一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法【专利摘要】本发明涉及组织工程领域，具体是一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，包括以下步骤：将人原代成纤维细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM中，37℃、5％CO2培养，每3?5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行1:3传代，培养120天以上。本发明人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的过程中没有利用到细胞重编程技术，没有外源性的干扰细胞的基因组成，保证了转化所得细胞的功能性和安全性。本发明将人原代成纤维细胞转化为表皮细胞有望成为临床工作中创面修复的一种新手段。【专利说明】一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法
技术领域：
[0001]本发明涉及组织工程领域，具体地说，是医学创面修复
技术领域：
的一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法。【
背景技术：
】[0002]表皮细胞是皮肤组织工程的“种子细胞”，可以加速皮肤上皮化，促进创面愈合。自体表皮细胞体外扩增和移植技术与传统植皮手术相比具有损伤小、修复面积大、对患者全身情况影响小等优点。但表皮细胞的分离、培养和体外扩增难度很大，细胞培养过程中需要表皮细胞专用培养基，费用昂贵，细胞生长速度缓慢。[0003]成纤维细胞是机体疏松结缔组织的主要细胞成分，在人体中来源广泛，其分离、培养和体外扩增技术已经日臻完善。SebeA等已成功将成纤维细胞诱导成为神经细胞、心肌细胞及多能干细胞。(SebeA1IvicsZ.ReprogrammingofHumanFibroblaststoInducedPluripotentStemCellswithSleepingBeautyTransposon-BasedStableGeneDelivery.MethodsMolB1l.2016;1400:419-27)[0004]分离患者的成纤维细胞进行大量快速的体外扩增，而后将成纤维细胞诱导成为表皮细胞回植于患者自体创面，可以有效缩短创面上皮化时间，起到加速创面愈合的作用。2014年ChenY等将p63和Klf4两种基因导入成纤维细胞，成功诱导出类表皮细胞，但该研究中发现诱导所得细胞与表皮细胞相比在功能方面存在明显差距，并且诱导所得的类表皮细胞存在癌变可能(ChenY1MistryDS,SenGL.Highlyrapidandefficientconvers1nofhumanfibroblaststokeratinocyte-likecells.JInvestDermatol.2014Feb；134(2):335-44.)。到目前为止，未曾有将人原代成纤维细胞转化为表皮细胞后成功应用于创面修复，且无致癌作用的研究报道。【
发明内容】[0005]本发明的目的在于提供一种将人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法。[0006]本发明通过获取临床上包皮环切患者术后的多余包皮，利用酶分离法分离所取组织的表皮和真皮层，并获取单个成纤维细胞进行培养。本发明成纤维细胞转化为表皮细胞过程不包含细胞重编程、慢病毒质粒转染等改变细胞基因组成的操作。所得表皮细胞不仅保留了表皮细胞促进创面愈合，改善创面修复质量的特性，而且该细胞不具有致癌性。同时，本发明研究过程中发现同样条件下培养120天人脂肪成纤维细胞、瘢痕成纤维细胞和肿瘤成纤维细胞均不能转化为表皮细胞。[0007]本发明的第一方面，提供一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，包括以下步骤:将人原代成纤维细胞培养于含体积百分比10%的胎牛血清Fatalbovineserum(FBS)的Dulbecco，smodificat1nofEagle’smediumDulbecco(DMEM)中，37°C、5%C〇2培养箱中培养，每3-5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行1:3传代，培养120天以上。[0008]本发明的鉴定试验证明，采用上述方法，在第100天，部分成纤维细胞转化为表皮细胞，在第120天，90%以上成纤维细胞转化表皮细胞。[0009]优选的，所述的人原代成纤维细胞是皮肤来源的人原代成纤维细胞。更优选采用人包皮组织获取的人原代成纤维细胞。[0010]所述的人原代成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤:将皮肤组织利用洗必泰清洗，再用phosphatebufferedsaline(PBS)清洗，无菌条件下修剪，去除皮下组织，将修剪好的皮片浸入体积百分比0.25%的DispaseII酶，4°C消化16h。在无菌条件下钝性分离皮片表皮和真皮层，将真皮加入体积百分比0.2%胶原酶I37°C水浴消化lh，以体积百分比10%的FBS培养基终止消化后将真皮组织过200目滤器研磨过滤，得到人原代成纤维细胞。