够高效介导基因转移至WAT或BAT的基于AAV6、 AAV7、AAV8和AAV9血清型的腺相关病毒载体。参见图1B和1C和图3A-3D。这些载体的全身给 予还导致至WAT和BAT二者中高效的基因递送。参见图5A和?。虽然由AAV8和AAV9载体介导 的基因递送是高效的，其不局限于脂肪组织。本发明公开了AAV8和AAV9载体与脂肪组织特 异启动子区的组合使脂肪组织中感兴趣的多核苷酸特定表达。特别地，AAV8或AAV9的局部 给予包含表达框(表达盒，expression cassette)，其中，在mini/aP2调控区控制下的异源 基因（例如GFP)导致其在WAT中的表达而没有在肝脏或心脏中的表达。参见图2A和图9。此 外，AAV8或AAV9的局部给予包含表达框，其中，在mini/UCPl调控区控制下的异源基因（例如 GFP)导致其在BAT中表达而没有在心脏中表达以及仅较少的肝脏表达。参见图4A和11B。因 此，通过本发明的载体和启动子形成的组合的局部给予提供了用于治疗多种疾病的基于体 内脂肪细胞的转导的安全机制。
[0024]此外，本发明的组合的全身给予构成了用于脂肪细胞的转导的替代途径。在这方 面，本发明公开了 AAV8或AAV9-mini/UCPl和AAV9或AAV9-mini/aP2组合的全身给予对于分 别转导BAT和WAT是高效的。参见图6A和7A。无论使用哪两种调控区，本发明的组合的全身给 予导致脂肪组织中感兴趣的多核苷酸的高度受限的表达，而没有心脏中的表达且肝脏中仅 较少的表达。参见图7B和图7C。
[0025] 1.通用术语和表达的定义
[0026] 如在本文中可互换地使用的术语"腺相关病毒"、"AAV病毒"、"AAV病毒粒子"、"AAV 病毒颗粒"和"AAV颗粒"是指由至少一种AAV衣壳蛋白（优选地全部由特定AAV血清型的衣壳 蛋白）和衣壳化的多核苷酸AAV基因组组成的病毒颗粒。如果该颗粒包含由AAV末端反向重 复序列侧接的异源多核苷酸（即非野生型AAV基因组的多核苷酸，如转基因递送至哺乳动物 细胞），其通常称作"AAV载体颗粒"或"AAV载体"。AAV是指属于依赖病毒属细小病毒科的病 毒。AAV基因组为大约4.7千碱基长，并且由可以是正或负向的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)组 成。该基因组在DNA链两端包含末端反向重复序列（ITR)，和两种开放阅读框(0RF):rep和 cap dep框架由四个编码AAV生命周期所需的Rep蛋白质的重叠基因形成。cap框架含有衣壳 蛋白的重叠核苷酸序列：VP1、VP2和VP3,它们共同交互以形成二十面体对称的衣壳。参见 Carter B,Adeno-associated virus and adeno-associated virus vectors for gene delivery、Lassic D等，Eds·，"Gene Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies" (Marcel Dekker，Inc.，New 丫〇4，阶，1^，2000)和6&〇6等，了.￥化〇1.2004;78(12):6381-6388〇
[0027] 如本文中使用的术语"腺相关病毒ITR"或"AAV ITR"是指存在于腺相关病毒的基 因组的DNA链两端的末端反向重复序列。ITR序列是AAV基因组的高效增殖所需的。这些序列 的另一特性是它们形成发夹的能力。此特性有助于其自身引导（self-priming)，这允许不 依靠引发酶的第二DNA链的合成。还示出ITR对于野生型AAV DNA整合至宿主细胞基因组（即 人类的第19染色体)并从其中拯救，以及对于与产生的完全组装的，耐脱氧核糖核酸酶的 AAV颗粒结合的AAV DNA的高效衣壳化是必需的。
[0028] 如在本文中使用的术语"AAV2"是指具有在GenBank登录号NC001401中限定的具有 基因组序列的腺相关病毒的血清型。
[0029] 如本文中使用的术语"AAV载体"进一步指包含一种或多种由AAV末端重复序列 (ITR)侧接的感兴趣的多核苷酸(或转基因）的载体。当这类AAV载体存在于宿主细胞时，它 们可以复制并包装为感染性病毒颗粒，该宿主细胞已经用可以编码并表达rep和cap基因产 物（即AAV Rep和Cap蛋白质）的载体转染，并且其中，宿主细胞已经用编码和表达来自腺病 毒开放阅读框E4orf6的蛋白质的载体转染。当AAV载体结合至更大的多核苷酸中（例如，染 色体或另一载体，如用于克隆或转染的质粒)时，则该AAV载体通常称作"蛋白-载体(pro-vector)"。该蛋白-载体可以通过在AAV包装功能和由E4orf6提供的必要的辅助功能存在下 的复制和衣壳化来获得"拯救"。
[0030] 如本文中使用的术语"脂肪组织"是指由成熟的脂肪细胞（即脂细胞(fat cell)) 以及小血管、神经组织、淋巴结和基质血管成分（SVF)的组合组成的组织。SVF是由内皮细 胞、成纤维细胞、脂肪细胞前体细胞（即前脂肪细胞)和免疫细胞，如巨噬细胞和T细胞组成 的。在哺乳动物中，两种不同类型的脂肪组织通常区分为：白色脂肪组织(WAT)和褐色脂肪 组织(BAT)。脂肪组织主要作用为以脂肪的形式储存能量、通过非战栗产热产生热量以及分 泌脂肪因子。
[0031] 如本文中使用的术语"脂肪组织细胞"或"脂肪细胞"是指包含脂肪组织，并且特异 化为作为脂肪储存能量，或通过非战栗产热产生热量，并且分泌脂肪因子的细胞类型。脂肪 组织细胞包括白色脂肪细胞和褐色脂肪细胞。
[0032] 如本文中使用的术语"脂肪组织特异转录调控区"是指用作启动子(即调节可操作 地与启动子连接的选择的核酸序列的表达）的核酸序列，并且其影响选择的核酸序列在特 定组织细胞，如脂肪细胞中的表达。脂肪组织特异转录调控区可以是组成性的或可诱导的。
[0033] 如本文使用的术语"碱性磷酸酶"或"AP"是指催化来自许多类型的分子，包括核苷 酸、蛋白质和生物碱的磷酸酯基团的水解的酶(EC 3.1.3.1)。
[0034]如本文中使用的术语"血管发生(angiogenesis)"是指由其他预先存在的血管形 成新的血管的过程，并且包括血管生成(vasculogenesis)和动脉生成(arteriogenesis)。
[0035] 如本文中使用的术语"动脉生成"是指具有平滑肌介质层的血管的形成、生长或发 育。
[0036] 如本文中使用的术语"褐色脂肪组织细胞"或"褐色脂肪细胞"是指多边形的脂肪 细胞的类型，并且其特征在于将脂质积聚为多个较小的"多腔"液滴，以及它们在细胞质内 大量的具有层状脊堆叠的大型线粒体。不同于白色脂肪细胞，这些细胞具有相当多的细胞 质。细胞核是圆形的，并且虽然其位置偏离中心，但不在细胞的外周。棕色脂肪细胞的众多 线粒体和棕色脂肪库丰富的血管分布是BAT为棕色颜色的主要原因。棕色脂肪细胞位于典 型的BAT库中并且负责通过非战栗产热产生热量。参见Enerback S，N.Engl.J.Med.2009; 360:2021-2023。
[0037] 如本文中使用的术语"CAG调控区"是指由巨细胞病毒的早期增强子元件和鸡β-肌 动蛋白启动子形成的组合。参见Alexopoulou Α等，BMC Cell Biology 2008;9(2): 1-11。
[0038] 如本文中使用的术语"cap基因"或"AAV cap基因"是指编码Cap蛋白的基因。如本 文中使用的术语"Cap蛋白"是指具有至少一种天然AAV Cap蛋白（例如，VP1、VP2、VP3)的功 能活性的多肽。Cap蛋白（例如，VP1、VP2、VP3)的功能活性的实例包括诱导衣壳的形成的能 力、促进单链DNA的积聚、促进AAV DNA包装进入衣壳（即衣壳化）、结合至细胞受体并促进病 毒粒子进入宿主。
[0039] 如在本文中使用的术语"衣壳"是指其中包装病毒基因组的结构。衣壳由多种通过 蛋白形成的低聚构造亚单元构成。例如，AAV具有通过三种衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3的交互形 成的二十面体衣壳。
[0040] 如在本文中使用的术语"细胞成分"是指包含本发明的脂肪细胞和至少另一种组 分的材料复合物。该成分可以配制为单个制剂或可能呈现为各个组分的单独制剂，其可以 结合为联合制剂用于联合使用。该组合物可以是其中每种组分单独配制并包装的套装试剂 盒（kit-〇f-parts)〇
[0041] 如本文中使用的术语"组成型启动子"是指其活性在生物体的所有细胞中，或在大 部分的发育阶段过程中维持在相对恒定水平的启动子，以及与细胞环境条件关联较少或不 相关。
[0042] 如本文中使用的术语"增强子"是指转录因子结合至其中以增加基因转录的DNA序 列元件。
[0043] 如本文中使用的术语"表达框"是指用一系列特化的核酸元件重组地或合成地生 成的核酸构结构，其允许特定的核酸在靶细胞中转录。
[0044] 如在本文中使用的术语"提供辅助功能的基因"是指编码进行这样的功能的多肽 的基因，AAV依赖于该功能（即"辅助功能"）进行复制。辅助功能包括对于AAV复制，包括，但 不限于涉及AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的 合成和AAV衣壳组装那些部分所必需的那些功能。基于病毒的附属功能可以源自任何已知 的辅助病毒，如腺病毒、疱疹病毒(而非1型单纯疱疹病毒)和牛痘病毒。辅助功能包括但不 限于，腺病毒El、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29以及疱疹病毒聚合酶。
[0045]如本文中使用的术语"己糖激酶"或"HK"是指催化己糖的磷酸化以形成磷酸己糖 的酶。在大部分生物体中，葡萄糖是HK的主要底物，并且葡萄糖-6-磷酸酯是最重要的产物。 [0046] 如本文中使用的术语"高血压(high blood pressure)"或"高动脉压(arterial hypertension)"是指其中动脉的血压升高的医学状况。血压包括两种测量，收缩和舒张，其 取决于心肌在搏动之间是否收缩(心脏收缩)或放松(心脏舒张）。静止时的正常血压在100-140mmHg收缩(最高读数）以及60-90mmHg舒张(最低读数）的范围内。如果其持续位于140/ 90mmHg或以上，则称为存在高血压症。高血压(Hypertension)分类为原发性（自发性)高血 压和继发性高血压;约90-95 %的情况归类为"原发性高血压"，这是指没有明显的潜在医学 起因的高血压症。其余5-10%的情况（即继发性高血压)是由其他影响肾脏、动脉、心脏或内 分泌系统的条件引起的。肥胖症中常见的胰岛素耐受性也认为促进了高血压。高血压是中 风、心肌梗塞（即心脏病发作）、心力衰竭、动脉的动脉瘤(例如，主动脉瘤）、外周动脉疾病的 主要风险因素并且是慢性肾病的起因。即使中度的动脉血压升高也与预期寿命的缩短相 关。
[0047]如本文中使用的术语"高血糖"是指与空腹基准水平相比，其中出现异常的高血糖 水平的状态。特别地，高血糖理解为当空腹血液葡萄糖水平始终高于126mg/dL，餐后葡萄糖 水平高于140mg/dL时，或给予每公斤体重1.75克的剂量的葡萄糖2小时之后静脉血浆中的 葡萄糖水平超过200mg/dL时发生。
[0048]如本文中使用的术语"胰岛素耐受性"是指其中细胞不正确地对胰岛素响应的失 调。结果是，身体响应于高血液葡萄糖水平而产生更多的胰岛素。具有胰岛素耐受性的患者 经常表现出高葡萄糖水平和高循环胰岛素水平。胰岛素耐受性经常与肥胖症、高血压和高 血脂相关。此外，胰岛素耐受性经常出现在具有2型糖尿病的患者中。
[0049]如本文中使用的术语"局部给予"是指将本发明的多核苷酸、载体、多肽、或药物组 合物在特定的位点或附近给予至受试者。
[0050] 如本发明中使用的术语"肥胖症"是指由WHO提供的，基于体重指数(BMI)(其是由 个人的重量（以kg计)和它们的以米计的高度的平方之间的比率构成）的定义。根据此标准， 低于18.5kg/m 2的BMI认为是重量不足或瘦，18.5-24.9kg/m2的BMI认为是正常重量25.0-29.9kg/m 2的BMI认为是1级超重，30.0-39.01^/1112的811认为是2级超重以及大于或等于 40.Okg/m 2的BMI认为是病态的肥胖症。可替代地，存在用于定义受试者的肥胖症的程度的 其他方法，如在肋部下边缘和骨盆上边缘之间的中点测量的腰部直径（以cm计）、皮肤皱襞 的厚度、生物阻抗，其基于瘦肉组织（lean mass)比脂肪组织(fatty mass)更好地传输电流 的原理。
[0051] 如本文中使用的术语"可操作地连接"是指启动子序列相对于感兴趣的多核苷酸 的功能关系和位置(例如，启动子或增强子可操作地与编码序列连接，如果其影响该序列的 转录）。通常，可操作地连接的启动子与感兴趣的序列邻接。然而，增强子无须邻接感兴趣的 序列以控制其表达。
[0052]在本文中可互换地使用的术语"药学上可接受的运载体(carrier)"、"药学上可接 受的稀释剂"、"药学上可接受的赋形剂"、或"药学上可接受的媒介(vehicle)"是指非毒性 的固体、半固体、或液体填料，稀释剂，包封材料，或所有常规类型的制剂辅助剂。药学上可 接受的运载体基本上在采用的剂量和浓度下对接受者是非毒性的，并且与制剂的其他成分 相容。药学上可接受的运载体的数量和性质取决于期望的给予形式。药学上可接受的运载 体是已知的并且可以通过本领域已知的方法制备。参见Faulii Trillo C，"Tratado de Farmacia Galenica"（Ed.Luzan 5，S.A.，Madrid，ES,1993)和Gennaro A，Ed.，"Remington: The Science and Practice of Pharmacy"20版（Lippincott Williams&ffilkins, Philadelphia,PA,US,2003)〇
[0053]如本文中使用的术语"启动子"是指位于多核苷酸序列的上游的作用为控制一种 或多种多核苷酸的转录的核酸片段，并且通过存在的用于以下各项的结合位点而被结构识 别：DNA依赖的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列，包括(但不限于） 转录因子结合位点、抑制子和激活蛋白结合位点，以及任何其他本领域已知的直接或间接 作用以调节来自启动子的转录的量的核苷酸的序列。"组织特异"启动子是指仅在特定类型 的分化细胞或组织中具有活性的启动子。
[0054]如本文中使用的术语"多核苷酸"是指含有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核酸 分子，DNA或RNA。核酸可以是双链的、单链的、或含有双链或单链序列二者的部分。术语"多 核苷酸"包括，但不限于具有编码与细胞或其中治疗的受试者的内源多核苷酸部分或全部 互补的多肽和核酸序列，从而遵循其转录的能力的核酸序列，其产生能够杂交和抑制内源 多核苷酸的表达的RNA分子(例如，m i croRNA、shRNA、s i RNA)。
[0055] 如本文中使用的术语"转录后调控区"是指促进包含于表达框或得到的基因产物 中的含有的序列的表达、稳定、或定位的任意多核苷酸。
[0056] 如本文中使用的术语"预防（prevent)"、"预防的（preventing)"和"预防 (prevention)"是指抑制受试者中疾病的开始或降低其发生率。预防可以是彻底的（例如， 受试者中完全没有病理细胞)或部分的。预防还指减少对临床状态的易感性。
[0057]如本文中使用的术语"重组病毒基因组"是指其中至少一种外源表达框多核苷酸 插入至自然产生的AAV基因组中的AAV基因组。
[0058]如本文使用的术语"rep基因"或"AAV rep基因"是指编码Rep蛋白的基因。如本文 中使用的术语"Rep蛋白"是指具有至少一种天然AAV Rep蛋白（例如Rep 40、52、68、78)的功 能活性的多肽。Rep蛋白（例如Rep 40、52、68、78)的"功能活性"是与该蛋白的生理功能相关 的任何活性，包括通过识别促进DNA的复制，连接和切口（平切，nicking)DNA复制的AAV原点 以及DNA解旋酶活动。另外的功能包括调节来自AAV的（或其他异源的）启动子的转录并将 AAV DNA位点特异地整合至宿主染色体中。
[0059] 如本文中使用的术语"受试者"是指个体、植物、或动物，如人类、非人类灵长类(例 如，黑猩猩和其他类人猿和猴子物种）、家畜（例如，禽类、鱼类、牛、绵羊、猪、山羊和马）、或 实验动物(例如，啮齿动物，如小鼠(mice)、大鼠（rat)和豚鼠）。该术语不表示特定的年龄或 性别。术语"受试者"包含胚胎和胎儿。
[0060] 如本文中使用的术语"全身给予的"和"全身给予"是指将本发明的多核苷酸、载 体、多肽、或药物组合物以非局部的方式给予受试者。本发明的多核苷酸、载体、多肽、或药 物组合物的全身给予可以达到受试者的整个身体的多个器官或组织，或可以达到受试者的 特定器官或组织。例如，本发明的药物组合物的静脉给予可以产生受试者中多于一个组织 或器官的转导。
[0061] 如本文中使用的术语"转录调控区"是指能够调节一种或多种基因的表达的核酸 片段。本发明的多核苷酸的调控区包括启动子和增强子。
[0062] 如本文中使用的术语"转导（transduce)"或"转导（transduct ion)"是指借其将外 来的核苷酸序列通过病毒载体引入细胞的过程。
[0063]如本文中使用的术语"转染"是指将DNA引入受体真核细胞。
[0064]如本文中使用的术语"治疗（treat)"或"治疗（treatment)"是指给予本发明的化 合物或组合物以在疾病的临床征象出现之后控制其进展。控制疾病进展理解为是指有利的 或期望的临床结果，其包括但不限于:症状的减少、疾病持续时间的减少、病理状态的稳定 (特别地，避免另外的恶化）、推迟疾病的进展、改善病理状态并缓解(部分和全部二者）。与 如果不应用治疗的预期存活相比，疾病的进展的控制还包括延长存活。
