除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用图

除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用图
【专利摘要】本发明涉及一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，所述基因包括：(a)编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明除草剂抗性蛋白质特别适合在植物中表达，尤其定位于叶绿体中表达，可以增强对麦草畏除草剂的耐受性，且应用前景广。
【专利说明】
除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途
技术领域
[0001] 本发明设及一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，特别是设及一种对除草 剂麦草畏具有耐受性的蛋白质、其编码基因及用途。
【背景技术】
[0002] 杂草可W迅速耗尽±壤中作物和其它目的植物所需要的有价值的养分。尽管目前 可W得到耐受除草剂草甘麟、草下麟、2,4-D和其它除草剂处理的转基因植物，但是还存在 空白区域，如所控制的杂草范围、开发额外的除草剂耐受性作物等。此外，耐受上述除草剂 的杂草的出现(尽管通常是局部的和可变的)造成了对额外或备选的杂草控制措施的需要。
[0003] 已经证明耐受除草剂性状在商业上是有价值的，因此需要增加耐受其它除草剂的 植物和管理难W控制的杂草种类的选项，W避免过度依赖任何单一除草剂，尤其需要针对 环境友好的并且在控制杂草方面高度有效的除草剂而开发除草剂耐受性。麦草畏是有效且 环境友好的除草剂之一，其已经被农民使用40多年了，麦草畏可用于控制玉米、高梁、小米、 牧草、干草、牧场、甘薦、芦算、草皮和草巧作物中一年生和多年生阔叶杂草和几种窄叶杂 草;与此同时，麦草畏可W伤害许多商业作物和双子叶植物，如大豆、棉花、魏豆、马铃馨、向 日葵和油菜，上述作物/植物对于低水平的麦草畏都是特别敏感的。尽管如此，麦草畏在控 制杂草生长中仍然是有效的，并且是重要的。
[0004] 已报道从嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltopMlia)分离了编码麦草畏单加氧 酶(DMO)的基因，其为铁氧还蛋白依赖型并赋予对麦草畏的耐受性。DMO参与将除草剂麦草 畏(3,6-二氯-邻-茵香酸)转化为无毒的3,6-二氯水杨酸(DCSA)，表达DMO基因的植物具有 对麦草畏的耐受性。
[0005] 由于目前发现的麦草畏耐受型基因均极其相似，所W需要更多新型的麦草畏耐受 型基因W避免过度依赖一种麦草畏耐受型基因，使麦草畏-麦草畏耐受型作物在商业上具 有更广阔的应用空间。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，所述MTHFR66蛋 白在植物中对麦草畏除草剂具有较高的耐受性。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种基因，包括：
[000引（a)编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核巧酸序列;或
[0009] (b)在严格条件下与(a)限定的核巧酸序列互补的核巧酸序列;或
[0010] (C)沈Q ID NO: 1所示的核巧酸序列。
[001 U 所述严格条件可为在6 X SSC術樣酸钢）、0.5%SDS(十二烷基硫酸钢）溶液中，在 65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1XSSC、0.1%SDS各洗膜1次。
[0012]为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控 下的所述基因。
[0013] 进一步地，所述调控序列为叶绿体转运肤，所述叶绿体转运肤与所述基因有效连 接。
[0014] 优选地，所述叶绿体转运肤的核巧酸序列具有SEQ ID N0:7所示的核巧酸序列。
[0015] 为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述基因或所述表达盒的重组载体。
[0016] 为实现上述目的，本发明还提供了一种增加耐受除草剂范围的方法，包括:将SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或所述表达盒编码的蛋白质在植物中与至少一种 不同于SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或所述表达盒编码的蛋白质的第二种 蛋白质一起表达。
[0017] 进一步地，所述第二种蛋白质为草甘麟耐受性蛋白质、草锭麟耐受性蛋白质、a酬 戊二酸双加氧酶、4-径苯基丙酬酸双加氧酶、乙酷乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原化嘟原 氧化酶。
[001引在本发明中，MTHFR66除草剂抗性蛋白质在一种转基因植物中的表达可W伴随着 一个或多个草甘麟耐受性蛋白质和/或草锭麟耐受性蛋白质的表达。运种超过一种的除草 剂耐受性蛋白质在同一株转基因植物中共同表达可W通过遗传工程使植物包含并表达所 需的基因来实现。另外，一种植物(第1亲本)可W通过遗传工程操作表达MTHFR66除草剂抗 性蛋白质，第二种植物(第2亲本)可W通过遗传工程操作表达草甘麟耐受性蛋白质和/或草 锭麟耐受性蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基 因的后代植物。
[0019] 为实现上述目的，本发明还提供了一种选择转化的植物细胞的方法，包括:用所述 基因或所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所述基因或所述表达盒的转化细胞生 长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养所述细胞，所述除草剂 为麦草畏。
[0020] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制杂草的方法，包括:对种植植物的大田 施用有效剂量的麦草畏除草剂，所述植物包含所述基因、所述表达盒或所述重组载体。
[0021] 为实现上述目的，本发明还提供了一种保护植物免受由除草剂引起的损伤的方 法，包括:将所述基因、所述表达盒或所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保 护其免受麦草畏损害量的除草剂耐受性蛋白质。
[0022] 为实现上述目的，本发明还提供了一种赋予植物麦草畏除草剂耐受性的方法，包 括:将所述基因、所述表达盒或所述重组载体导入植物。
[0023] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制草甘麟耐性植物的大田中草甘麟耐受 性杂草的方法，包括:对种植草甘麟耐受性植物的大田施用有效剂量的麦草畏，所述草甘麟 耐受性植物包含所述基因、所述表达盒或所述重组载体。
[0024] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生麦草畏耐受性植物的方法，包括向所 述植物的基因组中引入所述基因或所述表达盒，W产生麦草畏耐受性植物。
[0025] 具体地，所述产生麦草畏耐受性植物的方法包括:通过将亲本植物自交或与第二 种植物杂交而产生麦草畏耐受性植物，所述亲本植物和/或第二种植物包含所述基因或所 述表达盒，所述麦草畏耐受性植物遗传了来自所述亲本植物和/或第二种植物的所述基因 或所述表达盒。
[0026] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对麦草畏除草剂具有耐受性的植物的 方法，包括：
