一株高效转化延胡索酸为l-天冬酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一株能够高效转化延胡索酸为L?天冬酰胺的重组大肠杆菌，将耐铵型大肠杆菌BEW308中编码富马酸酶的基因fumA、fumB、fumC失活，再将编码L?天冬氨酸酶和L?天冬酰胺酶编码基因插入到编码富马酸酶fumAC基因的位置，即得到无苹果酸副产、少量L?天冬氨酸积累并主产L?天冬酰胺的重组大肠杆菌。本发明还公开了上述菌株的构建方法及应用。本发明可实现L?天冬氨酸酶和L?天冬酰胺酶的组成型高活性表达，并最终实现延胡索酸至L?天冬酰胺的转化。
【专利说明】
-株高效转化延胡索酸为L-天冬醜胺的重组大肠杆菌及其构 建方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一株转化延胡索酸合成k天冬酷胺生产 菌株及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] k天冬酷胺是k天冬氨酸的径基酷胺化合物，在医药、食品、轻化工和水环保方面 具有广泛的用途，在医药行业主要作为氨基酸输液中的二十种之一，并具有治疗皮肤病的 功效。在食品行业只要作为营养增补剂，抗酒精中毒剂，也可进一步衍生做香味剂。在化工 行业主要做铁盐的稳定剂及陶瓷表面的薄膜。在环保行业是水处理膜的重要原料。
[0003] 目前k天冬酷胺的生产主要天冬氨酸为原料经醋化氨解，精制而成，但其过 程产物收率偏低，且设及大量的有机溶剂，污染大，废水难处理。生物法具有反应溫和、转化 率高、S废易处理等优点，是k天冬酷胺最佳的生产方式，但k天冬氨酸转化为心天冬酷胺 过程中设及到辅酶的参与，因此需要解决辅酶的供给问题，本发明基于此构建了具有高效 转化合成心天冬酷胺的菌株，并建立了其发酵工艺，生产指标具有显著的经济性。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是，提供一株利用延胡索酸合成心天冬酷胺的重组大肠 杆困。
[0005] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述能够高效转化延胡索酸合成心天冬酷胺 重组大肠杆菌在制备k天冬酷胺中的应用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一株高效转化延胡索酸为-天冬酷胺的重组大肠杆菌，将耐锭型大肠杆菌邸W308 中编码富马酸酶的基因化減、化1118、化1]1(：失活，再将编码心天冬氨酸酶基因和编码心天冬酷 氨酶基因插入到编码富马酸酶的fumAC基因位置，即得高效转化延胡索酸为-天冬酷胺的重 组大肠杆菌。所述的耐锭型大肠杆菌BEW308,该菌株的保藏号为CCTCC N0:M2013157,该菌 株的详细信息已经在申请号为201310279778.6的中国专利中公开。
[000引其中，所述编码k天冬氨酸酶的基因序列如SEQ ID NO: 1所示，所述编码k天冬酷 胺酶的基因序列如SEQ ID N0:2所示。
[0009] 其中，1^-天冬氨酸酶基因的起始密码子上游有一段信号肤，该信号肤的基因序列 如SEQ ID N0:3所示，将k天冬氨酸酶基因的终止密码子删除，在心天冬氨酸酶基因的末端 与心天冬酷氨酶基因之间有一段连接序列，该连接序列如SEQ ID N0:4所示。
[0010] 上述高效转化延胡索酸为天冬酷胺的重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包 括如下步骤：
[00川 （1)将PKD46质粒转入耐锭型大肠杆菌BEW308中，筛选出阳性转化子大肠杆菌 BEW308-地D46，利用k阿拉伯糖诱导其表达A重组酶，再将大肠杆菌肥W308-P邸46制备成感 受态细胞；
[001^ (2似PIJ773质粒为模板，沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6所示的序列为引物，PCR扩 增得到fumB基因敲除片段；
[001引（3)将步骤(2)得到的化mB基因敲除片段电转化至大肠杆菌肥W308-PKD46制备成 感受态细胞中，在安普抗性平板上筛选阳性重组子；
[0014] (4)将步骤(3)得到的阳性重组子制备成感受态细胞，将PCP20质粒转化其中，42°C 诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在物抗性的平 板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株为化mB基因失活的菌株邸W308- A fumB;
[0015] (5)合成同源重组片段:在SEQ ID NO: 1起始密码子ATG前增加信号肤序列SEQ ID NO: 3，删除心天冬氨酸酶基因的终止密码子，并在k天冬氨酸酶基因后添加连接序列SEQ ID N0:4,该片段还包括安普霉素抗性基因序列，并在该片段的两端添加了fumAC的同源臂， 具体序列如SEQ ID NO:7所示；
[0016] (6)将步骤(4)得到的化mB基因失活的菌株邸W308-A化mB制备成感受态细胞，将 PKD46质粒转化其中，利用k阿拉伯糖诱导其表达A重组酶，再将其制备成感受态细胞；
[0017] (7)将步骤巧）中的同源重组片段转化至步骤(6)的含有A重组酶的感受态细胞中， 在安普抗性平板上筛选阳性重组子；