[0065]如本文中使用的术语"2型糖尿病"是指表征为不适当的血糖水平增加的疾病。糖 尿病的慢性高血糖与不同器官的长期损伤、功能障碍和失效相关，同时导致各种并发症，如 视网膜病、肾病和周围神经病。2型糖尿病是由外围组织（主要是骨骼肌、脂肪组织和肝脏） 的胰岛素耐受性和由于降低的细胞团和功能的组合导致的不适当的补偿性胰岛素分泌 响应所引起的。除了葡萄糖浓度增加，胰岛素作用欠缺经常导致胆留醇或甘油三酯水平的 增加。
[0066] 如本文中使用的术语"血管生成"是指源自未分化的或分化中的细胞的血管的形 成、生长、发育或增殖。
[0067] 如本文中使用的术语"载体(vector)"是指能够将一种或多种感兴趣的多核苷酸 递送，并且可选地表达至宿主细胞的结构。载体的实例包括但不限于：病毒载体、裸DNA或 RNA表达载体、质粒、粘粒(cosmid)或菌体载体、与阳离子缩合剂(condensing agents)关 联的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞，如生产细 胞(producer cell)。载体可以是稳定的并且可以自身复制。关于可以使用的载体的类型没 有限制。载体可以是克隆载体，适用于繁殖和获得结合至多种异源生物体的多核苷酸、基因 结构或表达载体。适合的载体包括原核表达载体(例如pUC18、pUC19、Blue SCript和它们的 衍生物）、1^18、1^19、？81?322、？]\?9、(：〇此1、？0?1、1^4、噬菌体和穿梭载体（例如，？3厶3和 pAT28)，和基于病毒载体的真核表达载体(例如，腺病毒、腺相关病毒以及逆转录病毒和慢 病毒），以及非病毒载体，如pSilencer 4. l_CMV(Ambi〇nK，Life Technologies Corp·， Carslbad，CA，US)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/ HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVU^pKSV-10、 pBPV-l、pML2d和pTDTl。
[0068] 如本文中使用的术语"VEGF"是指血管内皮生长因子。"VEGF"包括但不限于VEGF变 体A、B、C、D、E和F。参见Hamawy A等，Curr · Opin · Cardiol · 1999; 14:515_522、Neufeld G等， Prog.Growth Factor Res.1994;5:89_97、01ofsson B等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996; 93: 2576-2581、Chi lov D等，J. Biol .Chem. 1997; 272 : 25176-25183 和Olofsson B等， Curr · Opin · Biotechnol · 1999 ; 10 : 528-535。VEGF变体包括，但不限于异形体VEGFi64、 VEGFm、VEGF145、VEGFi67、VEGFi65、VEGF·和VEGF2Q6。参见Tischer E等，J · Biο 1 · Chem· 1991; 266:11947-11954和Poltorak Z等，J · Biol · Chem· 1997; 272:7151-7158。术语 "VEGF" 还包括 血管通透因子或血管调理素（促血管生成素，vasculotropin) (VPF)。参见Keck P等， Science 1989;246:1309-1312和Senger D等，Science 1983;219:983-985JPF目前在本领 域中已知为VEGF A。也可以使用VEGF家族的其他成员，包括胎盘生长因子PIGF I和II。适合 的VEGF的序列是容易获得的（例如，国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/June 2012) 〇例如，人类 VEGF家组成员的基因座（loci )包括：VEGF-A-P15692和NP003367 ; VEGF-B-NP003368、 P49765、AAL79001、AAL79000、AAC50721、AAB06274和AAH08818;VEGF-C-NP005420、P49767， S69207、AAB36425和CAA63907;VEGF-D-NP004460、AAH27948、043915、CAA03942和BAA24264; VEGF-E-AAQ88857;VEGF-F-2VPFF;PIGF-1-NP002623、AAH07789、AAH07255、AAH01422、 P49763、CAA38698和CAA70463;PIGF-1 的链A-1FZVA和链B-1FZVB的合成结构；以及PIGF-2-AAB25832和AAB30462。优选地，VEGF是人类来源的。然而，根据本发明也可以使用来自其他 物种，如小鼠的VEGF。
[0069] 如本文中使用的术语"白色脂肪组织相细胞"或"白色脂肪细胞"是指多面体至球 形，并且含有较大的，由薄层的细胞质围绕的"单室"脂质液滴的脂肪细胞的类型。所述细胞 的细胞核是扁平的并且位于外周。白色脂肪细胞的直径在根据库部位在30和70μπι之间的范 围内变化。存储的脂肪处于半液体状态，并且主要由甘油三酯和胆固醇酯组成。白色脂肪细 胞分泌多种肽和蛋白，统称为脂肪因子，如抵抗素、脂连素和瘦素。
[0070] 如本文中使用的术语"土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件"或"WPRE"是指当转录时 产生能够增强基因表达的三级结构的DNA序列。参见Lee Y等，Exp. Physiol. 2005 ;90(1): 33-37和Donello J等，J·Virol·1998;72(6):5085-5092。
[0071] 如本文中使用的术语"m i c r 〇 RNA"或"m i RNA"是涉及在转录后水平下RNA介导的基 因沉默的小型（~22-nt)的、进化保守的调控RNA。参见Barte 1 DP. Ce 11 2004; 116 : 281 -297。通过与互补区域（最常在细胞信使RNA(mRNA)的3 '未翻译区（3 'UTR))的碱基配对， miRNA可以起抑制mRNA翻译，或在高序列同源性时，造成mRNA的催化解聚。由于许多miRNA高 度分化的组织表达，可以采用细胞miRNA以介导基因治疗载体的组织特异定位。通过病毒载 体内的与组织特异miRNA(miRT)完全互补的靶元件的工程串联拷贝，可以高效抑制在不期 望的组织中的转基因表达。
[0072] 2.提供脂肪组织特异表达的腺相关病毒载体
[0073] 在第一方面，本发明涉及腺相关病毒(AAV)载体，包含重组病毒基因组，其中，所述 重组病毒基因组包含表达框，该表达框包含可操作地连接至感兴趣的多核苷酸的脂肪组织 特异的转录调控区。
[0074] 根据本发明的AAV包括已知的AAV的42种血清型中的任何血清型。通常，AAV的血清 型具有在氨基酸和核酸水平具有显著同源性的基因组序列，提供等同的系列的遗传功能， 产生在物理和功能方面实质相同的病毒粒子，并且通过实际上相同的机制复制和装配。特 别地，本发明的AAV可以属于血清型1的44￥(44￥1)、44￥2、44￥3(包括类型34和38)、4六￥4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、鸟类 AAV、牛类 AAV、犬类 AAV、马类 AAV、羊类 AAV 和任何其他的AAV。不同的AAV血清型的基因组序列的实例可以在文献中或在公开数据库， 如 GenBank 中找到。参见 GenBank 登录号 AF028704.1(AAV6)、NC006260(AAV7)、NC006261 (AAV8)和AX753250.1(AAV9)。在优选的实施方式中，本发明的腺相关病毒载体选自由AAV6、 AAV7、AAV8和AAV9血清型所组成的组中的血清型。
[0075]根据本发明的AAV的基因组通常包含顺式作用的5'和3'末端反向重复序列和表达 框。参见Tijsser P，Ed.，，"Handbook of Parvoviruses"（CRC Press，Boca Raton，FL，US， 1990，pp. 155-168) <JTR序列为约145bp长。虽然这些序列一定程度的小部分修改是允许的， 优选地将基本整个编码ITR的序列用于分子。用于修改这些ITR序列的方法是在本领域中已 知的。参见Brown T，"Gene Cloning"（Chapman&Hall，London，GB，1995)、Watson R等， "Recombinant DNA"，第2版（Scientific American Books，New York，NY，US，1992)、 Alberts B等，"Molecular Biology of the Cell"（Garland Publishing Inc·，New York， NY，US，2008)、Innis M等，Eds.，"PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications"）Academic Press Inc ., San Diego，CA，US，1990)、Erlich H，Ed.，"PCR Technology.Principles and Applications for DNA Amplification"（Stockton Press， New York，NY，US，1989)、Sambrook J等，"Molecular Cloning.A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，US，1989)、Bishop T 等，"Nucleic Acid and Protein Sequence.A Practical Approach"（IRL Press，Oxford， GB，1987)，Reznikoff W，Ed·，"Maximizing Gene Express ion"（Butterworths Publishers,Stoneham,MA,US,1987),Davis L等，"Basic Methods in Molecular Biology"（Elsevier Science Publishing Co.，New York，NY，US，1986^PSchleefM，Ed·， "Plasmid for Therapy and Vaccination"（Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，DE， 2001)。在优选的实施方式中，AAV重组基因组包含5'和3'AAV ITR。在另一实施方式中，5'和 3'AAV ITR源自AAV2。在更加优选的实施方式中，AAV重组基因组缺少rep开放阅读框和cap 开放阅读框。在一种实施方式中，选择AAV2ITR以生成假型AAV(即具有衣壳和源自不同血清 型的ITR的AAV)。
[0076]本发明的多核苷酸可以包含源自任一AAV血清型的ITR。在优选的实施方式中，ITR 源自AAV2血清型。
[0077]本发明的AAV包含来自任何血清型的衣壳。在特定的实施方式中，该衣壳源自由以 下所组成的组中的AAV: AAV 1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。在优选的实施方式 中，本发明的AAV包含源自AAV8或AAV9血清型的衣壳。在另一优选的实施方式中，AAV衣壳的 VP1序列具有序列表SEQ ID从).18。参见661^3他登录号4￥530579。
[0078] 在一些实施方式中，用于本发明的方法的AAV Cap可以通过突变（即通过插入、删 除、或替代)上述AAV Cap或其编码核酸之一产生。在一些实施方式中，AAV Cap与上述的一 种或多种AAV Cap至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%相似。
[0079]在一些实施方式中，AAV Cap是嵌合的，包含来自两种、三种、四种、或更多种前述 AAV Cap的结构域。在一些实施方式中，AAV Cap是来源自两种或三种不同的AAV或重组AAV 的VP1、VP2和VP3单体的嵌合体。在一些实施方式中，rAAV组合物包含多于一种的前述Cap。
[0080] 在一些实施方式中，将用于rAAV组合物中的AAV Cap设计为含有异源序列或其他 修饰。例如，可以将赋予选择性定位或免疫逃避的肽或蛋白序列引入至Cap蛋白。可替代地 或另外地，Cap可以化学改性使得rAAV的表面是聚乙二醇化SEQ ID N0.(即聚乙二醇修饰 的），其可以促进免疫逃避。Cap蛋白还可以是诱变的（例如去除其天然受体结合，或掩盖免 疫原表位）。
[0081] 在另一特定的实施方式中，AAV载体是假型AAV载体（即该载体包含来源自至少两 种不同AAV血清型的序列或组件）。在特定的实施方式中，假型AAV载体包含源自一种AAV血 清型（例如AAV2)的AAV基因组，和至少部分源自不同的AAV血清型的衣壳。这种假型AAV载体 的特定的实例包括，但不限于包含源自任何AAV血清型（例如来自AAV1至AAV11)的基因组， 在源自AAV6、AAV7、AAV8、或AAV9的衣壳中的载体。
[0082] 在一种实施方式中，AAV载体包含一个启动子，其中，加入至少一种miRNA的至少一 个靶序列，该miRNA可以选自以下列表:miR122(miRBase数据库登录号MI0000442)、miR152 (MI0000462)、miR199(MI0000242)、miR215(MI0000291)、miR192(MI0000234)、miR148a (MI0000253)、miR194(MI0000488)、miRl(MI0000651)、miRT133(MI0000450)、miR206 (MI0000490)、miR208(MI0000251)、miR124(MI0000443)、miR125(MI0000469)、miR216 (MI0000292)、miR130(MI0000448)。参考序列已经获得自 miRBase(根据31/07/2013 的版本， http://www.mirbase.org/)〇
[0083] 在一种实施方式中AAV载体含有一个启动子，其中加入至少一种可以选自以下列 表的miRNA靶序列：
[0084] 列表 1
[0085] miRT122a(5，CAAACACCATTGTCACACTCCA3,）、
[0086] miRT152(5，AGTCACGTACTGTCTTGAACC3,）、
[0087] miR199a-5p(5'GGGTCACAAGTCTGATGGACAAG3'）、
[0088] miR99a-3p(5'TGTCATCAGACGTGTAACCAAT3'）、
[0089] miRT215(5，TACTGGATACTTAACTGTCTG3,）、
[0090] miRT192(5，GGCTGTCAATTCATAGGTCAG3,）、
[0091 ] miRT194(5'ACATTGTCGTTGAGGTACACCT3'）、
[0092] miRTl(5'TTACATACTTCTTTACATTCCA3'）、
[0093] mirT148(5，AGTCACGTGATGTCTTGAAACA3,）、
[0094] mirT133a(5'AAACCAGGGGAAGTTGGTCGAC3'）、
[0095] miRT206(5'ACCTTACATTCCTTCACACACC3'）、
[0096] miRT124(5'ATTCCGTGCGCCACTTACGG3'）、
[0097] miRT125(5'AGGGACTCTGGGAAATTGGACACT3'）、
[0098] miRT216(5，ATTAGAGTCGACCGTTGACACT3,）、
[0099] miRT130(5'GTCACGTTACAATTTTCCCGTA3'）。
[0100] 在一种实施方式中AAV载体含有一个启动子，其中加入至少一个具有与选自以上 提及的列表1的miRNA靶序列85%同源的miRNA靶序列。
[0101] 在一种实施方式中AAV载体含有一个启动子，其中加入至少一个具有与选自以上 提及的列表1的miRNA靶序列功能等效的miRNA靶序列。在这种情况下，术语功能等效物是指 能够与相同的miRNA结合的任何核苷酸序列，该miRNA与原始序列结合。例如，miRT122a的功 能等效物是与相同的miRNA杂交的任意序列，该miRNA与mirT122a杂交。
[0102] 功能等效的核昔酸序列保持了参考mirT序列的相关生物活性。这是指mirT的功能 等效物具有，以与参考mirT序列相同的方式在不期望的组织中抑制转基因表达的能力。 [0 103] 在另一特定的实施方式中，miRNA革巴序列可以选自mirT122a(5' CAAACACCATTGTCACACTCCA3 '），参考为序列表 SEQ ID NO : 1 9 或 m i r T 1 ( 5 ' TTACATACTTCTTTACATTCCA3'），参考为序列表SEQ ID N0:20。
[0104] 转录调控区可以包含启动子，以及可选地增强区域。优选地，该启动子是对脂肪组 织特异的。增强子对脂肪组织不需要是特异的。可替代地，转录调控区可以包含脂肪组织特 异的启动子和脂肪组织特异的增强子。