[0027] 种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括所述基因或所述表达盒；
[0028] 使所述植物种子长成植株；
[0029] 用有效剂量麦草畏除草剂喷洒所述植株，收获与其他不具有所述基因或所述表达 盒的植株相比具有减弱的植物损伤的植株。
[0030] 在上述技术方案的基础上，优选地，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜 或甘薦。
[0031] 为实现上述目的，本发明还提供了一种甲基四氨叶酸还原酶耐受麦草畏除草剂的 用途，所述甲基四氨叶酸还原酶具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0032] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生甲基四氨叶酸还原酶的植物耐受麦草 畏除草剂的用途，所述甲基四氨叶酸还原酶具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0033] 将所述的基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本发明中为将外源 DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将 DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须娃介导的DNA导入。
[0034] 本发明可W增加植物对于氧化应激的耐受性，包括但不限于，向植物群提供麦草 畏或麦草畏单加氧酶所介导代谢的产物或其类似物，W改善植物的除草剂耐受性，例如，通 过将麦草畏代谢为DCSA。
[0035] 本发明"麦草畏"（Dicamba)是指3,6-二氯-邻-茵香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲 酸及其酸和盐。其盐包括异丙胺盐、二甘醇锭盐、二甲胺盐、钟盐和钢盐。麦草畏的商业制剂 包括但不限于，Baiwel⑥（作为DMA盐）、Clarity? (BASF,作为DGA盐）、VEレ58-cs-ll?和 伯Iiq 地 Sh? (BASF，作为DGA盐）。
[0036] 目前已经报道的含甲氧基芳控化合物脱甲基酶有4种，分别是（1)畑OsUieske非 血红素型氧化酶），降解麦草畏的DMO(GenBank: AY786443.1)属于S组份畑0类型的氧化酶； (2)细胞色素P450，是一类亚铁血红素一硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药 物、环境化合物在内的外源性物质的代谢，很多含甲氧基芳控化合物脱甲基酶就是运一类 型；（3 )厌氧型四氨叶酸依赖型脱甲基酶，发现于厌氧细菌如热醋穆尔氏菌 (Moorel Iathermoacetica)中，参与木质素降解中间产物如下香酸和香草酸的厌氧降解，也 有研究发现厌氧型四氨叶酸依赖型脱甲基酶也可W厌氧降解麦草畏；（4)好氧型四氨叶酸 依赖型的脱甲基酶（S地ingomonas paucimobilis SYK-6)，参与木质素降解中间产物如下 香酸和香草酸的厌氧降解，但目前还没有运类好氧型四氨叶酸依赖型脱甲基酶能降解麦草 畏的报道。
[0037] MTHFR为5, lO-methylenetetr址y化ofolate reductase,亚甲基四氨叶酸还原酶 蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氨叶酸转化为具有生物学 功能的5-甲基四氨叶酸及其逆反应。
[0038] 本发明所述基因用于植物表达后具有允许在植物中使用麦草畏除草剂的特性，所 述植物中固有耐性不存在或不足W允许使用麦草畏除草剂。此外，本发明所述MTHFR66基因 可W在天然耐性不足W允许选择性时在植物中提供对麦草畏除草剂的防护。向田地使用的 施用量是大约0.0025磅/英亩Qb/a)到大约2(Ub/a麦草畏，更通常从0.25化/a至12化/曰。在 同一大田里(连续或罐混组合地)组合不同化学类别和具有不同作用模式和范围的除草剂 可W提供对大多数需要除草剂控制的潜在杂草的控制。
[0039] 草甘麟被广泛地使用，因为它控制非常广谱的阔叶和禾本科杂草物种。然而，在草 甘麟耐性作物和非作物应用中重复使用草甘麟已经(而且仍将继续)选择使杂草演替为天 然更具有耐性的物种或草甘麟耐受性生物型。多数除草剂耐受性管理策略建议使用有效用 量的罐混除草剂伴侣作为延缓出现耐受性杂草的方法，所述除草剂伴侣提供对同一物种的 控制，但具有不同的作用模式。将MTHFR66基因与草甘麟耐性性状(和/或其他除草剂耐受性 性状)叠加可通过允许对同一作物选择性使用草甘麟和麦草畏而实现对草甘麟耐受性作物 中草甘麟耐受性杂草物种(被麦草畏控制的阔叶杂草物种）的控制。运些除草剂的应用可W 是在含有不同作用模式的两种或更多除草剂的罐混合物中同时使用、在连续使用（如种植 前、出苗前或出苗后）中单个除草剂组合物的单独使用(使用的间隔时间范围从2小时到3个 月），或者备选地，可W在任何时间（从种植作物7个月内到收获作物时(或对于单个除草剂 为收获前间隔，取最短者））使用代表可应用每种化合类别的任意数目除草剂的组合。
[0040] 在控制阔叶杂草中具有灵活性是很重要的，即使用时间、单个除草剂用量和控制 顽固或耐受性杂草的能力。作物中与草甘麟耐受性基因/MTHFR66基因叠加的草甘麟应用范 围可W从250至2500g ae/ha;麦草畏可按照从0.25化/a至12化/a。运些应用的时间的最佳 组合取决于具体的条件、物种和环境。
[0041] 除草剂制剂(如醋、酸或盐配方或可溶浓缩剂、乳化浓缩剂或可溶液体)和罐混添 加剂(如佐剂或相容剂)可显著影响给定的除草剂或一种或多种除草剂的组合的杂草控制。 任意前述除草剂的任意化学组合均在本发明的范围内。
[0042] 本领域技术人员所熟知的，两种或更多作用模式的组合在提高受控杂草谱和/或 天然更具耐受性物种或耐受性杂草物种上的益处还可扩展到通过人工（转基因或非转基 因）在作物中产生除草甘麟耐性作物外的除草剂耐性的化学品。事实上，可W单独或W多重 组合叠加编码W下耐受性的性状W提供有效控制或防止杂草演替对任意前述类别的除草 剂的耐受性的能力:草甘麟耐受性(如耐受性植物或细菌6?5?5、60乂、641')、草锭麟耐受性 (如PAT、Bar )、苯氧基生长素耐受性(如2，4-D、二甲四氯耐受性基因如AAD-I、AAD-12等）乙 酷乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂耐受性(如咪挫嘟酬、横酷脈、S挫喀晚、横苯胺、喀晚硫代 苯甲酸和其它化学品耐受性基因如AHAS、Csr 1、SurA等）、漠草腊耐受性(如Bxn )、对HPPD (4- 径苯基丙酬酸双加氧酶)酶抑制剂的耐受性、对八氨番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂的耐受 性、对光系统n抑制性除草剂的耐受性(如PSbA)、对光系统I抑制性除草剂的耐受性、对原 化嘟原氧化酶K(PPO)抑制性除草剂耐受性（如PPO-I )、对苯脈除草剂的耐受性（如 CYP76B1)、二氯甲氧苯酸降解酶等等。
[0043] 关于其他除草剂，一些其它优选的ALS抑制剂包括S挫喀晚横苯胺(氯醋横草胺、 双氯横草胺、挫喀横草胺、横草挫胺和喀晚并=挫类横胺）、喀晚硫代苯甲酸和氣挫横隆。一 些优选的HPPD抑制剂包括甲基横草酬、异恶挫草酬和横草酬。一些优选的PPO抑制剂包括丙 烘氣草胺、氣丙喀草醋、挫草酬、甲横草胺和二苯酸(如=氣簇草酸、氣横胺草酸、乳氣禾草 灵和乙氧氣草酸）。
[0044] 此外，可W将MTHFR66基因单独或与其它除草剂耐受作物特征叠加后再与一种或 多种其它输入(如昆虫耐受性、真菌耐受性或胁迫耐性等)或输出（如提高的产量、改进的油 量、提高的纤维品质等)性状叠加。因此，本发明可用于提供W灵活且经济地控制任何数目 的农学害虫的能力和提高作物品质的完整农学解决方案。