[0011]本发明的第二方面，提供一种诱导得到的表皮细胞，采用上述任一所述的人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法制备得到。[0012]所述的诱导得到的表皮细胞的培养和冻存方法:配制含体积百分比10%的二甲基亚砜(DMSO)和体积百分比90%的FBS的冻存培养液，取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来移至15ml离心管中，离心100rpm，5min，去除胰蛋白酶加入适量配制好的冻存培养液，调节细胞的密度为IX107/ml，利用程序降温冰盒冷冻细胞，而后移入液氮冻存备用。[0013]本发明的第三方面，提供上述诱导得到的表皮细胞的应用，用于制备促进创面愈合或改善创面修复质量的药物或制剂。[0014]本发明优点在于:[0015]1、本发明人原代成纤维细胞转化为表皮细胞操作方法简单，重复性好。过程中成纤维细胞和表皮细胞的培养都应用常用的DMEM培养基及细胞培养条件。而既往未有相关发现，可能是因为成纤维细胞转化为表皮细胞所需的转化周期长，本发明是一次意外事件偶然发现120天以上能够转化成表皮细胞。[0016]2、本发明人原代成纤维细胞转化为表皮细胞过程中，并未采用细胞重编程技术外源性诱导细胞基因变化，没有影响成纤维细胞本身的遗传特性。对于后期成纤维细胞转化表皮细胞过程中细胞形态、细胞基因表达和细胞功能等研究打下良好基础;也为后期明确转化机制，缩短转化时间，提高转化效率提供了研究条件。[0017]3、原代表皮细胞的分离、培养和体外扩增难度很大，培养基昂贵，生长缓慢。成纤维细胞的来源比较广泛，培养和扩增的技术相对比较成熟。诱导所得表皮细胞具有理想的功能性和安全性。诱导所得细胞保留了表皮细胞促进创面愈合，改善创面修复质量的特性，同时又不具备形成肿瘤的特性。【附图说明】[0018]图1为本发明中人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的过程。[0019]图2为G418筛选绿色荧光GFP阳性的成纤维细胞转化为表皮细胞的过程。[0020]图3为采用免疫荧光的方法鉴定人原代成纤维细胞向表皮细胞的转化过程。[0021]图4为细胞成球实验。[0022]图5为裸鼠荷瘤实验。[0023]图6为裸鼠全层皮肤缺损移植人原代成纤维细胞组(人原代成纤维细胞组)、人原代表皮细胞(人原代表皮细胞组)、诱导所得表皮细胞(诱导表皮细胞组)及空白对照组的创面愈合过程大体观。[0024]图7为裸鼠全层皮肤缺损移植术后24天病理切片HE染色图。【具体实施方式】[0025]下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。[0026]实施例1.成纤维细胞的制备和培养[0027]1、成纤维细胞的获取[0028]经医院伦理委员会批准，包皮切除患者知情同意，选择肝炎病毒抗体、梅毒抗体及HIV均为阴性的患者的手术切除包皮，利用洗必泰清洗5minX3遍，再用PBS清洗5minX3遍，无菌条件下修建包皮，去除包皮多余的真皮及皮下组织，将包皮修建为0.5X0.5cm大小的皮片，将皮片浸入0.25%DispaseII酶，4°C消化16h。在无菌条件下钝性分离皮片表皮和真皮层，将所得真皮加入0.2%胶原酶I370C水浴消化Ih，以10%FBS培养基终止消化后将真皮组织过200目滤器研磨过滤，获取人原代成纤维细胞。[0029]2、人原代成纤维细胞的培养及鉴定[0030]将人原代成纤维细胞培养于含10%FBS的DMEM中，37°C、5%C02培养箱中培养，每3-5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行1:3传代(结果见图1)。图2采用免疫荧光技术，Vimentin和a-SMA双标鉴定人原代成纤维细胞，证明该细胞为成纤维细胞。[0031]实施例2.成纤维细胞向表皮细胞的转化[0032]1、人原代成纤维细胞转化为表皮细胞[0033]将人原代成纤维细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基，37°C、5%⑶2培养箱中培养，每3-5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行I:3传代。在第100天，部分成纤维细胞转化为表皮细胞，在第120天，90%以上成纤维细胞转化表皮细胞(结果见图1)。图3采用免疫焚光技术，keratin6和keratin18双标鉴定诱导所得表皮细胞，证明该细胞为表皮细胞。[0034]2、G418筛选绿色荧光GFP阳性的成纤维细胞转化为表皮细胞[0035]利用电转染技术将GFP阳性质粒转入人皮肤原代成纤维细胞(300v，10ms)。利用G418将GFP阴性的细胞筛除，显微镜下观察视野中约剩余2个成纤维细胞，均为典型的长条状成纤维细胞，视野中未见表皮细胞。第70天，成纤维细胞形态逐渐转变为多边形；120天，细胞形态转化为多边形和圆形的表皮细胞(结果见图2)。[0036]3、细胞成球实验检测诱导所得表皮细胞的多能性[0037]将人原代成纤维细胞、人原代表皮细胞、诱导所得表皮细胞和肝癌Hep3B细胞加入悬浮球特定培养基(含类胰岛素生长因子、表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子)，7天后显微镜观察每组细胞悬浮球形态，发现肿瘤细胞成球大而且数量多，人原代成纤维细胞和诱导所得表皮细胞可以形成悬浮球，人原代表皮细胞无悬浮球形成(图4A)。