[0105] 在一种实施方式中，组织特异的启动子是脂肪细胞特异的启动子，例如脂肪细胞 蛋白2(aP2,也称作脂肪酸结合蛋白4(FABP4))、PPARy启动子、脂连素启动子、磷酸烯醇丙酮 酸羧激酶(PEPCK)启动子，该启动子源自人芳香酶细胞色素 p450(p450arom)，或Foxa-2启动 子。参见Graves R等，Genes Dev.l991;5:428_437、Ross S等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990;87:9590-9594、Simpson E等，US 5,446，143、Mahendroo Μ等，J.Biol.Chem.1993; 268:19463-19470、Simpson E等，Clin.Chem. 1993;39:317-324和Sasaki H等，Cell 1994; 76:103-115。在优选的实施方式中，增强子区选自由脂肪特异aP2增强子和脂肪特异UCP1增 强子组成的组。
[0106]在优选的实施方式中，根据本发明的AAV的脂肪组织特异调控区包含脂肪特异aP2 增强子和aP2基本启动子（基本aP2启动子，basal ap2 promoter)。参见Rival Y等， J. Pharmaco 1. Exp. Ther. 2004:311 (2): 467-475。该包含脂肪特异aP2增强子和aP2基本启动 子的区域也称为"mini/aP2调控区"，并且是由aP2基因的基本启动子和所述aP2基因的脂肪 特异增强子形成的。优选地，aP2启动子是鼠类的。参见Graves R等，Mol. Cell Biol. 1992; 12(3): 1202-1208和Ross S等，Proc .Natl .Acad· Sci .USA 1990 ;87:9590-9594。在特定的实 施方式中，mini/aP2调控区具有序列表SEQIDN0:2的序列。
[0107] 在另一优选的实施方式中，根据本发明的AAV的脂肪组织特异调控区包含脂肪特 异UCP1增强子和UCP1基本启动子(基本UCP1启动子，basal UCP1 promoter)。参见del Mar GonzMez-Barroso Μ等，J. Biol. Chem. 2000; 275(41 ) :31722-31732 和Rim J等， J.Biol.Chem.2002;277(37):34589-34600。包含脂肪特异UCP1增强子和UCP1基本启动子的 该区域也称为"mini/UCP调控区"并且是指UCP1基因的基本启动子和所述UCP1基因的脂肪 特异增强子的组合。优选使用大鼠 UCP1启动子。参见Larose M，等，J.Biol.Chem. 1996;271 (49) :31533-31542和Cassard-Doulcier A等，Biochem.J. 1998;333:243-246。在特定的实 施方式中，mini/UCPl调控区具有序列表SEQ ID N0:3的序列。
[0108] 在另一实施方式中，组成本发明的AAV的部分的表达框进一步包含表达控制序列， 其包括但不限于适当的转录序列（即起始、终止、启动子和增强子）、有效的RNA加工信号(例 如，剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号）、稳定细胞质mRNA的序列、增强翻译效率的序列（即 Kozak共有序列）、增强蛋白稳定性的序列、以及当需要时，增强编码的产物的分泌的序列。 非常多的表达控制序列，包括天然的、组成的、诱导的、或组织特异的启动子是本领域中已 知的并且可以根据本发明利用。
[0109] 在另一实施方式中，构成本发明的AAV的部分的表达框进一步包含转录后调控区。 在优选的实施方式中，该转录后调控区是土拨鼠肝炎病毒转录后区(WPRE)或其功能变体和 片段，以及PPT-CTS或其功能变体和片段。参见Zufferey R等，J. Virol. 1999; 73:2886-2892 和Kappes J等，W0 2001/044481。在特定的实施方式中，该转录后调控区是WPRE。
[0110] 构成根据本发明的AAV的部分的表达框包含"感兴趣的多核苷酸"。在优选的实施 方式中，该感兴趣的多核苷酸编码作用于全身的蛋白。在另一实施方式中，感兴趣的多核苷 酸编码作用于脂肪细胞或其附近区域的蛋白。在优选的实施方式中，作用于所述脂肪细胞 或其附近区域的蛋白是己糖激酶(HK)，包括相对于不同的底物，在亚细胞位置和动力学上 不同的任意四种哺乳动物HK同功酶（EC 2.7.1.1)。例如，HK包括HK1 (GenBank登录号 陬000179、陬277031、陬277032、陬277033、陬277035)、冊2(66诎31^登录号陬000180)、邢3 (GenBank 登录号 NP002106)和 HK4 或葡糖激酶（GenBank 登录号 ΝΡ000153、NP277042、 NP277043)。在另一优选的实施方式中，HK是葡糖激酶，其在本文中与己糖激酶4或HK 4可互 换地使用，并且指具有HK1、HK2、或HK3的100倍高的葡萄糖的Km的己糖激酶的异形体。
[0111] 在实施方式中，作用于所述脂肪细胞或其附近区域的蛋白是碱性磷酸酶(AP)，包 括但不限于肠类或IAP (GenBank登录号ΝΡ001622)、胎盘类或PLAP (GenBank登录号 NP001623)和非组织特异同功酶或ALPL(GenBank登录号即000469、即001120973.2和 NP001170991.1)。在另一实施方式中，作用于所述脂肪细胞或其附近区域的蛋白是VEGF，包 括但不限于VEGF变体A、B、C、D、E和F。
[0112] 在另一实施方式中，感兴趣的多核苷酸编码通常产生的并且由脂肪细胞分泌的多 肽。在另一实施方式中，由脂肪细胞产生并分泌的多肽是脂肪酶(例如特别地，丝氨酸蛋白 酶同系物的脂肪酶）、脂连素、瘦素、抵抗素、或肥胖基因（〇b gene)的蛋白产物。
[0113] 其他还有用的感兴趣的多核苷酸包括编码激素以及生长和分化因子的那些，包 括，但不限于胰岛素、高血糖素、生长激素（GH)、甲状旁腺素（PTH)、生长激素释放因子 (GRF)、促卵泡激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管生成素、 血管抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、 血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和IKIGF-I和TGF-II)、转化生长因子超家族 中的任一种，包括TGFa、活化素、抑制素、或骨形态发生蛋白（BMP)BMP 1-15中的任一种、生 长因子的调节蛋白（heregluin)/神经调节蛋白/ARIA/Neu分化因子(NDF)家族中的任一种、 神经生长因子(nerve growth factor) (NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白 NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF)、神经生长因 子(neurturin)、聚集蛋白（agrin)、臂板蛋白（semaphorins)/崩溃蛋白家族的任一种、神经 突起导向因子（netrin)-l和神经突起导向因子-3、肝细胞生长因子（HGF)、肝配蛋白 (ephrin)、头蛋白（noggin)、音猜因子(sonic hedgehog)和酪氨酸羟基化酶。
[0114] 其他有用的感兴趣的多核苷酸包括编码调节免疫系统的蛋白的那些，包括，但不 限于细胞因子和淋巴细胞活素，如血小板生成素 (ΤΡ0)、白细胞介素（IL)IL-l至IL-25(例如 IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺 激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素 α、β和γ、干细胞因子、flk_2/flt3配体。由免 疫系统生产的基因产物对本发明也是有用的。这些包括，但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、 IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T 细胞受体、I类和Π 类MHC和HLA分子，以及工程化免疫球蛋白以及MHC和HLA分子。有用的基 因产物还包括补体调节蛋白，如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白（MCP)、衰变加速因子(MCP)、 CR1、CF2和CD59。
[0115] 其他有用的感兴趣的多核苷酸包括编码激素、生长因子、细胞因子、淋巴细胞活 素、调节蛋白和免疫系统蛋白的受体中任一种的那些。本发明包含用于胆留醇调节或脂调 节的受体，包括低密度脂蛋白（LDL)受体、高密度脂蛋白（HDL)受体、极低密度脂蛋白（VLDL) 受体和清道夫受体。本发明号也包含基因产物，如包括糖皮质激素受体和雌激素受体、维生 素受体和其他核受体的类固醇激素受体总家族成员。此外，有用的基因产物包括转录因子， 如加11、;1^〇8、11^、1]^(1、血清效应因子（31^)、4?1、4?2、111713、]\^〇0和肌细胞生成素、包含蛋白的 ETS盒（ETS-box containing protein)、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、 HNF_4、C/EBP、SP1、CCAAT盒结合蛋白（CCAAT-box binding protein)、干扰素调节因子 (IRF-1)、肾胚细胞瘤(Wilms tumor)蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白（例如GATA-3)和翼状螺旋蛋白（winged helix protein)的叉头(forkhead)家族。
[0116] 其他有用的感兴趣的多核苷酸包括编码以下酶的那些，如氨基甲酰基合成酶I、鸟 氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、富马酰乙酰乙酸水解 酶、苯丙氨酸羟化酶、α-l抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨基酶、胱硫醚 (cystathione )β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-辅酶Α脱氢酶、丙酰辅酶Α羧化酶、 甲基丙二酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸盐羧化酶 (pyruvate carboxylate)、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、Η蛋白、Τ蛋白、囊性 纤维化跨膜调节子(CFTR)序列和抗肌营养不良蛋白（肌萎缩蛋白，dystrophin)基因产物 (例如，微小肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白）。还有用的基因产物包括用于代替治疗 的酶，如，例如用于治疗溶酶体贮积病的含有甘露糖-6-磷酸酯的酶(例如，编码β-葡糖醛酸 酶(GUSB)的适合的基因）。
[0117] AAV载体的包装尺寸限制限于母体野生型AAV基因组的尺寸，其在基于AAV血清型 的尺寸的范围内（即4087至4767)。参见Wu Ζ等，Mol. Ther. 2010; 7(1): 80-86。例如，野生型 AAV02具有4679的基因组尺寸并且野生型AAV-6具有4683的基因组尺寸。在一些实施方式 中，重组体RNA载体的克隆容量可能受限并且期望的编码序列可能涉及完全替换病毒的4.8 千碱基基因组。因此大的基因在一些情况下可能不适用于标准的重组AAV载体。技术人员应 该理解的是用于克服受限的编码容量的选项是在本领域中可获得的。例如，可以将两个基 因组的AAV ITR退火以形成头接尾的串连体(concatamer)，几乎加倍载体的容量。剪接位点 的插入使得ITR从转录物中去除。其他用于克服受限的克隆容量的选项对于技术人员是显 而易见的。
[0118] 3.基于AAV6、AAV7、AAV8和AAV9对脂肪组织的嗜性的治疗方法
[0119] 在第二方面中，本发明公开了能够高效转导脂肪组织细胞的AAV6、AAV7、AAV8和 AAV9血清型的腺相关病毒载体。该特征使得开发用于治疗需要或可以受益于脂肪细胞中感 兴趣的聚核苷酸的表达的疾病的方法成为可能。特别地，此发现通过将本发明的AAV载体给 予至患者，促进感兴趣的多肽递送至需要其的受试者，从而产生能够表达感兴趣的多核苷 酸并在体内编码多肽的脂肪细胞。如果编码的多肽是分泌的多肽，其可以由脂肪细胞分泌， 使得以这种方式全身递送该多肽。
[0120]因此，在另一实施方式中，本发明提供了包含重组病毒基因组的腺相关病毒载体 以用于需要感兴趣的聚核苷酸的表达的疾病的治疗或预防，其中，所述重组病毒基因组包 含表达框，该表达框包含与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的转录调控区，其中，AAV的血 清型选自由AAV6、AAV7、AAV8和AAV9组成的组。
[0121] 在另一实施方式中，本发明提供了包括重组病毒基因组的腺相关病毒载体用于需 要所述感兴趣的多核苷酸的表达的疾病的治疗或预防，其中，所述重组病毒基因组包含表 达框，该表达框包含与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的脂肪组织特异的转录调控区。
[0122] 在另一实施方式中，本发明提供了用于需要感兴趣的多核苷酸在受试者中表达的 疾病的治疗或预防的方法，其包括将腺相关病毒载体给予所述受试者，该腺相关病毒载体 包含重组病毒基因组，其中，所述重组病毒基因组包含表达框，该表达框包含与感兴趣的多 核苷酸可操作地连接的转录调控区，其中AAV的血清型选自由AAV6、AAV7、AAV8和AAV9组成 的组。
[0123] 在另一实施方式中，本发明提供用于需要感兴趣的多核苷酸在受试者中表达的疾 病的治疗或预防的方法，其包括将腺相关病毒载体给予至所述受试者，该腺相关病毒载体 包含重组病毒基因组，其中，所述重组病毒基因组包含表达框，该表达框包含与感兴趣的多 核苷酸可操作地连接的脂肪组织特异转录调控区。
[0124] 用于本发明的治疗方法的AAV包含含有感兴趣的多核苷酸和转录调控区的表达 框。转录调控区可以包含启动子，以及可选的增强区域。
[0125] 在一种实施方式中，转录调控区允许感兴趣的多核苷酸的组成型表达。组成型启 动子的实例包括，但不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(可选地带有RSV增强 子）、巨细胞病毒(CMV)启动子(可选地带有CMV增强子）、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动 子、β-肌动蛋白启动子、甘油磷酸激酶(PGK)启动子和EFla启动子。参见Boshart Μ等，Cell 1985;41:521-530。
[0126] 在另一实施方式中，转录调控区包含β-肌动蛋白启动子。β-肌动蛋白启动子可以 源自任何哺乳动物，包括人和啮齿动物，或禽类，包括鸡。优选使用鸡肌动蛋白。
[0127] 在又一实施方式中，转录调控区进一步包含增强子区。优选地，增强子区是CMV增 强子区。
[0128] 在特定的实施方式中，调控区是CAG调控区。在优选的实施方式中，CAG调控区具有 序列表SEQ ID Ν0:1的序列。
[0129] 在另一实施方式中，转录调控区是脂肪组织特异的转录调控区。
[0130] 如果启动子对脂肪组织特异，则增强子不需要也对脂肪组织特异。可替代地，转录 调控区可以包含脂肪组织特异的启动子和脂肪组织特异的增强子。
[0131] 在一种实施方式中，组织特异的启动子是脂肪细胞特异的启动子，如，例如脂肪细 胞蛋白2(aP2,也称作脂肪酸结合蛋白4(FABP4))、PPARy启动子、脂连素启动子、磷酸烯醇丙 酮酸羧激酶(PEPCK)启动子，该启动子源自人类芳香酶细胞色素 p450(p450arom)和Foxa-2 启动子。参见上文的01&￥6 8(1991)、1?〇88(1990)、3;[1]^)8〇11(1]3 5,446，143)、]\^11611(11'〇〇 (1993)、Simpson(1993)和Sasaki(1994)。
[0132] 在一种实施方式中，增强子区选自由脂肪特异aP2增强子和脂肪特异UCP1增强子 组成的组。
[0133] 在优选的实施方式中，根据本发明的AAV的脂肪组织特异调控区包含脂肪特异aP2 增强子和鼠类aP2基本启动子(基本鼠类ap2启动子，basal murine aP2 promoter)。在特定 的实施方式中，mini/aP2调控区具有序列表SEQ ID NO:2的序列。
[0134] 在另一优选的实施方式中，根据本发明的AAV的脂肪组织特异调控区包含脂肪特 异UCP1增强子和大鼠 UCP1基本启动子(基本大鼠 UCP1启动子，basal rat UCP1 promoter)。 在特定的实施方式中，mini/UCPl调控区具有序列表SEQ ID N0:3的序列。
[0135] 在另一实施方式中，表达框进一步包含转录后调控区。在优选的实施方式中，转录 后调控区是WPRE或其功能变体和片段，以及PPT-CTS或其功能变体和片段。
[0136] 其他适合的感兴趣的多核苷酸可以用本发明的AAV载体并且用于疾病的治疗或预 防。参见表1。
[0137] 表1
[0138] 感兴趣的多核苷酸 Γηι^9?
