塔宾曲霉及其液态发酵生产茶褐素的方法
【专利摘要】本发明涉及一种塔宾曲霉及其液态发酵生产茶褐素的方法，属生物技术领域。本发明的生产菌株为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 00，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年12月30日，保藏号：CGMCC No.10021。本发明将塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 00接种于已巴氏杀菌的绿茶水提物中，经摇瓶单菌株纯培养4天后，茶褐素含量为6.5g/L，其容产率比固态发酵高5.5倍。本发明的优点在于：生产条件及环境容易控制，且不受茶叶生产季节限制，能实现自动化、效率高、成本低。该菌株直接在绿茶水提物中生长繁殖，无需额外添加任何碳源氮源，并能快速地将绿茶水提物中的多酚类物质生物转化为大分子水溶性茶褐素。CGMCC No. 1002120141120
【专利说明】
塔真曲霉及其液态发酵生产茶褐素的方法
技术领域：
[0001] 本发明设及一种塔宾曲霉及其液态发酵生产茶褐素的方法，属生物技术领域。
【背景技术】：
[0002] 塔宾曲霉(Aspergillus化bingensis)被广泛发现于发酵食品中，如普巧茶和黄 酒酒曲。塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis)是黑色曲霉组（Aspergillus section Nigri)的一种，至2011年，黑色曲霉组已被鉴定和细化为26个种。应用分子生物学方法鉴定 黑色曲霉组真菌时，分析比对真菌常用的核糖体rDNA ITS序列的解析度较低，无法区分每 一个种；而测定分析巧调蛋白（calmodulin)基因序列和0-微管蛋白（beta-Uibulin)基因序 列能够区分所有种。
[0003] 茶褐素(Theabrownins，TB)是指由茶叶中W儿茶素为主的多酪类化合物氧化聚合 而成的大分子水溶性色素。它是一类易溶于水，但不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙醋、正下醇、= 氯甲烧等有机溶剂的高聚合物质。具有调节血脂异常、抗动脉粥样硬化、抗氧化的作用，是 普巧茶的主要活性物质，在普巧熟茶中茶褐素含量平均为12%。
[0004] 现有技术主要是从经固态发酵后的普巧熟茶中提取茶褐素。但普巧熟茶存在生产 周期长(30天W上）、茶褐素含量高低不均、生产过程易污染杂菌、生产过程可控性和自动化 差的技术问题。因此，现有的茶褐素提取方法也受到限制。
[0005] 本发明通过从普巧茶固态发酵中分离而获得塔宾曲霉，用塔宾曲霉KUtea 00接种 于绿茶水提物中生产茶褐素。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种生产条件及环境容易控制， 且不受茶叶生产季节限制，能实现自动化、效率高、成本低的塔宾曲霉及其液态发酵生产茶 褐素的方法。
[0007] 本发明提供的塔宾曲霉，从普巧茶固态发酵中分离、纯化所得。生产菌株为塔宾曲 霉(Aspergillus tubingensis化化ea 00,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中屯、，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期:2014年11月20日，保 藏号：CGMCC No. 10021。
[000引本发明提供的用上述塔宾曲霉KUtea 00接种于绿茶水提物生产茶褐素的方法，包 括W下步骤：
[0009] (1)制备绿茶茶汤：按lg:30mL的比例将绿茶加入到沸蒸馈水中，沸水浴15分钟后 减压过滤而得到茶汤，将茶汤冷却后定容至30mL，在80°C下进行己氏杀菌30分钟，制得绿茶 茶汤；
[0010] (2)制备种子培养基:将权利要求1所述的塔宾曲霉KUtea 00抱子在无菌操作下接 种于上述（1)所得到的己氏杀菌后的绿茶茶汤中，在25化pm，4(TC下摇瓶培养2地后得到种 子培养基；
[0011] (3)液态发酵:按10%的种子培养基接种量将上述(2)所得的种子培养基在无菌操 作下接种于上述（1)所得的的己氏杀菌后的绿茶茶汤中，在40°C下，W25化pm，摇瓶发酵1-4 天后生成茶褐素。
[0012] 本发明的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis化化ea 00经公知的马铃馨葡萄糖 琼脂培养基(PDA)分离、纯化，经可靠的分子生物学测序技术鉴定，其GenBank/EMBL/DDBJ编 号分别为：ITS序列化J948639)、巧调蛋白（calmodulin)基因序列化J948649K0-微管蛋白 (beta-1:ubulin)基因序列化巧48651)。
[001引本发明的优点在于：
[0014] 1、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis化Utea 00菌株能直接在绿茶水提物中生 长繁殖，无需额外添加任何碳源氮源，并能快速地将绿茶水提物中的多酪类物质生物转化 为大分子水溶性茶褐素。
[0015] 2、方法生产条件及环境容易控制，且不受茶叶生产季节限制，能实现自动化、效率 局、成本低。
【具体实施方式】：
[0016] 实施例1:塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis化化ea 00的分离鉴定