[001引（8)将步骤(7)中的阳性重组子制备成感受态细胞，将PCP20质粒转化其中，42 °C诱 导化P重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在无抗性的平板 上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株即为能够高效转化延胡索酸为天冬 酷胺的重组大肠杆菌邸W308 A fumB-AfumAC-aspC2-30-asnA。
[0019] 上述转化延胡索酸为-天冬酷胺的重组大肠杆菌在生产k天冬酷胺中的应用。
[0020] 其中，其发酵过程分为诱导阶段和转化阶段。
[0021] 其中，诱导阶段培养基配方为:延胡索酸20g/L，酵母粉24g/L，蛋白腺10g/L，K2HP化 36mmol/L，MgS〇4 lOmmol/L，微量元素 [CaCl2.6H20 0.74g/L，ZnS04.7H20 0.18g/L， MnS04.出0 20g/L，Na2-EDTA20.1g/l，CuS04 Q.lg/L，CoCl2 0.104g/L，FeS04.7此02g/L]2mL/ U溶剂为水，抑为7.2~7.5。
[0022] 转化阶段补料发酵:诱导阶段结束后分次补加总计葡萄糖40~60g/L，延胡索酸 150~200g/L。
[0023] 其中，诱导阶段溫度为28~30°C，pH为7.2~7.8,溶氧为5~40%;转化阶段溫度为 30~37°(：，口出％7.2~7.8，溶氧为5~40%。
[0024] 其中，葡萄糖补加方式为将葡萄糖配置成600g/L的储液，并根据发酵液体积分两 次补加，总计40~60g/l;延胡索酸的补加方式为配成400g/L的延胡索酸混悬液，并用氨水 调节抑至中性，分5次补加总计约150~200g/L的延胡索酸。
[00巧]有益效果：
[00%] (1)本发明可实现k天冬氨酸酶和k天冬酷胺酶的组成型高活性表达，且发酵培 养后获得的细胞具有低富马酸酶活性。
[0027] (2)通过诱导-转化两阶段发酵过程，其转化产物中主要是心天冬酷胺(底物的摩 尔转化率超过97.5%)，有少量k天冬氨酸积累，无苹果酸积累。该方法可有效提高底物延 胡索酸的转化收率，降低副产物的生产，有效降低生产成本。
【附图说明】
[002引图1敲除fumB基因的线性片段PCR图，泳道M为marker,泳道1为线性片段。
[00巧]图2菌落PCR鉴定图，其中邸W308泳道为出发菌株，M为Markera~8为鉴定的单菌 落。
【具体实施方式】
[0030] 根据下述实施例，可W更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0031] 实施例1:
[0032] 本实施例说明利用同源重组技术敲除亲本耐锭型大肠杆菌BEW308中富马酸酶 fumB基因，得到消除安普霉素抗性菌株的过程。
[0033] (1)利用LB培养基，于37°C、有氧条件下培养大肠杆菌邸W308至ODsoo = O. 4~0.6， 制备成电转感受态；
[0034] (2)将地D46质粒电转入感受态的大肠杆菌邸W308。电击条件为:200 Q，2扣F，电击 电压2.3kv，电击时间4~5ms。电击后迅速将菌体加入预冷1血的SOC培养基，150r/min、30°C 培养化之后涂布于带氨节青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子BEW308(地D46);
[0035] (3)在LB培养基中加入1〇11^的心阿拉伯糖，于30°C下诱导质粒地D46表达出A重组 酶，制成电转感受态；
[0036] (4) W两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，W 质粒PIJ773为模板，并设计两端带有化mB同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段， 引物序列如下：
[0037] 上游带同源臂引物Hl-Pl(沈Q ID N0:5):
[0038] 5' -0GGCA0GCCATTTT0GAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTC0GGGGATC0GT0GACC-3'
[0039] 下游带同源臂引物肥-P2(沈Q ID N0:6):
[0040] 5 ' -TTACTTAGTGCAGTT0G0GCACTGTTTGTTGA0GATTTGCTGGMGMTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，
[0041 ] 反应体系：带同源臂的上下游引物（1 OOpmo 1 Ai 1)各0.化1;模板DNA (1 OOng/山）0.5 y 1; 10 X buf f er 5山；dNTPs (IOmM)各化1; DMS0( 100 % ) 2.5iU ; Pyrobest DNA聚合酶（2.5U/ii I)化I; dd肥0 36/35.化1;总体积50iU。
[0042] 反应条件:94°C，2min; (94°C，45sec;50°C，45sec;72°C，90sec;10个循环）；（94°C， 45sec;55°C，45sec;72°C，90sec;15个循环）；72°C，5min。
[0043] 线性DNA片段的鉴定如图I。
[0044] (5)电转线性DNA片段至已诱导表达A重组酶的邸W308(地D46)感受态，并涂布于带 安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了 PCR鉴定，电泳图如图2所示。