[0140]如本文中使用的术语"需要感兴趣的多核苷酸的表达的疾病"是指任何其中期望 感兴趣的多核苷酸的表达的疾病。如本文中描述的感兴趣的多核苷酸可以是编码感兴趣的 多肽的基因，或可替代地，在转录时产生能够调节细胞中内源多核苷酸的表达的分子的核 酸序列。因此，需要感兴趣的多核苷酸的表达的疾病可以是，其中期望增加或降低基因的表 达水平的疾病。
[0141] 此外，感兴趣的多核苷酸可以编码分泌并作用于全身的蛋白，或作用于脂肪细胞 或其附近区域的蛋白。在特定的实施方式中，需要感兴趣的多核苷酸的表达的疾病是需要 感兴趣的多核苷酸在脂肪组织中，更优选地，在白色脂肪组织或褐色脂肪组织中的表达的 疾病。
[0142] 需要感兴趣的多核苷酸的表达的疾病的实例包括，但不限于肥胖症、高血糖、胰岛 素耐受、2型糖尿病、高血压、癌症、心脏病、免疫性疾病、关节炎、中枢神经系统的疾病和衰 老相关的疾病。
[0143] 已经证明本发明的AAV对脂肪组织相关的疾病的基因治疗是有用的，如在WAT和 BAT二者中由本发明的AAV介导的己糖激酶的递送，以增加基础葡萄糖摄取。参见图2D和4B。 因此在特定的实施方式中，需要调节感兴趣的多核苷酸的表达的疾病是选自由肥胖症、高 血糖、胰岛素耐受性、2型糖尿病和高血压的组成的组中的疾病。
[0144] 示例性的基因与相关的疾病状态包括，但不限于用于治疗糖尿病的胰岛素、用于 治疗囊肿性纤维化的CFTR、用于治疗乙型血友病(hemophilia B)的IX因子、用于治疗甲型 血友病(hemophilia A)的VIII因子、葡萄糖-6-磷酸酶，与肝糖贮积症1A型相关;磷酸烯醇 丙酮酸-羧基酶，与Pepck不足相关;半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，与半乳糖血症相关;苯丙 氨酸羟化酶，与苯丙酮尿症相关;支链α-酮酸脱氢酶，与楓糖尿症相关；富马酰乙酰乙酸水 解酶，与1型酪氨酸血症相关；甲基丙二酰-辅酶Α变位酶，与甲基丙二酸血症相关；中链酰基 辅酶A脱氢酶，与中链酰基辅酶A缺乏症相关;鸟氨酸氨甲酰基转移酶，与鸟氨酸氨甲酰基转 移酶缺之症相关;精氣基瑰?白酸合成酶，与瓜氣酸血症相关;低密度脂蛋白受体蛋白，与家 族性高胆固醇血症相关;UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucouronosyl transferase )，与克 里格勒-纳贾尔症(Crigler-Najjar disease)相关;腺苷酸脱胺酶，与重度联合免疫缺陷疾 病相关;次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶，与痛风(Gout)和Lesch-Nyan综合症相关;生物素 酶，与生物素酶缺乏症相关;葡糖脑苷酯酶，与高歇疾病相关;葡糖醛酸糖苷酶与斯赖 (Sly)综合症相关;过氧化物酶体膜蛋白70kDa，与Zel lweger综合症相关;胆色素原脱氨酶， 与急性间歇性卟啉症相关;α-l抗胰蛋白酶，用于治疗α-l抗胰蛋白酶缺乏症(肺气肿）；红细 胞生成素，用于治疗由于地中海贫血或肾衰竭的贫血;血管内皮生长因子、血管生成素-1和 纤维原细胞生长因子，用于治疗缺血性疾病;血栓调节蛋白和组织因子途径抑制物，用于治 疗如在，例如动脉粥样硬化、血栓、或栓塞中所见的闭塞的血管；芳香族氨基酸脱羧酶 (AADC)和酪氨酸脱羧酶(ΤΗ)，用于治疗帕金森症;β-肾上腺素能受体，受磷蛋白的反义或突 变形式、肌质（内质）网腺苷三磷酸酶_2(SERCA2)和心脏腺苷酸环化酶，用于治疗充血性心 力衰竭;肿瘤抑制基因，如P53,用于治疗各种癌症;细胞因子，如各种白细胞介素之一，用于 治疗炎性和免疫功能失调以及癌症；肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白 (minidystrophin)和肌营养相关蛋白（utrophin)或小肌营养相关蛋白（miniutrophin)用 于治疗肌营养不良；腺苷脱氨酶(ADA)，用于治疗腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症；亨廷顿蛋白 (HTT)，用于治疗亨廷顿氏舞蹈症;低密度脂蛋白受体(LDLR)或脱脂蛋白B(APOB)，用于治疗 家族性高胆留醇血症；苯基丙氨酸羟化酶（PAH)，用于治疗苯丙酮尿症；多囊性肾病变1 (PKD1)和多囊性肾病变2(PKD2)，用于治疗多囊性肾病变;TNFR:Fc，用于治疗关节炎;AAT， 用于治疗遗传性肺气肿;肌聚糖，用于治疗肌肉萎缩症;GAD65或GAD67，用于治疗帕金森氏 病，AAC，用于治疗卡纳万氏病（Canava ' s disease)，CLN2，用于治疗巴滕氏病（Batten ' s disease)，NGF，用于治疗阿尔茨海默氏病;VEGF拮抗剂，用于治疗黄斑变性；IGF/HGF，用于 治疗充血性心力衰竭，NGF，用于治疗中枢神经系统紊乱；以及针对HIV的中和抗体，用于治 疗 HIV、HIV 感染、或 AIDS。
[0145] 可以通过本发明的AAV递送的感兴趣的多核苷酸的实例包括但不限于，己糖激酶、 葡糖激酶、UCP2、UCP3、PPAR-α、瘦素、瘦素受体ΟΒ-Rb和GLP-1。在特定的实施方式中，感兴趣 的基因选自由己糖激酶(HK)、葡糖激酶(GK)、碱性磷酸酶(AP)和血管内皮生长因子(VEGF) 组成的组。在另一种实施方式中，将包含表达己糖激酶或葡糖激酶的多核苷酸的本发明的 AAV给予需要其的受试者用于治疗或预防2型糖尿病。在另一实施方式中，将包含表达血管 内皮生长因子的多核苷酸的本发明的AAV给予需要其的受试者用于治疗或预防肥胖症。
[0146] 可以用本发明的方法治疗的疾病的示例性的，但是非限制性的实例包括肥胖症、 高血糖、胰岛素耐受性、2型糖尿病、高血压和高动脉压。优选地，2型糖尿病可以通过在脂肪 细胞附近区域或全身表达瘦素使其到达下丘脑来治疗。
[0147] 此外，已经证明本发明的AAV对BAT的遗传工程是有用的，因为通过AAV 9-mini/ UCP1的VEGF164的内部iBAT给予导致总VEGF表达水平的增加和iBAT中血管数量增加。参见 图4C-4F。因此，在特定的实施方式中，本发明涉及本发明的AAV或药物组合物用于治疗或预 防需要VEGF表达的疾病，例如对该疾病的管理可以受益于诱导血管生成、动脉生成、或血管 发生的那种疾病。需要VEGF的表达的疾病的实例包括，但不限于急性外科手术和外伤伤口、 烧伤、烫伤、静脉性溃疡、动脉性溃疡、褥疮性溃疡(pressure sore)(又名褥疮(decubitus ulcer))、糖尿病性溃疡、辐射后伤口、皮肤移植、混合病因的溃疡和其他慢性的或坏死性的 伤口。
[0148] 此外，用AAV9_mini/aP2病毒载体的hSeAP基因（即源自人类胎盘的分泌的碱性磷 酸酶)的内部eWAT给予导致hSeAP的循环水平的持续增加。因此，在特定的实施方式中，本发 明涉及本发明的AAV或药物组合物，以用于治疗或预防需要AP的表达的疾病，LPS(即脂多 糖)介导的或恶化的疾病。需要AP的表达的疾病的实例包括，但不限于炎症性肠病、败血症 或脓毒性休克、全身炎症反应综合征(SIRS)、脑膜炎球菌血症、创伤失血性休克、人身伤害 (hum injury)、心血管外科手术或心肺转流术、肝脏手术或移植、肝病、胰腺炎、坏死性小肠 结肠炎、牙周病、肺炎、囊肿性纤维化、哮喘、冠心病、充血性心力衰竭、肾病、溶血性尿毒症、 肾脏透析、癌症、阿尔兹海默氏病和自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼 疮。
[0149] 4.用于体外转导细胞的方法
[0150] 在第三方面，本发明涉及通过使用本发明的AAV载体用于体外转导细胞的方法。因 此，本发明还涉及用于体外转导细胞的方法，包括将所述细胞与包含重组病毒基因组的AAV 接触，其中，所述重组病毒基因组包含表达框，该表达框包含与感兴趣的多核苷酸可操作地 连接的脂肪组织特异的转录调控区。
[0151]在优选的实施方式中，用于体外转导细胞的方法的腺相关病毒载体具有选自由 AAV6、AAV7、AAV8和AAV9血清型所组成的组的血清型。在另一实施方式中，腺相关病毒ITR是 AAV2ITR。
[0152]在另一实施方式中，腺相关病毒载体包含脂肪组织特异的转录调控区。在又一实 施方式中，脂肪组织特异的转录调控区包含选自鼠类aP2基本启动子和大鼠 UCP1基本启动 子组成的组的启动子区。在又一实施方式中，脂肪组织特异的转录调控区进一步包含与启 动子区可操作地连接的增强子区。在又一实施方式中，增强子区选自由脂肪特异aP2增强子 和脂肪特异UCP1增强子组成的组。在更加优选的实施方式中，脂肪组织特异的转录调控区 选自由以下组成的组：
[0153] i)包含脂肪特异aP2增强子和鼠类aP2基本启动子的多核苷酸以及
[0154] i i)包含脂肪特异UCP1增强子和大鼠 UCP1基本启动子的多核苷酸。
[0155] 在另一实施方式中，表达框进一步包含转录后调控区。在又一实施方式中，该转录 后调控区是WPRE。
[0156] 在另一实施方式中，感兴趣的多核苷酸编码选自由作用于全身的分泌蛋白和作用 于所述脂肪细胞或其附近区域的蛋白组成的组中的蛋白。在更优选的实施方式中，感兴趣 的多核苷酸编码选自由己糖激酶、葡糖激酶、碱性磷酸酶和血管内皮生长因子组成的组的 蛋白。
[0157] 在另一实施方式中，本发明涉及用于用包含重组病毒基因组的AAV体外转导细胞 的方法，其中，所述重组病毒基因组包含表达框，该表达框包含与感兴趣的多核苷酸可操作 地连接的转录调控区，其中，AAV的血清型选自由AAV6、AAV7、AAV8和AAV9组成的组。
[0158] 在一种实施方式中，腺相关病毒ITR是AAV2ITR。
[0159] 在另一实施方式中，腺相关病毒载体包含含有转录调控区的重组基因组。在一种 实施方式中，该转录调控区是组成型启动子。在优选的实施方式中，该组成型转录调控区包 含肌动蛋白启动子。在又一实施方式中，该组成型转录调控区进一步包含与启动子区可操 作地连接的增强子区。在更加优选的实施方式中，该增强子区是巨细胞病毒增强子。
[0160] 在一种实施方式中，转录调控区是脂肪组织特异的转录调控区。在又一实施方式 中，脂肪组织特异的转录调控区包含选自由鼠类aP2基本启动子和大鼠 UCP1基本启动子组 成的组的启动子区。在再一实施方式中，脂肪组织特异的转录调控区进一步包含与启动子 区可操作地连接的增强子区。在又一实施方式中，增强子区选自由脂肪特异aP2增强子和脂 肪特异UCP1增强子组成的组。在更加优选的实施方式中，脂肪组织特异的转录调控区选自 由以下组成的组：
[0161] i)包含脂肪特异aP2增强子和鼠类aP2基本启动子的多核苷酸以及
[0162] ii)包含脂肪特异UCP1增强子和大鼠 UCP1基本启动子的多核苷酸。
[0163] 在另一实施方式中，表达框进一步包含转录后调控区。在又一实施方式中，该转录 后调控区是WPRE。
[0164] 在另一实施方式中，感兴趣的多核苷酸编码选自由以下所组成的组的蛋白：作用 于全身的分泌蛋白和作用于所述脂肪细胞或其附近区域的蛋白。在更加优选的实施方式 中，感兴趣的多核苷酸编码选自由己糖激酶、葡糖激酶、碱性磷酸酶和血管内皮生长因子组 成的组的蛋白。
[0165] 使用本发明的体外方法可以转导任何细胞。在特定的实施方式中，AAV用于转导脂 肪组织细胞。在更加优选的实施方式中，脂肪组织细胞是褐色脂肪细胞或白色脂肪细胞。
[0166] 当进行根据本发明的用于转导细胞的体外方法以转导白色脂肪细胞时，AAV内的 转录调控区优选地包含mini/aP2调控区。在另一实施方式中，当进行根据本发明的用于转 导细胞的体外方法以转导棕色脂肪细胞时，AAV内的转录调控区优选地包含表达框，该表达 框包含mini/UCPl调控区。
[0167] 在本发明的另一方面，为改善由mini/aP2和mini/UCPl启动子获得的转基因表达， CAG启动子与组织特异的miRNA靶序列结合使用，以求获得脂肪组织中的高表达水平和由脱 靶器官的去靶转基因表达。这导致当局部或全身给予时，AAV载体遗传性修改脂肪组织的潜 力进一步加强。
[0168] 在另外的实施方式，本发明涉及通过使用本发明的AAV载体并将它们在体外培养 用于分离体内转导的细胞的方法。在另一实施方式中，本发明涉及所述分离的转导细胞以 及该细胞和包含它们的药物组合物。
[0169] 5.转导的脂肪细胞和脂肪细胞细胞组合物，离体治疗方法
[0170] 在第四方面，本发明涉及通过本发明的体外方法获得的脂肪细胞。在另一实施方 式中，本发明涉及包含根据本发明的方法获得的脂肪细胞的细胞组合物。此外，本发明还涉 及包含根据本发明的AAV的基因组的脂肪细胞或脂肪细胞细胞组合物。优选地，至少50%的 细胞组合物包含根据本发明的脂肪细胞。更优选地，至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %和 100%的细胞组合物包含根据本发明的脂肪细胞。
[0171] 如上所述，本发明的AAV可用于体外转导细胞以将感兴趣的多核苷酸引入所述细 胞。接着，可以将转导细胞植入人或动物体内以获得期望的治疗效果。
[0172] 因此，在另一实施方式中，本发明涉及包含根据本发明的方法获得的脂肪细胞的 脂肪细胞或细胞组合物用于在药物中使用。
[0173] 在另一实施方式中，本发明涉及包含根据本发明的方法获得的脂肪细胞的脂肪细 胞或细胞组合物，以用于需要感兴趣的多核苷酸的表达的疾病的治疗。
[0174] 在另一实施方式中，本发明涉及用于治疗或预防疾病的方法，其包括将根据本发 明的方法获得的脂肪细胞或细胞组合物给予至需要其的受试者。可以用此途径解决的疾病 的实例已经在以上本发明的AAV的上下文中限定。
[0175] 6.多核苷酸、载体和质粒
[0176] 在第五方面，本发明涉及对产生根据本发明的AAV有用的多核苷酸。因此，在另一 实施方式中，本发明涉及多核苷酸（"本发明的多核苷酸"），其包含通过腺相关病毒ITR侧接 的表达框，其中，所述表达框包含与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的脂肪组织特异调控 区。