[0045] 本发明MTHFR66基因能降解麦草畏除草剂，是重要的除草剂耐受作物和选择标记 物特征可能性的基础。
[0046] 本发明可进行转基因表达，可W控制几乎所有阔叶杂草的除草剂组合。MTHFR66基 因可作为优秀的除草剂耐受作物性状与例如其它除草剂耐受作物性状(如草甘麟耐受性、 草锭麟耐受性、苯氧基生长素耐受性、ALS抑制剂(如咪挫嘟酬类、横酷脈类、=挫并喀晚横 酷胺类)耐受性、漠草腊耐受性、HPPD抑制剂耐受性、PPO抑制剂耐受性等)和昆虫耐受性性 状(CrylAb、CrylF、Vip3、其它苏云金芽抱杆菌蛋白质或非芽抱杆菌属来源的昆虫耐受性蛋 白等)叠加。此外，MTHFR66基因可作为选择标记物辅助选择用另一个基因或基因群遗传改 造的植物的原代转化体。
[0047] 本发明的除草剂耐性作物性状可用在与其它除草剂耐性作物性状(包括但不限于 草甘麟耐性)的新组合中。由于对除草剂(如草甘麟)的新获得的耐受性或固有的耐性，运些 性状组合产生控制杂草物种的新方法。因此，除了除草剂耐性作物性状，本发明的范围包括 使用除草剂控制杂草的新方法，其中通过转基因作物中的所述酶产生对所述除草剂的耐 性。
[0048] 本发明可应用于多种植物中，如拟南芥、烟草、大豆、棉花、稻、玉米和芸臺。本发明 还可用于多种其它单子叶（如牧草禾本科或草坪草禾本科)和双子叶作物(如首猜、=叶草、 乔木物种等）。类似的，麦草畏(或其它MTHFR66底物)可更积极地用于耐性适中的禾本科作 物中，由此性状得到的提高的耐性将为种植者提供能W更有效的用量和更广的施用时间来 使用运些除草剂而无作物损伤风险的可能性。
[0049] 本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物 细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。
[0050] 本发明中所述"耐受性"和所述"抗性"是可遗传的，并允许植物在除草剂对给定植 物进行一般除草剂有效处理的情况下生长和繁殖。正如本领域技术人员所认可的，即使植 物受到除草剂处理的一定损伤程度明显，植物仍可被认为"耐受性"或"抗性"。本发明中术 语"耐性"比术语"耐受性"更广泛，并包括"耐受性"，W及特定植物具有的抵抗除草剂诱导 的各种程度损伤的提高的能力，而在同样的除草剂剂量下一般导致相同基因型野生型植物 损伤。
[0051] 本发明中所述的多核巧酸和/或核巧酸形成完整"基因"，在所需宿主细胞中编码 蛋白质或多肤。本领域技术人员很容易认识到，可W将本发明的多核巧酸和/或核巧酸置于 目的宿主中的调控序列控制下。
[0052] 本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肤、终止子、增强子、前导序列、 内含子W及其它可操作地连接到所述MTHFR66基因的调节序列。
[0053] 所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的"植物中可表达的启动子"是指确保 与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型 启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花挪菜花叶病毒的 35S启动子、玉米Ubi启动子、水稻G0S2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可 为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表 达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定），如PEP簇化酶启动子。备选地， 植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式 的启动子是指当植物经受机械或由昆虫哨食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表 达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃馨和西红柿 的蛋白酶抑制基因（pin巧PpinII)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。
[0054] 所述转运肤(又称分泌信号序列或导向序列）是指导转基因产物到特定的细胞器 或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肤可W是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肤 序列祀向叶绿体，包括但不限于拟南芥叶绿体转运肤AtCTP2,或者利用'邸EL'保留序列祀 向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP祀向液泡。
[0055] 所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列（脑屯、肌炎病 毒5 '非编码区）；马铃馨Y病毒组前导序列，如MDMV(玉米矮缩花叶病毒)前导序列;人类免疫 球蛋白质重链结合蛋白质(BiP);首猜花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4);烟草花叶病毒(TMV)前导序列。
[0056] 所述增强子包含但不限于，花挪菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV)增 强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木馨脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫莱莉花叶病毒 (MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭巧 草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生稱绿线条花叶病毒(P化SV)增强子。
[0057] 对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛 素内含子、A化内含子1、薦糖合酶内含子或水稻Actl内含子。对于双子叶植物应用而言，所 述内含子包含但不限于，CAT-I内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和"超级泛素"内含 子。
[0058] 所述终止子可W为在植物中起作用的适合多聚腺巧酸化信号序列，包括但不限 于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)姻脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺巧酸化 信号序列、来源于蛋白酶抑制剂n (Pinn)基因的多聚腺巧酸化信号序列、来源于魏豆 ssRUBISCO E9基因的多聚腺巧酸化信号序列和来源于a-微管蛋白（a-tubulin)基因的多聚 腺巧酸化信号序列。
