一种固定化酶的制备及水解薯蓣皂素的方法
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，具体涉及一种固定化酶的制备及水解薯蓣皂素的方法。包括将干黄姜原料粉碎、加水浸泡、酶解去杂质、提取薯蓣皂苷、固定化酶制剂组合物水解薯蓣皂苷为薯蓣皂素、航空煤油提取、成品，本发明利用固定化酶技术，将市售价格昂贵的鼠李糖苷酶和β?葡萄糖苷酶成功的应用于附加值较低的工业产品。本发明利用生物方法替代传统酸解薯蓣皂苷显著降低环境污染，本发明方法反应条件温和，成本低。
【专利说明】
-种固定化酶的制备及水解善敲皂素的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种固定化酶的制备及水解馨葫皂素的方法，属于生物医药领域。 技术背景
[0002] 馨葫皂素，是一种白色或微黄色结晶性粉末，被医药界称为"药用黄金"，药用价值 非常重要和广阔。我国的馨葫皂素是世界上稳定增长而且紧缺的激素类原料，在世界酱体 医药原料历史中，我国的馨葫皂素一直处于主导和垄断的地位，占领全世界酱体医药原料 的97%市场份额。其他发达国家几十年来虽然致力于寻找和制作替代品，但是由于先天气 候地理条件和原材料的缺陷，导致替代品造价高昂，产品利用率低等缺点，W至于全世界的 发达国家几十年来被迫只能依赖中国进口。从黄姜中提取的皂素是医药工业合成激素的重 要基始原料，W其为基础可合成加工如双締、沃氏氧化物等中间体原料药产品和黄体酬、醋 酸强的松、布地奈德、醋酸泼尼松、甲基睾丸素、环丙孕酬、米司酬、雄締工酬、倍地米松、去 氨表雄酬等激素类系列产品。运些药物用途极为广泛，是世界仅次于抗生素类的第二大类 药物。
[0003] 但馨葫皂素的加工过程需要采用大量的盐酸对黄姜中的馨葫皂巧进行高溫加压 水解，水解的过程中可将黄姜中的淀粉，纤维之类的物质部分或全部水解，产生的糖液及剩 余的酸对环境造成了严重污染。
【发明内容】
[0004] 基于此，本发明提供一种生产方法简单，对环境无污染，反应条件溫和，生产成本 低的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:包括W下步骤：
[0006] (1)将IOOkg干黄姜原料粉碎，过20目筛，加入到300kg~500kg中，将生料淀粉酶、 普鲁兰酶、真菌Q-淀粉酶加入上述溶液中酶解；
[0007] (2)将步骤(1)中的黄姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[000引（3)将步骤(2)进行固液分离，固体用体积分数为75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液体可用于制造酒精；
[0009] (4)制备固定化酶制剂组合物：
[0010] 将高分子化合物载体加水配制成2g/L浓度的溶液，在溫度为10°C的条件下揽拌， 使其溶解;然后加入与高分子化合物载体质量比为1:30~1:60的酶，揽拌均匀，置于1(TC的 恒溫摇床上，震荡化；将上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C条件下静置 lOmin，使其凝胶固化，收集凝胶小球，并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽滤除去游离水分，收 集得到的凝胶小球即为固定化酶；
[0011] (5)将步骤(3)提取的馨葫皂巧用步骤(4)制备的固定化酶制剂组合物进行酶解， 产生馨葫皂素粗品；
[0012] (6)将步骤巧）的馨葫皂素用航空煤油进行提取，得到含量为98% W上的纯馨葫皂 素。
[0013] 其中：步骤(1)所述的每毫升生料淀粉酶的活力为10000~20000IU，每毫升普鲁兰 酶的活力为1000~5000IU，每毫升真菌a-淀粉酶的活力为50000~100000IU;
[0014] 步骤(4)所述高分子化合物载体壳聚糖，W及壳聚糖与非极性大孔树脂、聚丙締酷 胺中的一种或几种的混合物；
[0015] 步骤(4)所述每毫升所述固定化酶制剂组合物中，0-葡萄糖巧酶的活力为8000~ 12000IU，鼠李糖巧酶的活力为2000~5000IU;
[0016] 步骤(5)所述馨葫皂素粗品是指馨葫皂素质量分数含量在50% W下；