[0177] 在优选的实施方式中，脂肪组织特异的调控区包含选自由鼠类aP2基本启动子和 大鼠 UCP1基本启动子的组的启动子区。
[0178] 在另一实施方式中，脂肪组织特异的调控区进一步包含与启动子区可操作地连接 的增强子区。在更加优选的实施方式中，增强子区选自由脂肪特异aP2增强子和脂肪特异 UCP1增强子组成的组。
[0179] 在另一实施方式中，该调控区选自由以下所组成的组：
[0180] i)包含脂肪的特异aP2增强子和鼠类aP2基本启动子的多核苷酸以及
[0181] ii)包含脂肪特异UCP1增强子和大鼠 UCP1基本启动子的多核苷酸。
[0182] 在另一实施方式中，本发明的多核苷酸的表达框进一步包含转录后调控元件。在 又一实施方式中，转录后调控区是WPRE。
[0183] 在另一实施方式中，包含在本发明的多核苷酸中的感兴趣的多核苷酸编码选自由 己糖激酶、葡糖激酶、碱性磷酸酶和血管内皮生长因子组成的组的蛋白。
[0184] 本发明的多核苷酸可以结合至载体如，例如质粒。因此，在另外的实施方式中，本 发明涉及包含本发明的多核苷酸的载体或质粒。根据本发明，术语"载体"和"质粒"是可互 换的。
[0185] 在特定的实施方式中，本发明的多核苷酸结合至腺相关的病毒载体或质粒。优选 地，所有的其他生产腺相关病毒所需的结构和非结构编码序列不存在于病毒载体中，因为 可以将它们通过另一载体，如质粒，或通过将序列稳定地结合至包装细胞系，以反式提供。
[0186] 本发明的多核苷酸可以使用本领域中已知的分子生物学技术获得。参见上文的 Brown(1995)、Watson(1992)、Alberts(2008)、Innis(1990)、Erlich(1989)、Sambrook (1989)、Bishop( 1987)、Reznikoff( 1987)、Davis( 1986)和Schleef (2001)。在另一实施方式 中，本发明涉及AAV载体，其中，基因组包含本发明的多核苷酸。
[0187] 7.用于获得AAV的方法
[0188] 在第六方面，本发明涉及用于获得本发明的AAV的方法。所述AAV可以通过将本发 明的多核苷酸引入至组成型表达rep和cap的细胞来获得。因此，在另一实施方式中，本发明 涉及用于获得腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：
[0189] i)提供包含由AAV ITR侧接的本发明的多核苷酸、AAV cap蛋白、AAV rep蛋白或 AAV依赖于其复制的病毒或细胞蛋白的细胞，
[0190] ii)将该细胞维持在适合AAV组装的条件下，以及
[0191] iii)纯化由该细胞生产的腺相关病毒载体。
[0192] 在优选的实施方式中，构成本发明的多核苷酸的部分的脂肪组织特异调控区包含 选自鼠类aP2基本启动子和大鼠 UCP1基本启动子的组的启动子区。
[0193] 在另一实施方式中，脂肪组织特异的调控区进一步包含与启动子区可操作地连接 的增强子区。在更加优选的实施方式中，增强子区选自由脂肪特异aP2增强子和脂肪特异 UCP1增强子组成的组。
[0194] 在另一实施方式中，该调控区选自由以下所组成的组：
[0195] i)包含脂肪的特异aP2增强子和鼠类aP2基本启动子的多核苷酸以及
[0196] ii)包含脂肪特异UCP1增强子和大鼠 UCP1基本启动子的多核苷酸。
[0197] 在另一实施方式中，本发明的多核苷酸的表达框进一步包含转录后调控元件。在 又一实施方式中，该转录后调控区是WPRE。
[0198] 在另一实施方式中，包含在本发明的多核苷酸中的感兴趣的多核苷酸编码选自由 己糖激酶、葡糖激酶、碱性磷酸酶和血管内皮生长因子组成的组的蛋白。
[0199] 用于载体化转基因的重组AAV(rAAV)的生产已经在前文描述。参见Ayuso E等， Curr.Gene Ther.2010;10:423-436、0kada T等，Hum.Gene Ther.2009;20:1013-1021、 Zhang Η等，Hum .Gene Ther. 2009; 20:922-929 和 Virag T等，Hum .Gene Ther. 2009; 20:807-817。可以使用或修改这些实验报告以生成本发明的AAV。在一种实施方式中，将生产细胞系 用本发明的多核苷酸(包含由ITR侧接的表达框)以及用编码rep和cap蛋白并且提供辅助功 能的结构暂时转染。在另一实施方式中，生产细胞系稳定地提供辅助功能，并且用本发明的 多核苷酸(包含由ITR侧接的表达框）以及用编码rep和cap蛋白的结构暂时转染。在另一实 施方式中，细胞系稳定地提供rep和cap蛋白以及辅助功能，并且用本发明的多核苷酸暂时 转染。在另一实施方式中，细胞系稳定地提供rep和cap蛋白，并且用本发明的多核苷酸以及 编码辅助功能的多核苷酸暂时转染。在又一实施方式中，细胞系稳定地提供本发明的多核 苷酸、rep和cap蛋白以及辅助功能。制备并使用这些的方法和其他AAV生产系统已经在本领 域中描述。参见Muzyczka N等，US 5，139,941、Zhou X等，US 5,741，683、Samulski R等，US 6,057，152、Samulski R等，US 6,204,059、Samulski R等，US 6,268,213、Rabinowitz J等， US 6,491，907、Zolotukhin S等，US 6,660,514、aienk T等，US 6,951，753、Snyder R等，US 7,094,604、Rabinowitz J等，US 7，172,893、Monahan P等，US 7,201，898、Samulski R等， US 7,229,823和Ferrari F等，US 7,439,065〇
[0200] 在另一实施方式中，可以通过提供两种可以退火以形成头接尾的串连体的基因组 的AAV ITR来增加 AAV的转基因递送容量。通常，当AAV进入宿主细胞时，含有转基因的单链 DNA由宿主细胞DNA聚合酶复合物转化为双链DNA，其后ITR帮助在细胞核中形成串连体。作 为替代，AAV可以设计为自身互补（sc)的AAV，其使得病毒载体可以在进入靶细胞时绕过第 二链合成的步骤，提供具有更快的，潜在更高的（例如多达100次折叠)转基因表达的scAAV 病毒载体。例如，可以将AAV设计为具有包含两个相连的单链DNA的基因组，该单链DNA分别 编码转基因单元及其补体，其可以随着递送至靶细胞而结合，产出编码感兴趣的转基因单 元的双链DNA。自身互补的AAV已经在本领域中描述。参见Carter B，US 6,596,535、Carter B，US 7,125,717和Takano Η等，US 7,456,683〇
[0201] 已经报告Cap蛋白对宿主嗜性、细胞、组织、或器官特异性、受体使用、侵染效率和 AAV病毒的免疫原性的具有作用。因此，可以考虑以下因素选择用于rAAV的AAV Cap，例如受 试者的种族(例如，人类或非人类）、受试者的免疫状态、受试者的对长期或短期治疗的适应 性、或特定的治疗应用（例如，特定的疾病或失调的治疗，或递送至特定的细胞、组织、或器 官）。在另一实施方式中，rAAV Cap是基于来自两种或三种或更多种的AAV血清型的Cap。在 特定的实施方式中，AAV cap基因源自血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、S AAV9。在优选的实施方式中，AAV cap基因源自血清型AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
[0202] 在一些实施方式中，用于本发明的方法的AAV Cap可以通过诱变（即通过插入、删 除、或替代)前述AAV Cap或其编码核酸之一生成。在一些实施方式中，AAV Cap与前述的一 种或多种AAV Cap相似至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%。
[0203]在一些实施方式中，AAV Cap是嵌合的，包含来自至少两种前述AAV Cap的结构域。 在一些实施方式中，AAV Cap是来自两种或三种不同的AAV或重组AAV的VP1、VP2和VP3单体 的嵌合体。在一些实施方式中，rAAV组合物包含多于一种的前述Cap。
[0204] 在一些实施方式中，将用于rAAV组合物中的AAV Cap设计为包含异源序列或其他 修饰。例如，可以将赋予选择性定位或免疫逃避的肽或蛋白序列设计进入Cap蛋白。可替代 地或另外地，Cap可以化学改性，使得rAAV的表面是聚乙二醇化（即聚乙二醇修饰），其可以 促进免疫逃避。Cap蛋白还可以是诱变的(例如，去除其天然受体结合，或掩盖免疫原表位）。
[0205] 在特定的实施方式中，AAV rep基因源自血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、 AAV7、AAV8和AAV9。在优选的实施方式中，AAV rep和cap基因源自血清型 AAV9〇
[0206] 基因 AAV rep、AAV cap和提供辅助功能的基因可以通过使所述基因结合至载体， 例如质粒，并将所述载体引入细胞而引入至细胞。可以将基因结合至相同的质粒或不同的 质粒。在优选的实施方式中，将AAV rep和cap基因结合至一种质粒并将提供辅助功能的基 因结合至另一种质粒。适用于本发明的方法的包含AAV rep和cap基因的质粒的实例包括 口!11^19和？1^?6。3?载体。参见(：〇1丨8丨？，1]5 6,001，650和1?11886110等，1]5 6，156,30。在优 选的实施方式中，提供辅助功能的基因源自腺病毒。
[0207] 本发明的多核苷酸以及包含AAV rep和cap基因或提供辅助功能的基因的多核苷 酸可以通过使用任何适合的本领域中已知的方法引入细胞。参见Ausubel等，Eds.，"Short Protocols in Molecular Biology"，4th Ed.(John Wiley and Sons,Inc.,New York,NY, US，1997)，上文的Brown( 1995)、Watson( 1992)、Alberts(2008)、Innis( 1990)、Erlich (1989)、Sambrook(1989)、Bishop(1987)、Reznikoff(1987)、Davis(1986)和Schleef (2001)。转染方法的实例包括，但不限于用磷酸钙、DEAE-葡聚糖、聚凝胺共沉淀、电穿孔、显 微注射、脂质体介导的融合、脂转染、逆转录病毒感染和基因枪(bioli stic)转染。在特定的 实施方式中，通过用磷酸钙的共沉淀进行转染。当细胞缺少任何AAV rep和cap基因以及提 供腺病毒辅助功能的基因的表达时，可以将所述基因与本发明第一方面的多核苷酸同时引 入细胞。可替代地，可以将所述基因在引入本发明第一方面的多核苷酸之前或之后引入细 胞。在特定的实施方式中，将细胞与以下三种质粒同时转染：
[0208] 1)包含本发明的多核苷酸的质粒
[0209] 2)包含AAV rep和cap基因的质粒
[0210] 3)包含提供辅助功能的基因的质粒
[0211] 培养包装细胞的方法和促进AAV载体颗粒释放，如产生细胞裂解物的示例性条件， 可以根据本文实施例中所描述地进行。生产细胞生长适合的时段以促进病毒载体释放入介 质。通常，细胞可以成长约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7 天、约8天、约9天、多达约10天。在约10天后(或更快，取决于培养条件和使用的特定的生产 细胞），生产水平通常显著下降。通常，从产生病毒的点测量培养的时间。例如，在AAV的情况 下，通常当在如本文中描述的适当的生产细胞中提供辅助病毒功能时开始病毒产生。通常， 在辅助病毒侵染之后(或开始产生病毒之后）约48至约100,优选地约48至约96,优选地约72 至96,优选地约68至约72小时收获细胞。
[0212] 本发明的AAV可以由：i)用本发明的多核苷酸转染的细胞和ii)转染后一段时间之 后，优选地72小时后的所述细胞的培养基二者获得。可以使用任何用于纯化来自所述细胞 或所述培养基的AAV以获得本发明的AAV。在特定的实施方式中，遵循基于聚乙二醇沉淀步 骤和两个连续的氯化铯(CsCl)梯度的优化方法纯化本发明的AAV。参见上文的Ayuso，2010。 本发明的纯化的AAV可以用PBS渗析，过滤并在-80 °C下储存。病毒基因组的滴度可以通过定 量PCR测定，该测定遵循对于使用线性化的质粒DNA作为标准曲线的AAV2参考标准材料描述 的流程。参见Lock Μ等，Hum.Gene Ther.2010;21:1273-1285。
[0213] 在一些实施方式中，该方法进一步包括纯化步骤，如用核酸酶处理细胞裂解物，在 CsCl梯度上纯化细胞裂解物，或通过硫酸肝素层析纯化细胞裂解物。参见Halbert C等， Methods Mol·Biol·2004;246:201-212。
[0214] 适用于生产AAV的，各种自然发生的和重组的AAV、它们的编码核酸、AAV Cap和Rep 蛋白和它们的序列、以及用于分离或产生、繁殖和纯化这种AAV，以及特别是它们的衣壳的 方法是本领域中已知的。参见上文的63〇,2004、1?11886110等，1]3 6，156,303、!^1(1丨即6『]\1 等，US 7,056,502、Gao G等，US 7，198,951、Zolotukhin S，US 7,220,577、Gao G等，US 7， 235,393、Gao G等，US 7,282，199、Wilson J等，US 7,319,002、Gao G等，US 7,790,449、Gao G等，US 20030138772、Gao G等，US 20080075740、Hildinger M等，TO 2001/083692、Wilson J等，WO 2003/014367、Gao G等，TO 2003/042397、Gao G等，TO 2003/052052、Wilson J等， WO 2005/033321、Vandenberghe L等，WO 2006/110689、Vandenberghe L等，WO 2007/ 127264和Vandenberghe L等，WO 2008/027084。