[0059] 本发明中所述"有效连接"表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对 相连序列来说需要的功能。在本发明中所述"有效连接"可W为将启动子与感兴趣的序列相 连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且 想要获得该蛋白的表达时"有效连接"表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到 的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白 的表达时，制造运样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始 密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表 达时，制造运样的连接，使得5'非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结， 并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读 码框的。可W "有效连接"的核酸序列包括但不限于:提供基因表达功能的序列（即基因表达 元件，例如启动子、5'非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3'非翻译区域、聚腺巧化位点和/ 或转录终止子）、提供DNA转移和/或整合功能的序列（即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶 识别位点、整合酶识别位点）、提供选择性功能的序列（即抗生素耐受性标记物、生物合成基 因）、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列（即多接头序列、位点 特异性重组序列）和提供复制功能的序列（即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序 列）。
[0060] 本发明可赋予植物新除草剂耐受性性状，并且未观察到对表型包括产量的不良影 响。本发明中植物能耐受住如至少一种受试除草剂1倍的应用水平。运些耐性水平的提高在 本发明的范围之内。例如可对本领域已知的多种技术进行可预见到的优化和进一步发展， W增加给定基因的表达。
[0061] 本发明中，所述除草剂抗性蛋白质为MTHFR66氨基酸序列，如序列表中SEQ ID NO: 2所示。所述除草剂抗性基因为MTHFR66核巧酸序列，如序列表中SEQ ID N0:1所示。所述除 草剂抗性基因为用于植物，除了包含由MTHFR66核巧酸序列编码的蛋白质的编码区外，也可 包含其他元件，例如编码转运肤的编码区、编码选择性标记的蛋白质或赋予昆虫耐受性的 蛋白质的编码区。
[0062] 本发明中MTHFR66除草剂抗性蛋白质对麦草畏除草剂具有耐性。本发明中的植物， 在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含MTHFR66核巧酸序列，通过表达有效量的该蛋 白而保护其免受除草剂的威胁。有效量是指未损伤的或轻微损伤的剂量。同时，植物在形态 上应是正常的，且可在常规方法下培养W用于产物的消耗和/或生成。
[0063] 本发明提供了一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，具有W下优点：
[0064] 1、对除草剂耐受性强。本发明MTHFR66基因可W降解麦草畏除草剂，优化MTHFR66 基因采用玉米和大豆的偏好密码子，使其特别适合在植物中表达;优化MTHFR66基因可W赋 予转基因植物麦草畏除草剂耐受性，且所述优化MTHFR66基因定位于叶绿体中表达可W增 强转基因植物对麦草畏除草剂的耐受性。
[0065] 2、应用前景广阔。本发明除草剂抗性蛋白质MTHFR66为甲基四氨叶酸还原酶，其不 同于已知的麦草畏耐受型基因，因此可W扩大麦草畏耐受型在植物上应用范围。
[0066] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【附图说明】
[0067] 图1为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的MTHFR66基因在表达宿主菌 BL21 (DE3)中表达的蛋白SDS-PAGE电泳图；
[0068] 图2为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的诱导表达的MTHFR66蛋白降 解麦草畏的HPLC图谱；
[0069] 图3为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的诱导表达的MTHFR66蛋白在 不同浓度的四氨叶酸条件下降解麦草畏的HPLC图谱；
[0070] 图4为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的诱导表达的MTHFR66蛋白代 谢5-甲基四氨叶酸的HPLC图谱；
[0071] 图5为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的诱导表达的MTHFR66蛋白代 谢5-甲基四氨叶酸的中间产物鉴定一级质谱图；
[0072] 图6为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有优化MTHFR66核巧酸序 列的重组克隆载体DBNOl-T构建流程图；
[0073] 图7为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有优化MTHFR66核巧酸序 列的重组表达载体DBNl 11101构建流程图；
[0074] 图8为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有天然MTHFR66核巧酸序 列的重组表达载体DBNl 11 IOlN结构示意图；
[0075] 图9为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的转基因拟南芥Tl植株除草 剂耐受性效果图；
[0076] 图10为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有优化MTHFR66核巧酸 序列的重组表达载体DBN-HT130066构建流程图；
[0077] 图11为本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的含有天然MTHFR66核巧酸 序列的重组表达载体DBN-HT130066N结构示意图。
【具体实施方式】
[0078] 下面通过具体实施例进一步说明本发明除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途的 技术方案。
[0079] 第一实施例、甲基四氨叶酸还原酶MTHFR66的体外高效表达及功能鉴定
[0080] 1、细菌表达载体的构建和重组微生物获得 [0081 ] (1)MTHFR66 基因的 PCR 扩增
[00剧设计一对引物：
[0083] 引物 1:5-GGAATTCCATATGGGCTCGCCCGTTATGG-3 (下划线为Nde I酶切位点），如序列 表中沈Q ID NO:4所示；
[0084] 引物2:5-CCGCTCGAGGTGCTTTCGAGCGTAGTCAG-3 (下划线为趾〇I酶切位点，如序列表 中沈Q ID NO:5所示；
[0085] 用下述PCR扩增体系扩增MTHFR66基因：
[0086]
12345 模板DNA(即天然MTHFR66核巧酸序列）如序列表中SEQ ID N0:3所示。PCR反应条件 为:98°C变性Imin;然后进入下列循环:98°C变性15s，55°C退火15s，72°C延伸Imin,共29个 循环;最后72°C延伸lOmin，冷却至室溫。 2