[0017] 本发明中生料淀粉酶购自美国杜邦公司，普鲁兰酶、真菌a-淀粉酶、鼠李糖巧酶、 e-葡萄糖巧酶均为宁夏乙征生物工程有限公司自产，其他试剂均为市售。
[0018] 本发明达到的有益效果：
[0019] 1、本发明中用生料淀粉酶替代传统酸解或者酶解去除淀粉的益处在于:替代酸解 可W减少环境污染，反应条件溫和，成本低;传统酶解是淀粉必须经过糊化才能进行液化糖 化，而本发明专利应用的生料淀粉酶直接可水解生淀粉，淀粉不需要糊化过程，并且添加量 少，淀粉液化效果好，可明显节约能源和降低生产成本。
[0020] 2、本发明中用普鲁兰酶和真菌a-淀粉酶可水解生料淀粉酶不能水解的支链淀粉， 使淀粉水解彻底，运样馨葫皂巧才能彻底从淀粉的包裹中释放出来，提高馨葫皂巧的提取 率。
[0021] 3、用固定化的0-葡萄糖巧酶和鼠李糖巧酶替代酸水解，直接将馨葫皂巧水解为馨 葫皂素，反应条件溫和，固定化酶可W反复利用，节约成本，提高转化率。
[0022] 4、我们惊奇的发现，用壳聚糖做酶的固定化载体，一方面壳聚糖对酶活有非常好 的保护作用；另一方面，壳聚糖可W作为抑菌剂，在整个馨葫皂巧水解过程中可W起到非常 好的抑菌作用，防止杂菌污染产生其他物质。
【具体实施方式】：
[0023] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实 施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节W便于充分理解本发明。但是 本发明能够W很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可W在不违背本发 明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0024] (1)将IOOkg干黄姜原料粉碎，过20目筛，加入到300kg~500kg中，将生料淀粉酶、 普鲁兰酶、真菌Q-淀粉酶加入上述溶液中酶解；
[0025] (2)将步骤(1)中的黄姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0026] (3)将步骤(2)进行固液分离，固体用体积分数为75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液体可用于制造酒精；
[0027] (4)制备固定化酶制剂组合物：
[00%]将高分子化合物载体加水配制成2g/L浓度的溶液，在溫度为10°C的条件下揽拌， 使其溶解;然后加入与高分子化合物载体质量比为1:30~1:60的酶，揽拌均匀，置于1(TC的 恒溫摇床上，震荡化；将上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C条件下静置 lOmin，使其凝胶固化，收集凝胶小球，并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽滤除去游离水分，收 集得到的凝胶小球即为固定化酶；
[0029] (5)将步骤(3)提取的馨葫皂巧用步骤(4)制备的固定化酶制剂组合物进行酶解， 产生馨葫皂素粗品；
[0030] (6)将步骤巧）的馨葫皂素用航空煤油进行提取，得到含量为98% W上的纯馨葫皂 素。
[0031 ]表1本发明方法与普通提取方法对比
[0032]
[0033] 应用结果表明：应用本发明方法后，馨葫皂巧收率与目前正常生产工艺相比平均 提高9%;馨葫皂素收率于目前正常生产工艺相比提高8.9%;纯度与正常工艺相比提高 2% ;溶解度提高3%，说明皂素的纯度和收率都有比较明显的提高。
[0034] 实施例1
[00巧](1)将IOOkg干黄姜原料粉碎，过20目筛，加入到300kg中，将生料淀粉酶20000IU、 普鲁兰酶1000IU、真菌a-淀粉酶100000IU加入上述溶液中酶解；
[0036] (2)将步骤(1)中的黄姜水溶液在自然溫度下酶解2地；
[0037] (3)将步骤(2)进行固液分离，固体用体积分数为75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液体可用于制造酒精；
[0038] (4)制备固定化酶制剂组合物：