[0045] (6)阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达化P重组酶的质粒PCP20,于42°C 热激表达化P重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗 性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌株，命名为邸W308( A fumB)。
[0046] 实施例2:本实施例考察了突变Escherichia coli 1(12的^天冬氨酸酶基因 (aspC)后对该酶活性的影响。具体操作过程为：W原始的aspC为基础，将236和249位氨基酸 进行突变化ys236Asn，Gly249Thr)，通过人工合成的方式合成该基因，命名为aspC2。将突变 的基因连接到pTrc99a表达质粒并导入邸W308( A fumB)，构建获得邸W308( A fumB，aspC2)， W为突变的重组菌BEW308( A fumB，aspC)作对比，结果如表1:
[0047] 表1天冬氨酸酶突变前后的酶学性质变化情况 [004引 L0049」实施例3:
[0050] 本实施例说明利用同源重组技术进一步敲除大肠杆菌BEW308( A化mB)中富马酸 酶fumAC基因，并引入突变的高活性心天冬氨酸酶和k天冬酷胺酶基因。
[0051] 整个实验操作过程与实施例1 一致，仅同源序列不同。
[0052] (1)本实施例WEscherichia COli 1(12的1^-天冬氨酸酶基因（aspC)为出发序列， 同时236和249位氨基酸进行突变获得aspC2,即Lys236Asn，Gly24OThr，同时在启始密码子 ATP上游增加了一段信号肤序列：atgttgaatccgaaggttgcc1:acatggtctggatgacgtgcctgggtt taacgttgcccagccaggca(SEQ ID ^:3所示），下游删除了终止密码子；所述编码心天冬酷胺 酶基因（asnA)，其起始密码子与心天冬氨酸酶基因末端基因之间有一段30bp的连接序列W 确保两个酶同时具有高活性，该30bp序列为CAATCTGGACCGTGGCATCCTGGAAGCATT(SEQ ID NO: 4所示）。
[0053]最终在两端增加 fumAC的同源臂和安普霉素抗性基因序列，整段基因采用人工合 成的方式合成，具体核巧酸序列见SEQ ID N0:5所示。
[0化4] (2)电转人工合成的线性DNA片段至已诱导表达A重组酶的邸W308( A fumB,PKD46) 感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了 PCR鉴定，阳性重组子 制备成感受态后倒入能诱导表达化P重组酶的质粒PCP20,于42°C热激表达化P重组酶后即 可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在 抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌株，命名为邸W308( AfumB-A^mAC-aspCS- SO-asnA)
[0化5] 实施例4:
[0056] 本实施例对比考察了出发菌株Escherichia COli邸W308和重组菌Escherichia CO 1 i BEW308 ( A化mB- A化mAC-aspC2-30-asnA)在发酵培养基中诱导培养化后的富马酸 酶、天冬氨酸酶、心天冬酷胺酶活性的对比数据。
[0057] W及邸W308( A化mB- A fumAC-aspC2-30-asnA)两步法合成k天冬酷胺的过程数 据。
[005引具体步骤和结果如下：
[0059] (1)采用LB培养基，按1~2% (v/v)接种量从冻存管接入S角瓶中，有氧培养10~ 12h，进一步按1~2% (v/v)接种量接种至摇瓶或者种子发酵罐(培养基也为LB)，种子培养 过程溫度控制在30°C，培养中不需调节抑，溶氧控制在5~40%，培养4~化后待菌体ODsoo至 2.5~4之间，按5~10%接种发酵培养基的诱导培养基，发酵过程溫度控制在3(TC，培养过 程抑用氨水控制在7.2~7.8，溶氧控制在5~40 %，培养化。
[0060] 表2 Escherichia COli BEW308( AfumB-A fumAC-aspC2-30-asnA)与出发菌株酶 活比较
[0061]
[0062] (2)诱导之后添加30g/L葡萄糖和150g/L延胡索酸(用氨水调节至中性后分S次补 加），提高溫度至37°C进入转化阶段，收集转化12h，16h，20h和24h的菌液产物分析。实验结 果见表2。
[0063] 表3 Escherichia coli BEW308( A fumB-A fumAC-aspC2-3〇-asnA)发酵液过程
[0064]
【主权项】