[008引（2)细菌表达载体的构建和重组微生物获得 3 用限制性内切酶NdeI和趾Ol分别酶切上述PCR扩增产物和细菌表达载体pET-29a ( + )，将切下的MTHFR66核巧酸序列片段与酶切后的细菌表达载体祀T-29a( + )进行酶连，将 酶连产物转化到表达宿主菌化21 (DE3)，获得重组微生物化21 (MTHFR66)。 4 2、MTHFR66蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化 5 所述重组微生物化2UMTHFR66)在IOOmL的LB培养基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物 5g/L，化C110g/L，卡那霉素100mg/L，用化0H调pH至7.5)中培养至浓度为0D600nm = 0.6- 0.8,加入浓度为0.4mM的异丙基硫代半乳糖巧（IPTG)，在溫度16°C下诱导20小时。离屯、，收 集菌体，用 20ml Tris-HCl buffer(100mM，pH 8.0)重悬菌体，超声破碎（X0-900D ultrasonic processor ultrasonic processor,30%intensity)lOmin，然后离屯、，收集上 清，用儀离子亲和层析柱对MTHFR66蛋白进行纯化，用SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化结果，条 带大小和理论预测的条带大小(31.79kDa)-致(如图1所示）。
[0092] 3、测定MTHFR66蛋白的酶活力
[OOW] 酶活反应体系（300化）：含有ImM底物（麦草畏）、0.2mg MTHFR66、lmM四氨叶酸 (THF)，缓冲体系为浓度1 OOmM的化iS-肥1 (抑8.0)，溫度30°C下在水浴锅中反应1小时，然 后在沸水中放置Imin，终止反应。反应液冷冻干燥后加入30化L甲醇溶解冻干物，高效液相 色谱化PLC)检测麦草畏中间代谢产物3,6-二氯水杨酸(DCSA)的生成量。一个酶活力单位定 义为:在抑8.0、溫度30°C条件下Imin内降解麦草畏生成Inmol产物DCSA所需要酶的量，Wu 表不。
[0094] 上述实验结果表明：纯化后的MT册R66蛋白能在1小时内产生0.15mM的DCSA， MTHFR66蛋白的比酶活为3.7抓/mg(如图2所示）。
[00M] 4、测定MTHFR66蛋白在微量四氨叶酸存在条件下的麦草畏脱甲基功能
[0096] 酶活反应体系（300化）：含有ImM底物(麦草畏）、0.2mg MTHFR66和分别含O.OlmM、 0.02mM、0.OSmM和ImM四氨叶酸(THF)，缓冲体系为浓度IOOmM的Tris-肥KpH 8.0)，溫度30 °C下在水浴锅中反应1小时，然后在沸水中放置Imin，终止反应。反应液冷冻干燥后加入300 化甲醇溶解冻干物，高效液相色谱化PLC)检测麦草畏中间代谢产物DCSA的生成量。
[0097] 上述实验结果表明：纯化后的MTHFR66蛋白在0.0 lmM的四氨叶酸存在时，就能够将 麦草畏脱甲基形成DCSA，在0.5mM的四氨叶酸存在时能够将ImM的麦草畏全部脱甲基产生 DCSA(如图3所示）。
[009引第二实施例、甲基四氨叶酸还原酶MTHFR66的水解酶功能鉴定及产物鉴定
[0099] 1、MTHFR66蛋白的水解酶功能测定
[0100] 酶活反应体系（300化）：含有0.2mg MTHFR66、lmM 5-甲基四氨叶酸巧-C曲-H4F)，缓 冲体系为浓度IOOmM的化iS-HCl(pH 8.0)，溫度30°C下在水浴锅中反应1小时，然后在沸水 中放置Imin，终止反应。反应液冷冻干燥，干燥物加入30化L的0.1mol/L的K此P〇4(pH 6.8， 1%抗坏血酸、〇.l%0-琉基乙醇）溶解，用滤膜(孔径0.22WI1)过滤，采用高效液相色谱进行 检测。液相色谱条件为：流动相为0.05mol/L的K此P〇4(pH 3.0):乙腊（90:10，V/V) ,Zorbax C2180DS S地erex反相柱（5皿，4.6mm X 250mm，Agi lent，USA)，柱溫为23°C，紫外检测器，测 定波长为298nm，进样量为20化，流速为1. OmL/min。外标法按峰面积定量。
[0101] 上述HPLC结果表明：纯化后的MTHFR66蛋白能够在没有电子受体NAD+存在的条件 下，将5-甲基四氨叶酸转化成其他的物质(如图4所示）。
[0102] 2、产物鉴定
[0103] 代谢产物通过HPLC-MS(高效液相色谱和质谱联用）进行鉴定，条件为：流动相为 0.05mol/L的KH2P〇4(pH 3.0):乙腊（90:10，V/V) ,Zorbax XDB-C18，5cmX0.46畑1，1.8mm反相 柱（5皿，4.6mmX250mm，Agilent，USA)，流速为0.25mL/min。MS分析使用ESI模式，检测器为 Agilent G6410B Triple Quad Mass Spectrometer〇
[0104] 结果表明：纯化后的MTHFR66蛋白能够在没有电子受体NAD+的条件下将5-甲基四 氨叶酸水解产生四氨叶酸(如图5所示）。
[0105] 第=实施例、基因序列的优化和合成
[0106] 1、植物优化序列的获得
[0107] 保持所述甲基四氨叶酸还原酶MTHFR66的氨基酸序列（289个氨基酸，如序列表中 SEQ ID NO: 2所示)不改变，对编码相应于所述甲基四氨叶酸还原酶MTHFR66的氨基酸序列 的MTHFR66核巧酸序列(870个核巧酸)进行密码子优化改造。
[0108] 密码子优化改造的策略主要包括:依据单子叶植物玉米和双子叶植物大豆的偏好 密码子、不稳定序列的改造、G+C含量的提高等。天然基因的G+C含量较低，A巧含量很高，一 方面，如果直接将天然基因序列导入植物基因组中可能会被误认为是植物基因调控序列， 同时在运些天然基因中会出现A+T富含区域，类似于基因启动子中的TATA盒，运些区域则会 导致基因的异常转录;另一方面，在转录的mRNA中聚腺巧酸化信号序列(AAUAAA)、与mRNA剪 接相关的小RNA互补序列会导致RNA不稳定。因此，改造后的基因序列除了有较高的G+C含量 夕h还改变DNA和转录成mRNA中出现的不稳定结构，从而保证蛋白的正常翻译;再一方面，应 用玉米和大豆的偏好密码子改造天然基因序列，排除酶切位点和一些序列的修饰。
[0109] 基于W上优化策略，得到优化MTHFR66核巧酸序列，优化MTHFR66核巧酸序列共含 有870个核巧酸，编码289个氨基酸，其核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0110] 2、合成优化MTHFR66核巧酸序列
[0111] 优化MTHFR66核巧酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;合成的所述优化 MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID NO: 1)的5'端还连接有SacI酶切位点，所述优化MTHFR66核巧 酸序列（SEQ ID NO: 1)的3'端还连接有KasI酶切位点。
[0112] 第四实施例、拟南芥重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌
[0113] 1、构建含有优化MTHFR66核巧酸序列的拟南芥重组克隆载体
[0114] 将合成的优化MTHFR66核巧酸序列连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison，USA， CAT:A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体 DBN01-T，其构建流程如图6所示(其中，Amp表示氨节青霉素抗性基因；fl表示隧菌体n的复 制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；17为T7RNA聚合酶启动子； mMTHFR66为优化MTHFR66核巧酸序列(SEQ ID N0:1);MCS为多克隆位点）。