[0039] 将壳聚糖加水配制成2g/L浓度的溶液，在溫度为10°C的条件下揽拌，使其溶解;然 后加入与壳聚糖质量比为1:30的0-葡萄糖巧酶12000IU和鼠李糖巧酶2000IU，揽拌均匀，置 于l〇°C的恒溫摇床上，震荡化;将上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C条件 下静置lOmin，使其凝胶固化，收集凝胶小球，并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽滤除去游离水 分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶；
[0040] (5)将步骤(3)提取的馨葫皂巧用步骤(4)制备的固定化酶制剂组合物进行酶解， 产生馨葫皂素粗品；
[0041] (6)将步骤巧）的馨葫皂素用航空煤油进行提取，得到含量为98% W上的纯馨葫皂 素。
[0042] 实施例2
[0043] (1)将IOOkg干黄姜原料粉碎，过20目筛，加入到300kg中，将生料淀粉酶10000IU、 普鲁兰酶5000IU、真菌a-淀粉酶50000IU加入上述溶液中酶解；
[0044] (2)将步骤(1)中的黄姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0045] (3)将步骤(2)进行固液分离，固体用体积分数为75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液体可用于制造酒精；
[0046] (4)制备固定化酶制剂组合物：
[0047] 将壳聚糖与非极性大孔树脂Wl: 1混合后加水配制成2g/L浓度的溶液，在溫度为 l〇°C的条件下揽拌，使其溶解;然后加入与壳聚糖质量比为1:40的0-葡萄糖巧酶8000IU和 鼠李糖巧酶5000IU，揽拌均匀，置于10°C的恒溫摇床上，震荡化；将上述混合液逐滴滴入 3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C条件下静置lOmin，使其凝胶固化，收集凝胶小球，并用 0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽滤除去游离水分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶；
[0048] (5)将步骤(3)提取的馨葫皂巧用步骤(4)制备的固定化酶制剂组合物进行酶解， 产生馨葫皂素粗品；
[0049] (6)将步骤巧）的馨葫皂素用航空煤油进行提取，得到含量为98% W上的纯馨葫皂 素。
[00加]实施例3
[0051 ] (1)将IOOkg干黄姜原料粉碎，过20目筛，加入到300kg中，将生料淀粉酶16000IU、 普鲁兰酶2000IU、真菌a-淀粉酶90000IU加入上述溶液中酶解；
[0052] (2)将步骤(1)中的黄姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0053] (3)将步骤(2)进行固液分离，固体用体积分数为75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液体可用于制造酒精；
[0054] (4)制备固定化酶制剂组合物：
[0055] 将壳聚糖、非极性大孔树脂聚丙締酷胺Wl :1:1混合后加水配制成2g/L浓度的溶 液，在溫度为l〇°C的条件下揽拌，使其溶解;然后加入与壳聚糖质量比为1:50的0-葡萄糖巧 酶10000IU和鼠李糖巧酶3000IU，揽拌均匀，置于1 (TC的恒溫摇床上，震荡化;将上述混合液 逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C条件下静置lOmin，使其凝胶固化，收集凝胶小球， 并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽滤除去游离水分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶；
[0056] (5)将步骤(3)提取的馨葫皂巧用步骤(4)制备的固定化酶制剂组合物进行酶解， 产生馨葫皂素粗品；
[0057] (6)将步骤巧）的馨葫皂素用航空煤油进行提取，得到含量为98% W上的纯馨葫皂 素。