[0215] 8.药物组合物
[0216] 本发明的AAV可以通过传统方法给予至人或动物体，其需要所述载体在药物组合 物中的制剂。因此，在第七方面，本发明涉及包含AAV的药物组合物（以下称为"本发明的药 物组合物"），其中，所述AAV包含重组病毒基因组，其中，所述重组病毒基因组包含表达框， 该表达框包含与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的脂肪组织特异转录调控区。可替代地， 本发明的药物组合物可以包含本发明的多核苷酸或多肽。
[0217] 所述药物组合物可以包括在治疗上有效量的本发明的AAV和药学上可接受的载体 (carrier)〇
[0218] 本发明的组合物可以配制为用于递送至动物（例如家畜（牛、猪、其他））用于兽医 学目的，以及递送至其他非人类哺乳动物受试者，以及人类受试者。可以用生理学可接受的 载体配制AAV以用于基因转移和基因治疗应用。制剂的剂量可以测量或计算为病毒颗粒或 基因组拷贝（"GC" )/病毒基因组（"vg"）。
[0219] 本领域中已知的任何方法可以用于测定本发明的病毒组合物的基因组拷贝（GC) 数。一种用于进行AAV GC数滴定的方法如下:将纯化的AAV载体样品首先用脱氧核糖核酸酶 处理以除去未壳体化的AAV基因组DNA或来自生产过程的污染质粒DNA。然后使耐脱氧核糖 核酸酶的颗粒经受热处理以从衣壳中释放基因组。随后通过使用靶定病毒基因组的特定区 域的引物/探针组的实时PCR测定释放的基因组的数量。
[0220] 另外，可以以剂量单位配制病毒组合物以包含约1.0X109GC至约1.0X1015GC(以 治疗平均体重70kg的受试者），并且优选地1.0 X 1012GC至1.0 X 1014GC范围内的量的病毒载 体用于人类患者。优选地，制剂中病毒的剂量是1.0X109GC、5.0X10 9GC、1.0X101()GC、5.0 X 1010GC、1 · 0 X 10nGC、5 · 0 X 10nGC、1 · 0 X 1012GC、5 · 0 X 1012GC、1 · 0 X 1013GC、5 · 0 X 1013GC、 1.0X1014GC、5.0X1014GCjl.0X10 15GC〇
[0221] 病毒载体可以以传统方式使用一种或多种生理学上可接受的运载体或赋形剂配 制。AAV可以配置为通过注射（例如，通过弹丸式注射（bolus in jection)或持续输注 (continuous infusion))进行非消化道给予。用于注射的制剂可以以单位剂量(例如，安瓿 瓶或以多剂量容器）的形式存在，其中添加防腐剂。病毒组合物可以采取这些形式，如在油 性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳液，并可以包含配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散 剂。AAV制剂的液体剂型可以通过传统方法，用药学上可接受的添加剂，如悬浮剂(例如，山 梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪）、乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶）、非水媒 介(例如，扁桃仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)和防腐剂(例如，甲基或丙基-对羟基苯 酸酯或山梨酸)来制备。该剂型还可以含有缓冲盐。可替代地，组合物可以是粉末形式，用于 在使用之前与适合的媒介(例如，无菌的无热源的水)组合。
[0222] 还包括了辅剂与本发明的AAV结合或混合使用。预期的辅剂包括，但不限于无机盐 辅剂或无机盐凝胶辅剂、颗粒辅剂、微粒辅剂、粘膜辅剂和免疫刺激辅剂。
[0223] 可以将辅剂作为与本发明的AAV的混合物，或与AAV结合使用给予受试者。
[0224] 本发明的药物组合物可以局部或全身给予。在优选的实施方式中，该药物组合物 在要转导其细胞的组织或器官附近给予。在特定的实施方式中，本发明的药物组合物通过 WAT内部或BAT内部注射局部给予至白色脂肪组织(WAT)或褐色脂肪组织(BAT)中。在另一优 选的实施方式中，本发明的药物组合物全身给予。
[0225] 药物组合物可以根据常规方法配制为适合于静脉注射、皮下、或肌内给予至人类 的药物组合物。注射剂可以以常规形式，作为液体溶液或悬浮液，在注射之前适用于液体中 的溶液或悬浮液的固体形式，或作为乳液制备。必要时，组合物还可以包括，局部麻醉剂，如 利多卡因以便在注射位置止痛。当组合物通过渗透给予时，其可以省去含有药物质量的水 或盐溶液的渗透瓶。当通过注射给予组合物时，可以提供用于注射的水瓶或无菌盐溶液从 而可以在给予之前混合成分。
[0226] 术语"治疗有效量"是指计算以产生期望的效果的本发明的多核苷酸、载体、多肽、 或药物组合物的量，并且总体上连同其它原因，由本发明的多核苷酸、载体、多肽和药物组 合物的自身特征以及要获得的疗效决定。通过本文描述的或本领域另外已知的标准临床技 术测定在疾病的治疗中有效的本发明的多核苷酸、载体、多肽或药物组合物的量。此外，还 可以可选地使用体外测定以帮助确定最佳的剂量范围。在制剂中使用的精确的剂量取决于 给予途径，和病情的严重性，并且应该以医生的判断决定并取决于每个患者的情况。有效剂 量可以推断自来自于体外试验系统或动物中的模型的一对剂量响应曲线。对于全身给予， 治疗有效剂量可以最初由体外试验估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到包括已 经在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。所述信息可用于精确地测定人类中有用的剂 量。首次剂量还可以估计自使用现有技术中已知的技术的体内数据(例如动物模型）。本领 域中的普通技术人员可以容易地基于动物中的数据优化对人类的给予。
[0227] 这种全身给予包括，但不限于任何意味着并不直接注入脂肪组织的给予途径。更 特别地，全身给予包括本发明的多核苷酸、载体、多肽和药物组合物的全身注射，如肌内 (im)、血管内（ie)、动脉内（ia)、静脉内（iv)、腹膜内（ip)、皮下或经皮注射。外周给予还包 括本发明的多核苷酸、载体、多肽和药物组合物的口腔给予，使用植入物递送、或使用喷雾 剂、气雾剂或任何其他适当的制剂通过呼吸系统(例如鼻内）滴注给予。优选地，全身给予是 通过im、ip、ia或iv注射。最优选地，通过iv注射给予本发明的多核苷酸、载体、多肽和药物 组合物。参见During M，W0 1996/040954和Monahan P等，W0 2001/091803。
[0228] 本发明的药物组合物可以以单一剂量给予，或在本发明的特定的实施方式中，可 以采用多次剂量(例如两次、三次、四次、或更多次给予）以达到治疗效果。优选地，当需要多 次剂量时，包含在本发明的药物组合物中的AAV来自不同的血清型。
[0229] 所有上文提及的公开通过引证将它们的整体结合在此。
[0230]虽然已经为了清楚和理解，较详细地描述了前述发明，本领域技术人员通过阅读 本公开应该理解的是，可以在形式和细节上做出各种改变而不偏离本发明和所附权利要求 的真实范围。
[0231 ] -般方法
[0232] 1.受试者特性
[0233] 使用8-12周大的雄性ICR小鼠、9-13周大的C57B1/6J小鼠和8周大的B6.V-Lep° b/ OlaHsd(ob/ob)和BKS · Cg-+Leprdb/+Leprdb/01 aHsd(db/db)小鼠。小鼠用标准食物（Teklad Global【)ietSK，Harlan Labs ·，Inc ·，Madison，WI，US)自由米食，并在光暗周期下（在8: 00a . m .光照）保持12h。对于组织采样，将小鼠通过吸入麻醉异氟烷（丨s〇Fbl:，Abbo11 Laboratories，Abbott Park，IL，US)麻醉并割去头部。切离感兴趣的组织并在-80°C下或使 用甲醛保存直至分析。
[0234] 2.重组AAV载体
[0235] 根据标准方法，通过HEK293细胞的三次转染产生载体。参见上文的Ayuso,2010。在 10个滚瓶中（850cm2，平面；Corning?，Sigma-Aldrich Co·，Saint Louis，M0，US) 10%FBS的 DMEM中培养细胞至80 %细胞覆盖，并通过磷酸钙方法，用携带由AAV2ITR侧接的表达框的质 粒、携带AAV2rep基因和AAV血清型1、2、4、5、6、7、8或9的cap基因的辅助质粒、以及携带辅助 功能腺病毒的质粒共转染。使用的转基因是:a)由以下驱动的eGFP:al)杂交巨细胞病毒增 强子/鸡肌动蛋白组成型启动子(CAG)和WPRE调控元件，a2)鼠 mini/aP 2调控区或a3)小 鼠 mini/UCP1调控区；b)由以下驱动的鼠类己糖激酶II (mΗKII)cDNA: b 1)CΜV遍在启动子 (ubiquitous promoter)和WPRE，b2)鼠 mini/aP2调控区或b3)小鼠 mini/UCPl调控区，c)由 鼠 mini/aP2调控区和WPRE源自人类胎盘的分泌的碱性磷酸酶(hSeAP)，d)由小鼠 mini/UCPl 调控区驱动的鼠类VEGF! 64，和e)由CMV遍在启动子驱动的RFP。参见上文的Ro s s，199 0、 Graves，1992 和 Cassard-Doulcier，1998。使用携带 CMV启动子的非编码质粒（pAAV-MCS， Stratagene?, Agilent Technologies，Inc ·，Santa Clara，CA，US)、mini/aP2调控区或 mini/UCPl调控区以及多克隆位点产生空颗粒。AAV利用基于聚乙二醇沉淀步骤和两个连续 的氯化铯(CsCl)梯度的优化的方法进行纯化。这种第二代的基于CsCl的方法显著地减少了 空AAV衣壳以及DNA和蛋白杂质。参见上文的Ayuso,2010。可以将纯化的AAV载体对roS进行 渗析，过滤并在-80 °C下保存。病毒基因组的滴度通过定量PCR确定，该定量PCR遵循对于使 用线性化的质粒DNA作为标准曲线的AAV2参考标准材料描述的方法。参见Lock Μ等， Hum.Gene Ther.2010;21:1273-1285。根据本领域中已知的分子生物学技术构造载体。参见 上文的Brown( 1995)、Watson( 1992)、Alberts(2008)、Innis( 1990)、Erlich( 1989)、 Sambrook(1989)、Bishop(1987)、Reznikoff(1987)、Davis(1986)和Schleef(2001)〇
[0236] 3.体内AAV载体的eWAT内部给予
[0237] 将小鼠用氯胺酮（lOOmg/kg)和赛拉嗪（lOmg/kg)的腹膜内注射麻醉。进行剖腹术 以暴露附睾的白色脂肪组织。将AAV载体再悬浮于具有或不具有2%普兰尼克？88 0八5? Corp.，Florham Park，NJ，US)的盐溶液中并直接注射入附睾脂垫。每个附睾脂垫用50yL的 AAV溶液注射两次(一次注射接近睾丸并且另一次在脂垫中部）。用无菌盐溶液漂洗腹部并 且用两层方法闭合。
[0238] 4.体内AAV载体的iBAT内部和iWAT内部给予。
[0239]将小鼠用氯胺酮（100mg/kg)和赛拉嗪（10mg/kg)的腹膜内注射麻醉。在肩胛间或 腹股沟区域切开纵向1.5-2cm长的切口，以分别暴露iBAT或iWAT。使用汉密尔顿注射器使每 个iBAT或iWAT接受4次10μ1的AAV溶液的注射将载体分散至整个库。使用一层方法闭合皮 肤。
[0240] 5. AAV载体的全身给予
[0241] 将适量的AAV溶液在200yL的盐溶液中稀释并在递送时手动注射入尾部侧静脉而 不施加压力。在注射之前，将动物置于250W的红外加热灯(Philips NV，Amsterdam，NL)下几 分钟以扩张血管并便于观察且更易达到尾部静脉。使用塑料限制器(Harvard Apparatus， Holliston，MA，US)固定动物用于注射。由于采用适当的限制装置，不使用麻醉。利用30针径 的针对动物注射。
[0242] 6.免疫组织化学
[0243] 将组织在甲醛中固定12至24小时，嵌入石蜡，并切片用于GFP、RFP和α-SMA的检测。 将切片用1:300稀释的羊抗GFP抗体(Abeam pic，Cambridge，MA，US)、用1/400稀释的兔抗 RFP抗体(Abeam pic，Cambridge，MA，US)或用 1/300稀释的鼠抗-α-SMA抗体(Sigma-Aldrich Co.，Saint Louis，M0，US)在4°C下温育过夜。将1:300稀释的生物素化的驴抗山羊抗体 (Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，US)，或 1/300稀释的生物素化的羊抗 兔抗体(Pierce Antibodies，Thermo Fisher Scientific Inc. ,Rockford,IL,US)g!cl/300 稀释的生物素化的马抗鼠抗体(Vector Laboratories，Burl ingame，CA，US)用作第二抗体。 将 1:300稀释的链霉亲和素 Alexa Fluor 488(Streptavidine Alexa Fluor 488) (MolecularPr〇bes_?，Life Technologies Corp.，0&^]^&(1，〇厶，1]3)用作焚光染料并且将 Hoescht bisbenzimide(Sigma-Aldrich Co.，Saint Louis，M0，US)用于细胞核对比染色。 可替代地，使用1:50稀释的ABC过氧物酶试剂盒（Pierce Biotechnology，Inc ·，Rockford， IL，US)并将切片在Mayer的苏木精中对比染色。
[0244] 7 · eWAT样品中β-半乳糖苷酶表达的分析