[0017] (1)固态发酵普巧茶：按400g大叶晒青绿茶（Camellia sinensis var.assamica) 喷洒蒸馈水200mL，使茶叶初始水分含量达到35%，用透气性食品薄膜包裹后，置于45°C， 相对湿度70%的全自动恒溫恒湿发酵箱中发酵14d。在第8天时，翻堆茶叶并适当喷洒补充 水分，发酵结束后于60°C下鼓风干燥，得到普巧熟茶。经传统萃取比色法分析测定，所得普 巧熟茶样品中茶褐素含量为10%。
[0018] (2)真菌的分离、纯化和鉴定:在固态发酵期间，每天取样，采用稀释平板法进行微 生物的分离。称取1 g样品放入含9mL无菌水的锥形瓶中，15化pm摇床震荡15min。将制备的菌 悬液依次稀释到1〇^、1〇^、1〇^、1〇^、1〇^、1〇^，均匀涂布到马铃馨葡萄糖琼脂培养基巧铃 馨淀粉4g、葡萄糖20g、氯霉素O.lg、琼脂15g、蒸馈水lOOOmL、自然抑、在121°C高压锅中灭菌 15min)平板上，37 °C恒溫培养2d后，进行菌落计数。
[0019] 挑取单菌落进行S点接种纯化培养2-3次后，得到一株纯菌株并命名为KUtea 00， 将其划线培养于PDA斜面上，37°C恒溫培养2d后转至4°C冰箱中保存，用于后续测序鉴定及 液态发酵产茶褐素试验。
[0020] 菌株的分类鉴定采用分子生物学测序技术。将KUtea 00菌株接种于已12rc高压 灭菌15min的20mL YM肉汤中（酵母抽提物3g,麦芽抽提物3g,蛋白腺5g,葡萄糖lOg，蒸馈水 1000 mL) ,37°C ,250;rpm摇瓶培养24h。义用离屯、法（1700g，5min)分离菌丝，并用已灭菌的去 离子水冲洗菌丝2次。用公知的CTAB法从新鲜菌丝中提取菌种DNA后，采用引物对ITSl和 ITS4,化2a和化26，〔尸比和〔尸4分别对真菌的内转录间隔区（口5)，巧调蛋白山曰1111〇(1111111)基 因和e-微管蛋白（beta-tubulin)基因进行PCR扩增，并测定其序列组成。然后通过序列比对 的方式在GenBank数据库中对未知真菌KUtea 00进行鉴定。经鉴定为塔宾曲霉 (Aspergillus tubingensis)，将所得序列提交至GenBank/EMBL/DDBJ数据库，获得编号如 下：ITS序列化J948639)、巧调蛋白（calmodulin)基因序列化J948649)、e-微管蛋白（be化- Uibulin)基因序列化J948651)。
[0021] 实施例2:将实施例1所得塔宾曲霉MJtea 00用于液态发酵绿茶水提物生产茶褐素
[0022] (1)绿茶水提物制备：大叶晒青绿茶（Camellia sinensis var.assamica)，按Ig: 30mL的比例加入沸蒸馈水，沸水浴15分钟后减压过滤得到水提物，冷却后定容至30mL。水 提物己氏杀菌(80°C，30min)后冷却至室溫用于后续塔宾曲霉IOJtea 00液态发酵生产茶褐 素。
[0023] (2)种子培养基:将1-2环塔宾曲霉抓tea 00抱子在无菌操作下接种于含25mL上述 已己氏杀菌绿茶水提物的125mLS角瓶中，在25化pm，4(TC下摇瓶培养2地，所得为种子培养 基。
[0024] (3)液态发酵生产茶褐素:将25mL上述种子培养基在无菌操作下接种于含225血已 己氏杀菌绿茶水提物的SOOmLS角瓶中（即种子培养基接种量10%)，25化pm，4(TC下摇瓶培 养4d，发酵期间每天取样测定茶褐素含量。结果表明，在发酵OcUlcU 2d、3d、4d时发酵液中茶 褐素浓度分别为0.44、0.96、1.88、4.72、6.51邑/1(具体见表1)。由于固态发酵14(1后，茶褐素 含量为10%左右，经计算对比，采用塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis化化ea 00液态发 酵绿茶水提物生产茶褐素时，容产率比固态发酵高5.5倍，实现快速、低成本、高度可控化生 产茶褐素。
[0025] 表1塔宾曲霉抓tea 00液态发酵绿茶水提物生产茶褐素
[0026]
[0027]注：同列间大写字母肩标不同者，差异显著（P<0.05);同行间小写字母肩标不同 者，差异显著(P<〇.〇5)。
【主权项】
1. 一种塔宾曲霉，其特征在于生产菌株为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 〇〇,保藏号:CGMCC No. 10021。2. -种用权利要求1所述的塔宾曲霉KUtea 00接种生产茶褐素的方法，其特征在于该 方法包括以下步骤： (1) 制备绿茶茶汤：按lg: 30mL的比例将绿茶加入到沸蒸馏水中，沸水浴15分钟后减压 过滤而得到茶汤，将茶汤冷却后定容至30mL，在80°C下进行巴氏杀菌30分钟，制得绿茶茶 汤； (2) 制备种子培养基:将权利要求1所述的塔宾曲霉KUtea 00孢子在无菌操作下接种于 上述（1)所得到的巴氏杀菌后的绿茶茶汤中，在250rpm，4(TC下摇瓶培养24h后得到种子培 养基； (3) 液态发酵:按10 %的种子培养基接种量将上述(2)所得的种子培养基在无菌操作下 接种于上述（1)所得的的巴氏杀菌后的绿茶茶汤中，在40°C下，以250rpm，摇瓶发酵1-4天后 生成茶褐素。
【文档编号】C12P1/02GK105925490SQ201610388351
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】龚加顺, 谭超, 王秋萍, 萨洛特, 彭春秀
【申请人】云南农业大学