[0115] 然后将重组克隆载体DBNOl-T用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞(Transgen， Bei jing，化ina，CAT:CD501)，其热激条件为:50化大肠杆菌Tl感受态细胞、10化质粒DNA(重 组克隆载体DBNOI-T )，42 °C水浴30秒;37 °C振荡培养1小时（100巧m转速下摇床摇动），在表 面涂有IPTG(异丙基硫代-P-D-半乳糖巧)和X-gal (5-漠-4-氯-3-日引噪-P-D-半乳糖巧）的氨 节青霉素（lOOmg/L)的LB平板(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/L，化Cl lOg/L，琼脂15g/L， 用化OH调抑至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取 物5g/L，化Cl lOg/L，氨节青霉素lOOmg/L，用化OH调pH至7.5)中于溫度37°C条件下培养过 夜。碱法提取其质粒:将菌液在1200化pm转速下离屯、Imin,去上清液，沉淀菌体用10化1冰预 冷的溶液I (25mM hiS-HCl，IOmM EDTA(乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，P册.0)悬浮;加入200 化新配制的溶液II (0.2M化OH，1 % SDS(十二烷基硫酸钢）），将管子颠倒4次，混合，置冰上 3-5min;加入15化L冰冷的溶液III(3M醋酸钟，5M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-lOmin; 于溫度4 °C、转速1200化pm条件下离屯、5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室溫 放置5min;于溫度4°C、转速120(K)rpm条件下离屯、5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70% 的乙醇洗涂后惊干；加入30化含RNase (20yg/mL)的TE(IOmM IYiS-肥1，ImM EDTA，抑8.0)溶 解沉淀;于溫度37 °C下水浴30min，消化RNA;于溫度-20°C保存备用。
[0116] 提取的质粒经SacI和KasI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组 克隆载体DBNOl-T中插入的所述优化MTHFR66核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 1所示的核 巧酸序列，即优化MTHFR66核巧酸序列正确插入。
[0117] 2、构建含有优化MTHFR66核巧酸序列的拟南芥重组表达载体DBNl 11101
[0118] 用限制性内切酶Sac巧日KasI分别酶切重组克隆载体DBNOl-T和表达载体DBNBC-Ol (载体骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA机构可W提供）），将切下的优化MTHFR66核巧酸序列片段 插到表达载体DBNBC-Ol的SacI和KasI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技 术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN111101，其构建流程如图7所示化an:卡那霉素基 因；RB:右边界;prAtUbilO:拟南芥Ubiquitin(泛素）10基因启动子（SEQ ID N0:6);AtCTP2: 拟南芥叶绿体转运肤(SEQ ID N0:7);mMTHFR66:优化MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID N0:1); tNos:姻脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO: 8);prCaMV35S:花挪菜花叶病毒35S启动子 (沈Q ID N0:9);PAT:草下麟乙酷转移酶基因（SEQ ID N0:10);tCaMV35S:花挪菜花叶病毒 35S终止子(SEQ ID N0:11);LB:左边界）。
[0119] 将重组表达载体DBN111101用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞，其热激条件 为:5化L大肠杆菌Tl感受态细胞、1化L质粒DNA(重组表达载体DBNl 11101)，42°C水浴30秒； 37°C振荡培养1小时（10化pm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素化anamycin)的LB 固体平板(膜蛋白腺1 Og/L，酵母提取物5g/L，NaCl lOg/L，琼脂15g/L，用化OH调抑至7.5)上 于溫度37°C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取 物5g/L，化Cl lOg/L，卡那霉素50mg/L，用化OH调抑至7.5)中于溫度37°(：条件下培养过夜。 碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SacI和KasI酶切后鉴定，并将阳性克隆进 行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN111101在SacI和KasI位点间的核巧酸序列为序列 表中SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列，即优化MTHFR66核巧酸序列。
[0120] 3、构建含有天然MTHFR66核巧酸序列的拟南芥重组表达载体DBNl 11 IOlN
[0121] 按照本实施例中1所述的构建含有优化MT册R6 6核巧酸序列的重组克隆载体 DBNOl-T的方法，利用天然MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID ^:3)构建含有天然^邸366核巧酸 序列的重组克隆载体DBNO1R-T。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBNO1R- T中插入的天然MTHFR66核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列，即天然 MTHFR66核巧酸序列正确插入。
[0122] 按照本实施例中2所述的构建含有优化MTHFR66核巧酸序列的重组表达载体 DBNl 11101的方法，利用天然MTHFR66核巧酸序列构建含有天然MTHFR66核巧酸序列的重组 表达载体DBN111101N，其载体结构如图8所示(载体骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA机构可W提 供）；Kan:卡那霉素基因；RB:右边界；prAt师ilO:拟南芥师iquitin(泛素）10基因启动子 (沈Q ID N0:6);AtCTP2:拟南芥叶绿体转运肤（SEQ ID N0:7);MTHFR66:天然MTHFR66核巧 酸序列（SEQ ID N0:3);tNos:姻脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID N0:8);prCaMV35S:花挪 菜花叶病毒35S启动子（SEQ ID N0:9);PAT:草下麟乙酷转移酶基因（SEQ ID N0:10); t化MV35S:花挪菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID N0:11);LB:左边界）。对阳性克隆进行测序 验证，结果表明重组表达载体DBNl 11 IOlN中插入的天然MTHFR66核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核巧酸序列，即天然MTHFR66核巧酸序列正确插入。
[0123] 4、拟南芥重组表达载体转化农杆菌