[0化引实施例4
[0059] (1)将IOOkg干黄姜原料粉碎，过20目筛，加入到300kg中，将生料淀粉酶15000IU、 普鲁兰酶3000IU、真菌a-淀粉酶70000IU加入上述溶液中酶解；
[0060] (2)将步骤(1)中的黄姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0061] (3)将步骤(2)进行固液分离，固体用体积分数为75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液体可用于制造酒精；
[0062] (4)制备固定化酶制剂组合物：
[0063] 将壳聚糖与聚丙締酷胺Wl: 1混合后加水配制成2g/L浓度的溶液，在溫度为10°C 的条件下揽拌，使其溶解;然后加入与壳聚糖质量比为1:50的(6-葡萄糖巧酶9000IU和鼠李 糖巧酶4000IU，揽拌均匀，置于10°C的恒溫摇床上，震荡化;将上述混合液逐滴滴入3mol/L 的氯化巧溶液中，在2°C条件下静置lOmin，使其凝胶固化，收集凝胶小球，并用0.4mol/L的 葡萄糖洗涂，抽滤除去游离水分，收集得到的凝胶小球即为固定化酶；
[0064] (5)将步骤(3)提取的馨葫皂巧用步骤(4)制备的固定化酶制剂组合物进行酶解， 产生馨葫皂素粗品；
[0065] (6)将步骤巧）的馨葫皂素用航空煤油进行提取，得到含量为98% W上的纯馨葫皂 素。
[0066] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种固定化酶的制备及水解薯蓣皂素的方法，包括以下步骤： (1) 将IOOkg干黄姜原料粉碎，过20目筛，加入到300kg~500kg中，将生料淀粉酶、普鲁 兰酶、真菌α-淀粉酶加入上述溶液中酶解； (2) 将步骤(1)中的黄姜水溶液在自然温度下酶解24h; (3) 将步骤(2)进行固液分离，固体用体积分数为75%的乙醇100L提取薯蓣皂苷，提取3 次，每次30min，液体可用于制造酒精； (4) 制备固定化酶制剂组合物： 将高分子化合物载体加水配制成2g/L浓度的溶液，在温度为HTC的条件下搅拌，使其 溶解;然后加入与高分子化合物载体质量比为1:30~1:60的酶，搅拌均匀，置于HTC的恒温 摇床上，震荡Ih;将上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化钙溶液中，在2°C条件下静置IOmin， 使其凝胶固化，收集凝胶小球，并用〇.4mol/L的葡萄糖洗涤，抽滤除去游离水分，收集得到 的凝胶小球即为固定化酶； (5) 将步骤(3)提取的薯蓣皂苷用步骤(4)制备的固定化酶制剂组合物进行酶解，产生 薯蓣皂素粗品； (6) 将步骤(5)的薯蓣皂素用航空煤油进行提取，得到含量为98%以上的纯薯蓣皂素。2. 根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备及水解薯蓣皂素的方法，其特征在于:步 骤（1)所述的每毫升生料淀粉酶的活力为10000~20000IU，每毫升普鲁兰酶的活力为1000 ~5000IU，每毫升真菌α-淀粉酶的活力为50000~100000IU。3. 根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备及水解薯蓣皂素的方法，其特征在于:步 骤(4)所述高分子化合物载体壳聚糖，以及壳聚糖与非极性大孔树脂、聚丙烯酰胺中的一种 或几种的混合物。4. 根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备及水解薯蓣皂素的方法，其特征在于:步 骤(4)所述每毫升所述固定化酶制剂组合物中，β-葡萄糖苷酶的活力为8000~12000IU，鼠 李糖苷酶的活力为2000~5000IU。5. 根据权利要求1所述的一种固定化酶的制备及水解薯蓣皂素的方法，其特征在于:步 骤(5)所述薯蓣皂素粗品是指薯蓣皂素质量分数含量在50%以下。
【文档编号】C12N11/10GK105925559SQ201610466954
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】苏二正, 陈龙
【申请人】宁夏乙征生物工程有限公司