[0245] 为了检测eWAT中存在的所有β-半乳糖苷酶，将组织样品在4%多聚甲醛中固定lh， 在PBS溶液中洗涤两次，并且然后在5mM K3Fe(CN)5、5mM K4Fe(CN)6和ImM MgCl2的PBS中的X-Gal(5_溴-4-氯-3-β-?-半乳糖苷(galactopyranoside))中在37°C下在黑暗中温育6_8h。
[0246] 8 .GFP 含量
[0247] 为测定GFP含量，将组织在lmL的裂解缓冲液(PBS中，50mM/L Tris、l%Nonidet Ρ40、0·25%脱氧胆酸钠、150mM/L NaCl、lmM/L EDTA，pH 7.4，无菌过滤）中用？〇1)^〇11知型 号组织匀浆器机械破碎并在室温下温育10分钟。温育之后，将样品以14000rpm离心10分钟。 将上层清液移至新管并且用具有488nm激发波长和512nm发射波长的闪光光谱仪FlxSOO (Bio-Tek Instruments，Inc，Winooski，VT，US)测量100yL的该溶液中的GFP含量。通过含有 蛋白的样品校正总GFP含量值。
[0248] 9.来自附睾脂垫的脂肪细胞的分离
[0249] 使用改进的Rodbell的方法分离AAV转导的脂肪细胞。参见Rodbell M， J. Biol. Chem. 1964; 239:375-380。通过去除头部处死异氟烷麻醉的小鼠并将附睾WAT切碎， 并在35-45分钟中在37°C下在含有4%BSA(不含脂肪酸）、0.5mM/L葡萄糖和0.5mg/mL II型 胶原酶（C6885;Sigma_Aldrich Co.，Saint Louis，M0，US)的Krebs-Ringer碳酸氢盐HEPES 缓冲液(KRBH)中消化。通过温和的离心分离脂肪细胞并且用新鲜的不含胶原酶的没有葡萄 糖的KRBH洗涤三次。将脂肪细胞再悬浮于不含葡萄糖的新鲜的KRBH中，并且如先前描述的 估计细胞数。参见DiGirolamo Μ等，Am.J.Physiol 1971;221:850-858。
[0250] 10.RNA 分析
[0251 ] 总RNA通过分别使用QIAzol裂解试剂(Qiagen NV，Venlo，NL)或tripure分离试剂 (Roche Diagnostics Corp ·，Indianapolis，IN，US)，以及RNeasy脂质组织迷你试剂盒 (Lipid Tissue Minikit)由分离的脂肪细胞和脂肪库或肝脏获得。为了除去残留的病毒基 因组，用DNAsel(Qiagen NV，Venlo，NL)处理总RNA。对于RT-PCR，使用Superscript VIL0 cDNA合成试剂组（Invitrogen?，Life Technologies Corp.，0&18]^&(1，〇厶，1]3)逆转录]^区的 RNA样品。在使用EXPRESS SYBRGreen qPCR supermix(InvitrogenTM，Life Technologies Corp ·，Carslbad，CA，US)的 SmartCyclerll (Cepheid，Sunnyvale，USA)中进行实时定量 PCR。正义和反义寡核苷酸引物的序列是：
[0252]
[0253] 数据用36B4值标准化并如先前描述的进行分析。参见Pfaffl M,Nucleic Acids Res·2001;29(9):e45。
[0254] 11.分离的脂肪细胞中的离体葡萄糖摄取
[0255] 对于来自小鼠的分离的脂肪细胞，如先前描述的，在不同的胰岛素浓度下测量2-[1」H]脱氧-D-葡萄糖（2_DG;Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ，USM^ 取。参见Traxinger R等，J. Biol. Chem. 1989; 264:8156-8163。简要地，分离的脂肪细胞通过 来自如之前描述的饲养的小鼠的附睾WAT的胶原酶消化获得。用KRBH+4%BSA(不含脂肪 酸）、lOmMAJ兑氧-葡萄糖、0.4yCi 2-[ 1」H]脱氧-D-葡萄糖和不同的胰岛素浓度温育250yL 的脂肪细胞悬液5分钟。最终，在聚丙稀管中通过硅油(Sigma-Aldrich Co.，Saint Louis， M0，US)分离脂肪细胞和培养基，并且通过液体闪烁计数评估脂肪细胞样品中的放射性。结 果表示为pmol的2-[3H]-DG每10 6细胞每分钟。
[0256] 12.体内葡萄糖摄取
[0257] 如先前描述的测定体内基础葡萄糖利用指数。参见Franckhauser S等，Diabetes 2002; 51:624-630。简要地，将148GBq(4yCi)的不可代谢的葡萄糖类似物，脱氧-D-[ 1，2-3H] 葡萄糖（2_DG;PerkinElmer，Inc ·，胃&11:1^111，]\^，1]3)混合在1334-朽1檬酸盐缓冲液中。在零时 间将放射性同位素标记的混合物的闪烁注射剂(flash injection)给予麻醉的(氯胺酮+赛 拉嗪）饲养小鼠的颈静脉中。如先前描述的，用注射后1、15和30分钟获得的25yL血液样品 (尾部静脉)测定具体的血液2-DG清除率。参见Somogyi M，J.Biol.Chem. 1945; 160:69-73。 在注射后30分钟移除组织样品。葡萄糖利用指数是通过测量放射性标记化合物的积聚测定 的。参见Ferr6P等，Biochem. J. 1985; 228:103-110。将每毫克蛋白的2-DG-6磷酸酯的量除以 测量的2-DG与未标记的葡萄糖的浓缩比的积分。因为值不是由葡萄糖代谢途径中的2-DG的 "判别常数(discrimination constant)"校正的，结果表示为葡萄糖利用的指数，以每分钟 皮摩尔每毫克的蛋白计。
[0258] 13.血液hSeAP水平的测量
[0259] 使用Tropix?Phospha-Light?系统（Applied Biosystems?，Life Technologies Corp.，Carslbad，CA，US)，由5yL的血清测定循环hSeAP水平。
[0260] 14.统计分析
[0261 ] 所有的值表示为平均值土SEM。由学生t检验（Student's t-test)比较组之间的差 值。在P〈〇. 05认为差值是显著的。
[0262] 实施例1
[0263] 通过AAV的局部给予的白色脂肪细胞的体内转导
[0264] 为评估使用AAV载体的白色脂肪组织(WAT)的体内转导效率，将4X1011病毒基因组 (vg)八鼠的AAV血清型1、2、4、5、6、7、8和9 (在遍在启动子CAG控制下编码标记蛋白GFP (AAV-CAG-GFP))，带有或没有非离子表面活性剂普兰尼克F88,双侧注射入小鼠的附睾白色脂肪 组织（eWAT)中。参见Croyle Μ等，Mol · Ther · 2001 ;4: 22-28、Gebhart C等，J.Control Release 2001;73:401_416、Mizukami Η等，Hum.Gene Ther.2006;17:921-928和Sommer J 等，Mol. Ther. 2003; 7:122-128。如由在eWAT中针对GFP的免疫染色所评估的，不带有普兰尼 克F88的AAV1、AAV2、AAV4和AAV5的给予在注射两个星期后导致非常低的白色脂肪细胞转导 的百分比。此外，通过添加普兰尼克F88没有实现由任何测试的血清型介导的脂肪转导效率 的改善。参见图1A。因此，对于随后的实验弃去该非离子表面活性剂的使用。与普兰尼克F88 的添加无关，AAV1比AAV2、AAV4和AAV5在eWAT体内转导中更加高效。参见上文的Mizukami， 2006。与由AAV1转导的少量分散的脂肪细胞和极少的脂肪细胞的组相反，用AAV 6和AAV7注 射的动物表现出多个较大的GFP+白色脂肪细胞的组。此外，用AAV8和AAV9处理的动物示出 了大得多的eWAT的转导，并且每个eWAT区域绝大多数的脂肪细胞被转导。参见图1B。通过荧 光分析的给予两个星期后的eWAT中的GFP含量的定量进一步确认血清型6、7、8和9的AAV比 AAV 1在eWAT体内转导中是更高效的。参见图1C。值得注意的的是用AAV8和AAV9注射的附睾 脂垫表现出最高的GFP含量，并且它们之间没有显著的统计差。参见图1C。在单侧eWAT内部 给予2X10 nvg八鼠的，受遍在CMV启动子控制的编码LacZ基因的AAV8(AA8-CMV-LacZ)两个星 期之后，用LacZ底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)的染色表现出遍及eWAT转 导的脂肪细胞的广泛分布。参见图1D。AA V8和AA V9-CAG-GFP载体局部给予至腹股沟WAT (iWAT)介导了该库(depot)中白色和浅褐色脂肪细胞的大量转导。参见图1G和Η。总而言之， 这些结果表明AAV8和AAV9是体内遗传 WAT最适合的载体。
[0265] 此外，AAV载体的eWAT内部给予导致实际上局限于eWAT的转导。注射两个星期后， 用AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、或AAV9-CAG-GFP处理的动物并没有表现出肠系膜、腹膜后和腹股 沟库的转导，然而少量的GFP+棕色脂肪细胞存在于用AAV9eWAT内部注射的小鼠的iBAT中。 参见图8A。然而，BAT中的转基因表达相比eWAT中检测的极少。参见图8B。关于非脂肪组织的 转导，AAV7、AAV8和AAV9-CAG-GFP的eWAT内部给予还导致显著的转移至肝脏和心脏以及至 较少数量的胰腺的外分泌细胞的基因。参见图8C。
[0266] 作为构思的证明，评估体内AAV转导的脂肪细胞是否可以是研究脂肪功能的可行 的模型，将4 X 10nvg八鼠的，受遍在启动子CMV控制的，编码鼠类的酶的己糖激酶II(mHKII) 的AAV9载体(AAV9-CMV-mHKII)或等剂量的AAV9-CMV-nul 1载体双侧注射入健康小鼠的 e WAT。注射两个星期后，来自用AA V9 -CMV-mHK II处理的动物的分离的脂肪细胞与来自用 AAV9-CMV-nul 1注射的小鼠的脂肪细胞相比表现出mHKII表达的3倍增加。参见图1E。为分析 脂肪细胞中AAV介导的mHKII的过表达，测定离体分离的脂肪细胞摄取的基础和胰岛素刺激 的2-[l」H]脱氧-D-葡萄糖。在AAV9-CMV-mHKII转导的脂肪细胞中基础2-[l」H]脱氧-D-葡 萄糖摄取相比AAV9-CMV-nul 1转导的脂肪细胞略微增加。相反，相比来自用AAV9-CMV-nul 1 载体处理的动物的脂肪细胞，胰岛素刺激导致由AAV9-CMV-mHKII转导的脂肪细胞摄取的2-[1-?]脱氧-D-葡萄糖的增加较大。参见图1F。
[0267] 实施例2
[0268] 白色脂肪细胞的体内AAV介导的特异遗传工程化
[0269] 评估仅由脂肪细胞特异的增强子组成的短版本的鼠类脂肪细胞蛋白2(mini/aP2) 启动子与aP2基本启动子的结合使用。参见上文的Ross，1990和Graves，1992。该试验的目的 是将AAV介导的转基因表达式限定于脂肪细胞。单侧eWAT内部给予10 12vg八鼠的，受mini/aP2 调控区控制的，编码GFP的AAV8和AAV9介导了有限的白色脂肪细胞的转导，并且注射两个星 期后在肝脏和心脏中没有可检测的GFP表达。参见图2A和9。
[0270] 为评估由小鼠中的mini/aP2调控区介导的转基因表达的时间过程，将4X1012vg/ 鼠剂量的，受mini/aP2调控区控制的，编码源自人类胎盘的分泌的碱性磷酸酶(hSeAP)cDNA 的AAV9载体(AAV9-mini/aP2-SeAP)或盐溶液双侧注射入eWAT，并在AAV给予之后不同的时 间点测量循环hSeAP水平。直到AAV递送两个星期之后，检测出高水平的hSeAP，并且逐渐增 加多达40天。此后，循环hSeAP水平维持注射后至少一年的跟踪期间。通过qPCR定量的肝脏 和eWAT中的hSeAP表达水平确认eWAT是负责主要生产hSeAP的组织。参见图2B-2C。
[0271] 为评估AAV介导的白色脂肪细胞的特异的遗传工程化是否可以构成研究小鼠体内 脂肪细胞功能、分化和代谢的新工具，将1.4X10 12vg八鼠的，受mini/aP2调控区控制的，编码 mHKII 的 AAV9 载体(AAV9-mini/aP2-mHKII)或等剂量的 AAV9-mini/aP2-null 载体给予 eWAT。 注射两个星期后，测定体内基础2-[l」H]脱氧-D-葡萄糖摄取。相比用AAV9-mini/aP2-null 载体处理的动物，接收AAV9-mini/aP2-mHKII载体的动物示出了增加的由eWAT摄取的基础 2-[1-3Η]脱氧-D-葡萄糖。在基础条件下，在iBAT中和在，例如心脏的组织(其中，mini/aP2 调控区的使用阻止转基因表达）中的组之间没有发现2-[1- 3Η]脱氧-D-葡萄糖摄取的差别。 参见图2D。
[0272] 实施例3
[0273] 体内褐色脂肪细胞通过AAV载体的局部递送的遗传工程化
[0274] 考虑到AAV8和AAV9是最高效的介导白色脂肪细胞的遗传工程载体，评估通过相同 的血清型的褐色脂肪细胞的转导。将2X10 9vg八鼠的AAV8和AAV9-CAG-GFP载体给予至肩胛 间褐色脂肪组织（iBAT)两个星期后，检测到多种GFP+褐色脂肪细胞。参见图3A。通过qPCR的 GFP表达水平评估表明在2 X 109vg八鼠的剂量下通过AAV8的转导效率相比AAV9较高。参见图 3B。一旦使用AAV8和AAV9载体证明了褐色脂肪细胞的转导，我们表征使用血清型1、2、4、5、 6、7、8和9的AAV的褐色脂肪组织(BAT)体内转导效率。为此，将1.2 X 101Qvg八鼠剂量的血清型 4和8的AAV或10nvg八鼠剂量的血清型1、2、4、5、6、7、8和9的AAV(AAV-CMV-RFP)(受遍在启动 子CMV控制，编码标记蛋白RFP)注射入小鼠的iBAT。iBAT内部给予两个星期后，通过qPCR的 RFP表达水平的定量显示出于44￥1、2、4、5和6相比，通过44￥7^4￥8和44￥9的丨841'的转导效 率较高。参见图3C。一致的是在接收AAV9载体的动物的iBAT中检测道广泛的RFP+褐色脂肪 细胞分布。参见图3D。