1. 一株高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌，其特征在于，将耐铵型大肠杆 菌BEW308中编码富马酸酶的fumA、fumB、fumC基因失活，再将编码L-天冬氨酸酶的基因和编 码L-天冬酰氨酶的基因插入到编码富马酸酶的fumAC基因位置，即得高效转化延胡索酸为-天冬酰胺的重组大肠杆菌。2. 根据权利要求1所述的高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌，其特征在于， 编码L-天冬氨酸酶的基因序列如SEQ ID NO: 1所示，编码L-天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO:2所示。3. 根据权利要求1所述的高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌，其特征在于， 编码L-天冬氨酸酶的基因的起始密码子上游有一段信号肽，该信号肽的基因序列如SEQ ID NO: 3所示，将L-天冬氨酸酶基因的终止密码子删除，在L-天冬氨酸酶基因的末端与L-天冬 酰氨酶基因之间有一段插入连接序列，该连接序列如SEQ ID N0:4所示。4. 权利要求1所述的高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌的制备方法，其特 征在于，包括如下步骤： (1) 将PKD46质粒转入耐铵型大肠杆菌BEW308中，筛选出阳性转化子大肠杆菌BEW308-PKD46,利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受态细 胞； (2) 以pIJ773质粒为模板，SEQ ID Ν0:5和SEQ ID Ν0:6所示的序列为引物，PCR扩增得 到fumB基因敲除片段； (3) 将步骤(2)得到的fumB基因敲除片段电转化至大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受 态细胞中，在安普抗性平板上筛选阳性重组子； (4) 将步骤(3)得到的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化其中，42°C诱导 FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在物抗性的平板上 生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株为fumB基因失活的菌株BEW308-A fumB； (5) 合成同源重组片段:在SEQ ID NO: 1起始密码子ATG前增加信号肽序列SEQ ID NO: 3,删除L-天冬氨酸酶基因的终止密码子，并在L-天冬氨酸酶基因后添加连接序列SEQ ID N0:4,该片段还包括安普霉素抗性基因序列，并在该片段的两端添加了fumAC的同源臂，具 体序列如SEQ ID NO:7所示； (6) 将步骤(4)得到的f umB基因失活的菌株BEW308-Af umB制备成感受态细胞，将pKD46 质粒转化其中，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将其制备成感受态细胞； (7) 将步骤(5)中的同源重组片段转化至步骤(6)的含有λ重组酶的感受态细胞中，在安 普抗性平板上筛选阳性重组子； (8) 将步骤(7)中的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化其中，42°C诱导 FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在无抗性的平板上 生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株即为能够高效转化延胡索酸为天冬酰 胺的重组大肠杆菌 BEW308AfumB-AfumAC-aspC2-30-asnA。5. 权利要求1所述的转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌在制备L-天冬酰胺中的 应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其发酵过程分为诱导阶段和转化阶段。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，诱导阶段培养基配方为:延胡索酸20g/L， 酵母粉24g/L，蛋白胨10g/L，K 2HP〇4 36mmol/L，MgS〇4 10mmol/L，微量元素[CaCl2.6H20 0.74g/L,ZnS04.7H20 0.18g/L,MnSO4.H2O 20g/L,Na2-EDTA 20.lg/L,CuSO4 O.lg/L,CoCl2 0 · 104g/L，FeS〇4· 7H20 2g/L]2mL/L，溶剂为水，pH为7 · 2~7 · 5。 转化阶段补料发酵:诱导阶段结束后分次补加总计葡萄糖40~60g/L，延胡索酸150~ 200g/L〇8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，诱导阶段温度为28~30°C，pH为7.2~7.8， 溶氧为5~40 % ;转化阶段温度为30~37 °C，pH为7.2~7.8，溶氧为5~40 %。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，葡萄糖补加方式为将葡萄糖配置成600g/L 的储液，并根据发酵液体积分两次补加，总计40~60g/L;延胡索酸的补加方式为配成400g/ L的延胡索酸混悬液，并用氨水调节pH至中性，分5次补加总计约150~200g/L的延胡索酸。
【文档编号】C12N1/21GK105925520SQ201610430229
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】马江锋, 姜岷, 董维亮, 章文明, 陈可泉, 吴昊
【申请人】南京工业大学