采用免疫荧光技术，利用0CT3/4抗体单标悬浮球，发现肿瘤细胞Hep3B悬浮球高表达0CT3/4，而人原代成纤维细胞和诱导所得表皮细胞不表达(图4B)。[0038]实施例3.动物实验[0039]1、裸鼠荷瘤实验检测诱导所得细胞的安全性[0040]取雄性裸鼠10只(由上海西普尔一必凯实验动物有限公司提供)，将人原代表皮细胞和诱导所得表皮细胞用流式细胞仪计数为IX107/ml，选取裸鼠右侧背部皮下注射。裸鼠注射细胞处皮肤可见点状突起，40天后，裸鼠背部皮肤无突起(图5A)。解剖皮下组织进行HE染色，发现诱导所得表皮细胞组有毛囊样结构出现，两组裸鼠均未见肿瘤组织(图5B)。[0041]2、诱导所得表皮细胞修复裸鼠创面实验[0042]取雄性裸鼠24只，常规I%戊巴比妥钠腹腔麻醉，酒精消毒。于每只裸鼠背部右侧分别制作直径为IX1.5cm的长方形全层皮肤缺损创面，将裸鼠随机分为人原代成纤维细胞组、人原代表皮细胞组、诱导表皮细胞组及空白对照组，每组6个创面。人原代成纤维细胞组、人原代表皮细胞组和诱导表皮细胞组均将0.2ml的IX107/ml单细胞悬液均匀滴涂在创面上，空白对照组创面不做任何处理。三组创面应用凡士林纱布覆盖保护创面，用4-0号线将包裹无菌纱布的凡士林纱布打包固定于创周皮肤。术后第6、12、18和24天进行观察拍照(图6)。通过图像分析软件ImageJ比较各组创面愈合率(创面愈合率=(初始创面面积-残余创面面积)/初始创面面积)。[0043]研究结果发现，移植后18天人原代表皮细胞组和诱导表皮细胞组创面愈合速度即明显高于空白对照组(P〈0.05)。移植后24天，人原代表皮细胞组和诱导表皮细胞组创面基本愈合，而人原代成纤维细胞组和空白对照组还残留创面(结果见图6)。移植后24天取材切片行HE染色和免疫组化，可见诱导表皮细胞组出现明显的新生表皮结构，而在空白对照组未观察到此结构;免疫组化结果显示诱导表皮细胞治疗组表皮层基底部有人角蛋白6阳性细胞(图7)。[0044]实验结果表明，本发明转化所得的表皮细胞具有明确的细胞多能性和安全性，在特定培养基中可以培养形成悬浮球，但免疫荧光结果证实该悬浮球不表达肿瘤相关基因，裸鼠荷瘤实验同样也证实了该细胞不具有成瘤特性。另外，该细胞保持了表皮细胞的功能性，在裸鼠创面修复实验中，该细胞和原代表皮细胞同样可以明显加速创面愈合。因此，将人原代成纤维细胞转化为表皮细胞有望成为临床工作中创面修复的一种新手段。[0045]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。【主权项】1.一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:将人原代成纤维细胞培养于含体积百分比10%胎牛血清的DMEM中，37°C、5%⑶2培养，每3-5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行I:3传代，培养120天以上。2.根据权利要求1所述的人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，其特征在于，所述的人原代成纤维细胞为人皮肤组织来源的人原代成纤维细胞。3.根据权利要求2所述的人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，其特征在于，所述的人皮肤组织来源的人原代成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤:将皮肤组织利用洗必泰清洗，再用PBS清洗，无菌条件下修剪，去除皮下组织，将修剪好的皮片浸入体积百分比0.25%DispaseII酶，4°C消化16h;在无菌条件下钝性分离皮片表皮和真皮层，将真皮加入体积百分比0.2%胶原酶I37°C水浴消化lh，以体积百分比10%FBS培养基终止消化后将真皮组织过200目滤器研磨过滤，得到人原代成纤维细胞。4.一种诱导得到的表皮细胞，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述的人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法制备得到。5.根据权利要求4所述的诱导得到的表皮细胞，其特征在于，所述的诱导得到的表皮细胞的培养和冻存方法:配制含体积百分比10%二甲基亚砜和体积百分比90%FBS的冻存培养液，取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来移至15ml离心管中，离心lOOOrpm，5min，去除胰蛋白酶加入适量配制好的冻存培养液，调节细胞的密度为IX17/ml，利用程序降温冰盒冷冻细胞，而后移入液氮冻存备用。6.根据权利要求4所述的诱导得到的表皮细胞的应用，其特征在于，用于制备促进创面愈合或改善创面修复质量的药物或制剂。【文档编号】C12N5/071GK105925524SQ201610389144【公开日】2016年9月7日【申请日】2016年6月2日【发明人】刘善荣,张放,张丹丹【申请人】中国人民解放军第二军医大学