[0275] 此外，AAV的iBAT内部给予导致该库的局限性转导，其中，在附睾、肠系膜、腹膜后 和腹股沟库中检测不到的转基因表达。关于非脂肪组织的转导，iBAT内部用AAV7、AAV8和 AAV9载体处理的动物表现出心脏和肝脏的转导，而在胰腺、肠、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌、睾 丸、副睾和大脑中检测不到GFP表达。参见图10。
[0276] 实施例4
[0277] 体内AAV介导的褐色脂肪细胞的特异遗传工程化
[0278] 利用由给予棕色脂肪细胞特异表达的增强子和大鼠 UCP1基因的基本启动子组成 的mini UCPl(mini/UCPl)调控区特异地调节感兴趣的基因在褐色脂肪组织中的表达。参见 Boyer B等，Mol.Cell Biol.l991;ll:4147-4156、Kozak U等，Mol.Cell Biol.l994;14:59-67、上文的 Cassard-Doulcier，1998，和 Larose，1996。iBAT 内部给予 2 X 10nvg 八鼠的 AAV8 或 AAV9-mini/UCPl-GFP载体两个星期后，得到褐色脂肪细胞的高效转导。参见图4A。类似地， iBAT内部递送2X10nvg八鼠的AAV8和AAV9-mini/aP2-GFP也转导褐色脂肪细胞。参见图11A。 此外，mini/UCPl调控区实现高度脂肪细胞特异的GFP表达，完全消除了心脏中AAV介导的转 基因表达，并且仅介导少量的肝脏转导。参见图11B。
[0279] 为检验AAV介导的iBAT的转导可以是研究褐色脂肪细胞功能的新模型，将7 X l〇1()vg 八鼠的 AAV8-mini/UCPl-mHKII 载体给予 iBAT。与用 AAV8-mini/UCPl-null 载体处理的 动物相比，接收AAV8-mini/UCPl-mHKII载体的动物表现出增加的通过iBAT摄取的基础2-[1-?]脱氧-D-葡萄糖，并且在基础条件下，在eWAT和心脏的组之间没有发现2-[ 1-3H]脱氧-D-葡萄糖摄取的差别。参见图4B。然后，将2X10nvg/小鼠的AAV9-mini/UCPl-VEGF 164载体或 AAV9-mini/UCPl-null 载体递送 iBAT 内部。注射两个星期后，接收 AAV9-mini/UCPl-VEGF164 载体的动物表现出VEGF164的过表达和与用AAV9-mini/UCPl-null载体处理的动物相比增加 的iBAT中的总VEGF水平。此外，在过表达VEGF 164的动物中获得PECAM1 (常用的内皮细胞标记 物）的过表达。如通过针对iBAT中α-SMA的免疫染色所证明的，用AAV9-mini/UCPl-VEGF 164载 体处理的动物相比接收AAV9-min i /UCP1 -nu 11载体的动物表现出增加的血管的数量。参见 图4C-4F。
[0280] 实施例5
[0281 ]通过AAV8和AAV9的全身给予的白色和褐色脂肪细胞的体内遗传工程化
[0282]将5 X 1012vg八鼠剂量的AAV8或AAV9-CAG-GFP载体通过尾部静脉给予至瘦鼠。注射 两个星期后评估脂肪库的转导。针对eWAT部分的GFP的免疫染色表现出AAV8和AAV9介导的 白色脂肪细胞的转导。此外，GFP表达水平和GFP含量的测量证明AAV8和AAV9的转导效率相 似。此外，全身递送5X10 12vg八鼠的AAV8或AAV9载体高效地介导iBAT的褐色脂肪细胞的转 导。通过qPCR的GFP表达水平的测量和通过荧光分析的GFP含量表明AAV8表现出相比AAV9优 良的iBAT转导效率的倾向。此外，通过qPCR的GFP表达水平的测量证明基因转移至腹股沟、 腹膜后和肠系膜的库。然而，在库之中观察到显著的转导效率的差别。参见图5A-5H。重要 地，AAV8或AAV9载体静脉给予至糖尿病-肥胖ob/ob小鼠或db/db小鼠也导致WAT和BAT的遗 传工程化，并且效率与在瘦鼠中得到的相似。参见图13。AAV8或AAV9-CAG-GFP载体的全身给 予转导多种非脂肪组织。参见图12。
[0283] 实施例6
[0284] 利用AAV-mini/aP2和AAV-mini/UCPl载体的白色和褐色脂肪细胞的体内特异遗传 工程化
[0285] 虽然提供较低水平的转基因表达式，全身递送2X1012vg小鼠的AAV8或AAV9-mini/ aP2-GFP导致白色和褐色脂肪细胞的转导。参见图7A。相反地，全身给予2X10 12vg小鼠的 AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP载体介导显著的褐色脂肪细胞的转导。参见图6A。此外，静脉注 射递送的AAV-mini/aP2-GFP和AAV-mini/UCPl-GFP载体实现高度脂肪细胞特异的GFP表达， 在心脏中没有可检测的转基因表达以及在肝脏中仅表现出少数分散的GFP+肝细胞的少量 表达。参见图7B-7C。
[0286] 为进一步证明通过AAV全身给予的脂肪细胞的遗传工程化，将2X 1012vg的AAV9-mini/UCPl-VEGF164或AAV9-mini/UCPl-null通过尾部静脉递送。注射后两个月，接收AAV9-mini/UCPl-VEGF 164载体的动物表现出与用AAV9-mini/UCPl-null载体处理的动物相比增加 的 VEGFm 的表达。参见图 6B-6C。此外，将 8X1012vg 剂量的 AAV9-mini/UCPl-VEGF164 或 AAV9-mini/UCP Ι-null载体也通过尾部静脉传递。注射后一个月，接收8 X 1012vg的AAV9-mini/ UCP1-VEGF164载体的动物表现出增加的VEGF164和PECAM1的表达和增加的血管密度。参见图 6D-6G〇
[0287] 实施例7
[0288] 使用AAV-mini/aP2_GK的褐色脂肪细胞的体内特异遗传工程化
[0289] 将2 X 10nvg八鼠剂量的，受mini/aP2调控区控制的，编码小鼠葡糖激酶的AAV9载体 (AAV9-mini/aP2-rGK)或等剂量的AAV9-mini/aP2-null载体局部给予至小鼠的iBAT。注射 两个星期后/一个月，测定体内基础和胰岛素刺激的2-[1- 3Η]脱氧-D-葡萄糖摄取，以评估 接收AAV9-mini/aP2-rGK载体的动物相比于用AAV9-mini/aP2-null载体处理的动物是否表 现出增加的特异的通过iBAT的基础2-[1- 3Η]脱氧-D-葡萄糖摄取。
[0290] 实施例8
[0291] AAV载体的全身给予之后来自具有mirT序列的肝脏和心脏的高效脂肪细胞转导和 转基因表达的去靶
[0292] 全身给予1012vg八鼠剂量的，在表达框的3'UTR中克隆的，受遍在CAG启动子(AAV9-CAG-GFP)或CAG启动子外加四个肝脏特异miR122a的串连靶位点(AAV9-CAG-GFP-miRT122)、 心脏特异miRl (AAV9-CAG-GFP-miRTl)或二者(AAV9-CAG-GFP-双miRT)控制的，编码GFP标记 蛋白的AAV9载体。注射两个星期后，在来自接收AAV9-CAG-GFP、AAV9-CAG-GFP-miRT122、 AAV9-CAG-GFP-mirTl或AAV9-CAG-GFP-双miRT载体的小鼠的白色和褐色脂肪细胞中观察到 较高水平的GFP表达。相反的，在分别用AAV9-CAG-GFP-mirT122或AAV9-CAG-GFP-mirTl载体 处理的小鼠中，几乎完全消除了肝脏或心脏中的GFP产生。显然的是在来自用AAV9-CAG-GFP-双miRT处理的小鼠的肝脏和心脏中GFP产生被大幅抑制。参见图14。
【主权项】
1. 一种腺相关病毒载体，包含重组病毒基因组，其中，所述重组病毒基因组包含表达 框，所述表达框包含与感兴趣的多核苷酸可操作地连接的脂肪组织特异转录调控区。2. 根据权利要求1所述的腺相关病毒载体，其中，AAV的血清型选自由AAV6、AAV7、AAV8 和AAV9组成的组。3. 根据权利要求1或2所述的腺相关病毒载体，其中，所述脂肪组织特异转录调控区包 含选自由aP2基本启动子和UCPl基本启动子组成的组的启动子区。4. 根据权利要求3所述的腺相关病毒载体，其中，所述脂肪组织特异转录调控区进一步 包含与所述启动子区可操作地连接的增强子区。5. 根据权利要求4所述的腺相关病毒载体，其中，所述增强子区选自由脂肪特异aP2增 强子和脂肪特异UCPl增强子组成的组。6. 根据权利要求5所述的腺相关病毒载体，其中，所述转录调控区选自由以下各项组成 的组： ⑴包含所述脂肪特异aP2增强子和鼠类aP2基本启动子的多核苷酸，以及 (ii)包含所述脂肪特异UCPl增强子和大鼠 UCPl基本启动子的多核苷酸。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，所述表达框进一步包含 转录后调控区。8. 根据权利要求7所述的腺相关病毒载体，其中，所述转录后调控区是土拨鼠肝炎病毒 转录后调控元件(WPRE)。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，所述感兴趣的多核苷酸 编码选自由以下组成的组中的蛋白质：作用于全身的分泌蛋白以及作用于所述脂肪细胞上 或其附近的蛋白质。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，所述感兴趣的多核苷酸 编码选自由己糖激酶、葡糖激酶、碱性磷酸酶和血管内皮生长因子组成的组中的蛋白质。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，腺相关病毒ITR是 AAV2ITR。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的腺相关病毒载体，其进一步包含至少一种 miRNA靶序列。13. 根据权利要求12所述的腺相关病毒载体，其中，所述至少一种miRNA靶序列是 mirT122a〇14. 根据权利要求12所述的腺相关病毒载体，其中，所述至少一种miRNA靶序列是 mirTl〇15. 根据权利要求12所述的腺相关病毒载体，其包含至少一个mirTl的拷贝和一个 mirT122a的拷贝16. -种药物组合物，包含根据权利要求1至15中任一项所述的腺相关病毒载体。17. 根据权利要求1至15中任一项所述的腺相关病毒载体或根据权利要求16所述的药 物组合物在药物中的用途。18. 根据权利要求1至15中任一项所述的腺相关病毒载体或根据权利要求16所述的药 物组合物在疾病的治疗或预防中的用途，所述疾病需要所述感兴趣的多核苷酸在所述脂肪 组织中的表达。19. 根据权利要求17所述的腺相关病毒载体的用途，其中，所述脂肪组织包含白色脂肪 组织。20. 根据权利要求17所述的腺相关病毒载体的用途，其中，所述脂肪组织包含褐色脂肪 组织。21. 根据权利要求17所述的腺相关病毒载体的用途，其中，全身或局部给予所述腺相关 病毒载体或所述药物组合物。22. -种转导细胞的体外方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1至15中任一 项所述的腺相关病毒载体接触。23. 根据权利要求22所述的体外方法，其中，所述细胞是脂肪细胞。24. 根据权利要求22所述的体外方法，其中，所述脂肪细胞是白色脂肪细胞或褐色脂肪 细胞。25. -种通过根据权利要求22至24中任一项所述的方法已获得的脂肪细胞。26. -种多核苷酸，包含由腺相关病毒ITR侧接的表达框，其中，所述表达框包含与感兴 趣的多核苷酸可操作地连接的脂肪组织特异调控区。27. 根据权利要求26所述的多核苷酸，其中，所述脂肪组织特异调控区包含选自由aP2 基本启动子和UCPl基本启动子组成的组中的启动子区。28. 根据权利要求27所述的多核苷酸，其中，所述脂肪组织特异调控区进一步包含与所 述启动子区可操作地连接的增强子区。29. 根据权利要求28所述的多核苷酸，其中，所述增强子区选自由脂肪特异aP2增强子 和脂肪特异UCPl增强子组成的组。30. 根据权利要求29所述的多核苷酸，其中，所述调控区选自由以下组成的组： ⑴包含所述脂肪特异aP2增强子和鼠类aP2基本启动子的多核苷酸，以及 (ii)包含所述脂肪特异UCPl增强子和大鼠 UCPl基本启动子的多核苷酸。31. 根据权利要求26至30中任一项所述的多核苷酸，其中，所述表达框进一步包含转录 后调控元件。32. 根据权利要求31所述的多核苷酸，其中，所述转录后调控区是土拨鼠肝炎病毒转录 后调控元件(WPRE)。33. 根据权利要求26至32中任一项所述的多核苷酸，其中，所述感兴趣的多核苷酸编码 选自由己糖激酶、葡糖激酶、碱性磷酸酶和血管内皮生长因子组成的组中的蛋白质。34. -种载体或质粒，包含根据权利要求26至33中任一项所述的多核苷酸。35. -种腺相关病毒载体，包含病毒基因组，所述病毒基因组包含根据权利要求26至33 中任一项所述的多核苷酸。36. -种用于获得腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤： (i)提供包含根据权利要求26至33中任一项所述的多核苷酸、AAV cap蛋白、AAV rep蛋 白和病毒蛋白的细胞，AAV依赖于所述病毒蛋白进彳丁复制； (i i)将所述细胞保持在适合AAV组装的条件下，以及 (i i i)纯化由所述细胞生产的腺相关病毒载体。37. 根据权利要求36所述的方法，其中，AAV依赖于其进行复制的所述蛋白来源于腺病 毒。38. 根据权利要求36或34所述的方法，其中，腺相关病毒rep或cap蛋白来源于选自由 AAV6、AAV7、AAV8和AAV9血清型组成的组中的AAV血清型。39. 根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中，步骤（iii)进一步通过聚乙二醇 沉淀步骤或氯化铯梯度分级分离进行。
【文档编号】C12N15/864GK105916990SQ201380080085
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2013年8月2日
【发明人】森萨诺 韦罗尼卡·希门尼斯, 图贝特 法蒂玛·博希
【申请人】巴塞罗那自治大学