[0124] 对己经构建正确的重组表达载体DBNl 11101和DBNl 11 IOlN用液氮法转化到农杆菌 GV3101中，其转化条件为：100化农杆菌GV310U3化质粒DNA(重组表达载体）；置于液氮中10 分钟，37°C溫水浴10分钟；将转化后的农杆菌GV3101接种于LB试管中于溫度28°C、转速为 20化pm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB 平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶酶切 DBNl 11101和DBNl 1110 IN后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBNl 1110 ^roBNllllOlN 结构完全正确。
[0125] 第五实施例、转基因拟南芥植株的获得
[0126] 将野生型拟南芥种子悬浮于0.1%琼脂糖溶液中。将悬浮的种子在4°C下保存2天 W完成对休眠的需要W保证种子同步萌发。用赔石混合马粪±并用水地下灌概至湿润，使 ±壤混合物排水24小时。将预处理后的种子种在±壤混合物上并用保湿罩覆盖7天。使种子 萌发并在恒溫(22°C)恒湿(40-50%)光强度为120-150皿ol/m2秒的长日照条件（16小时光 照/8小时黑暗）下在溫室中培养植物。开始用霍格兰营养液灌概植物，接着用去离子水灌 概，保持±壤潮湿但不湿透。
[0127] 使用花浸泡法转化拟南芥。用选取的农杆菌菌落接种一份或多份15-30mL含卡那 霉素（lOOmg/L)和利福平（lOmg/L)的YEP培养液的预培养物。W 22化pm将培养物在28 °C恒速 摇动解育过夜。每个预培养物用于接种两份500ml含卡那霉素（lOOmg/L)和利福平（lOmg/L) 的YEP培养液的培养物并将培养物在28°C持续摇动解育过夜。室溫W约8700Xg离屯、10分钟 沉淀细胞，弃去得到的上清液。将细胞沉淀轻柔重悬于SOOmL渗透培养基中，所述渗透培养 基含有1/2 XMS盐/B5维生素、10% (w/v)薦糖、0.044測节氨基嚷岭（10化/L( Img/血DMSO中 的原液））和30化L/L SiIvet L-77。将约1月龄的植物在培养基中浸泡15秒，确保浸没最新 的花序。接着将植物侧面放倒并覆盖(透明或不透明）24小时，接着用水洗涂并竖直放置。在 22°CW16小时光照/8小时黑暗的光周期培养植物。浸泡约4周后收获种子。
[012引将新收获的（优化MTHFR66核巧酸序列和天然MTHFR66核巧酸序列）Tl种子在室溫 干燥7天。将种子种在26.5 X51cm萌发盘中，每盘接受200mg Tl种子(约10000个种子），所述 种子事先已悬浮于40mL 0.1%琼脂糖溶液并在4°C下保存2天W完成对休眠的需要W保证 种子同步萌发。
[0129] 用赔石混合马粪±并用水地下灌概至湿润，利用重力排水。用移液管将预处理后 的种子(每个40mL)均匀地种在±壤混合物上，并用保湿罩覆盖4-5天。在使用出苗后喷洒草 锭麟(选择共转化的PAT基因）进行最初转化体选择前1天移去罩。
[0130] 在7个种植天数后（DAP)并于IlDAP再次使用DeVi化iss压缩空气喷嘴WlOmL/盘 (70化Aa)的喷洒体积用Libedy除草剂(200g ai/L的草锭麟）的0.2%溶液喷洒Tl植物(分 别为子叶期和2-4叶期），W提供每次应用280g ai Aa有效量的草锭麟。在最后喷洒后4-7天 鉴定存活株(生长活跃的植物），并分别移植到用马粪上和赔石制备的7cm X 7cm的方盆中 (每盘3-5棵）。用保湿罩覆盖移植的植物3-4天，并如前置于22 °C培养室中或直接移入溫室。 接着移去罩并在测试MTHFR66基因提供麦草畏除草剂耐受性的能力之前至少I天将植物栽 种到溫室(22 ± 5°C，50 ± 30%RH，14小时光照：10小时黑暗，最小50化E/WV天然+补充光）。
[0131] 第六实施例、转基因拟南芥植株的除草剂耐受性效果检测
[0132] 用MTHFR66基因进行首次拟南芥转化。首先使用草锭麟选择方案从未转化种子背 景中选择Tl转化体。转化重组表达载体DBN111101的为定位于叶绿体的转入优化MTHFR66核 巧酸序列的拟南芥植株(At mMTHFR66)，转化重组表达载体DBN111101N的为定位于叶绿体 的转入天然MTHFR66核巧酸序列的拟南芥植株（At MTHFR66)。筛选了约20000个At mMTHFR66的Tl种子，并鉴定了 197株Tl代阳性转化子(PAT基因），约1.0 %的转化效率;筛选了 约20000个At MTHFR66的Tl种子，并鉴定了 182株Tl代阳性转化子(PAT基因），约0.91 %的转 化效率。将转入优化MTHFR66核巧酸序列的拟南芥Tl植株(At-mMTHFR66)、转入天然MTHFR66 核巧酸序列的拟南芥Tl植株(At-MTHFR66)和野生型拟南芥植株(播种后18天)对麦草畏进 行除草剂耐受性效果检测。
[0133] 分别将转入优化MTHFR66核巧酸序列的拟南芥Tl植株、转入天然MTHFR66核巧酸序 列的拟南芥Tl植株和野生型拟南芥植株用麦草畏（560gae/ha，l倍大田浓度）和空白溶剂 (水)喷洒。喷施7天和14天后统计植株耐受性情况:7天后生长状况和空白溶剂(水)一致的 划为高抗植株，7天后有莲座叶卷曲的划为中抗植株，14天后仍不能抽苔的划为低抗植株， 14天后死亡的划为不抗植株。由于每株拟南芥Tl植株是独立的转化事件，可W预计在给定 剂量内个体Tl应答的显著差异。结果如表1和图9所示。
[0134] 表1、转基因拟南芥Tl植株除草剂耐受性实验结果
[0135]
[0136] 对于拟南芥，560g ae/ha麦草畏是将敏感植物与具有平均耐受性水平的植物区分 开来的有效剂量。表1和图9的结果表明：优化MTHFR66基因赋予个体拟南芥植物麦草畏除草 剂耐受性（只有部分植株具有耐受性的原因是由于Tl代植物插入位点是随机的，因而耐受 性基因的表达水平有差异，表现出耐受性水平的差异）；相比于At-MTHFR66的Tl植株，At- mMTHFR66的Tl代拟南芥后代部分能够产生更高的麦草畏除草剂耐受性，表明所述MTHFR66 基因经植物密码子优化可W增强拟南芥植物对麦草畏除草剂的耐受性;而野生型拟南芥则 不具有麦草畏除草剂耐受性。
[0137] 第屯实施例、玉米重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌
[0138] 1、构建含有优化MTHFR66核巧酸序列的玉米重组表达载体DBN-HTl 30066
[0139] 用限制性内切酶Sac巧日KasI分别酶切重组克隆载体DBNOl-T和表达载体DBNBC-02 (载体骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA机构可W提供）），将切下的优化MTHFR66核巧酸序列片段 插到表达载体DBNBC-02的SacI和KasI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技 术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN-HT130066，其构建流程如图10所示化an:卡那霉 素基因；RB:右边界;prUbi:玉米Ubiquitin(泛素）1基因启动子(SEQ ID ^:12);41口？2:拟 南芥叶绿体转运肤（SEQ ID NO:7);mMTHFR66:优化MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID NO:l); tNos:姻脂碱合成酶基因的终止子（SEQ ID NO:8);PMI:憐酸甘露糖异构酶基因（SEQ ID N0:13);LB:左边界）。
[0140] 将重组表达载体DBN-HT130066用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞，其热激条 件为：50化大肠杆菌Tl感受态细胞、10化质粒DNA(重组表达载体DBN-HT130066)，42°C水浴 30秒;37 °C振荡培养1小时（10化pm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素的LB固体平 板(膜蛋白腺1〇旨/1，酵母提取物5旨/1，化(：110旨/1，琼脂15旨/1，用船0的周抑至7.5)上于溫度 37 °C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/ L，化Cl lOg/L，卡那霉素50mg/L，用化OH调抑至7.5)中于溫度37°C条件下培养过夜。碱法提 取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SacI和KasI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序 鉴定，结果表明重组表达载体DBN-HT130066在Sac巧日KasI位点间的核巧酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列，即优化MTHFR66核巧酸序列。
[0141] 2、构建含有天然MTHFR66核巧酸序列的玉米重组表达载体DBN-HTl 30066N
[0142] 按照本实施例中1所述的构建含有优化MTHFR66核巧酸序列的重组表达载体DBN- HT120066的方法，利用本发明第四实施例中3所述的含有天然MTHFR66核巧酸序列的重组克 隆载体DBNOlR-T，构建含有天然MTHFR66核巧酸序列的重组表达载体DBN-HT130066N，其载 体结构如图11所示（载体骨架:pCAMBIA2301(CAMBIA机构可W提供）；Kan:卡那霉素基因； RB:右边界;prUbi:玉米Ubiquitin(泛素）1基因启动子（SEQ ID N0:12);AtCTP2:拟南芥叶 绿体转运肤(SEQ ID N0:7);MTHFR66:天然MTHFR66核巧酸序列（SEQ ID N0:3);tNos:姻脂 碱合成酶基因的终止子(SEQ ID N0:8);PMI:憐酸甘露糖异构酶基因（SEQ ID N0:13);LB: 左边界）。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体DBN-HTl30066N中插入的天然 MTHFR66核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列，即天然MTHFR66核巧酸序 列正确插入。
[0143] 3、玉米重组表达载体转化农杆菌
[0144] 对己经构建正确的重组表达载体DBN-HT130066和DBN-HT130066N用液氮法转化到 农杆菌 LBA4404 (Invi 付 gen，Chi cago，USA，CAT: 18313-015)中，其转化条件为：100 化农杆菌 LBA4404、3化质粒DNA(重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37°C溫水浴10分钟;将转化后的 农杆菌LBA4404接种于LB试管中于溫度28°C、转速为20化pm条件下培养2小时，涂于含50mg/ L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克 隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶酶切DBN-HT130066和DBN-HT130066N后进行酶切验 证，结果表明重组表达载体DBN-HTl 30066和DBN-HTl 30066N结构完全正确。
[0145] 第八实施例、转基因玉米植株的获得及验证
[0146] 按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综3UZ31)的幼胚与本发 明第屯实施例中3所述的农杆菌共培养，W将本发明第屯实施例中1和2构建的重组表达载 体DBN-HT130066和DBN-HT130066N中的T-DNA(包括玉米Ubiquitinl基因的启动子序列、优 化MTHFR66核巧酸序列、天然MTHFR66核巧酸序列、AtCTP2叶绿体转运肤序列、PMI基因和Nos 终止子序列)转入到玉米染色体组中，获得了定位于叶绿体的转入优化MTHFR66核巧酸序列 的玉米植株(Zm-mMTHFR66)和转入天然MTHFR66核巧酸序列的玉米植株(Zm-MTHFR66);同时 W野生型玉米植株作为对照。
[0147] 对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮 液接触幼胚，其中农杆菌能够将优化MTHFR66核巧酸序列和天然MTHFR66核巧酸序列传递至 幼胚之一的至少一个细胞(步骤1:侵染步骤）。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液 (ODssq = O . 4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、薦糖68.5g/L、葡萄 糖36g/L、乙酷下香酬(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) Img/L，P册.3))中W启动接 种。幼胚与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤2:共培养步骤）。优选地，幼胚在侵染步骤后 在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、薦糖20g/L、葡萄糖lOg/L、乙酷下香 酬(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)lmg/L、琼脂8g/L，p册.8)上培养。在此共培养阶 段后，可W有一个选择性的"恢复"步骤。在"恢复"步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他 命、干酪素300mg/L、薦糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) Img/L、植物凝胶3g/L，P册.8)中 至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头抱霉素），不添加植物转化体的选择剂(步 骤3:恢复步骤）。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，W消除农杆 菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(甘露糖）的培养基上培养并选 择生长着的转化愈伤组织(步骤4:选择步骤）。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基 (MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、薦糖30g/L、甘露糖12.5g/L、2，4-二氯苯氧乙酸 (2，4-D) Img/L、植物凝胶3g/L，P册.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织 再生成植物(步骤5:再生步骤），优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培 养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养W再生植物。
[0148] 筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪 素300mg/L、薦糖30g/L、6-苄基腺嚷岭2mg/L、甘露糖5g/L、植物凝胶3g/L，p册.8)上，25°C下 培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素 300mg/L、薦糖30g/L、日引噪-3-乙酸Img/L、植物凝胶3g/L，p册.8)上，25°C下培养至约IOcm 高，移至溫室培养至结实。在溫室中，每天于28°C下培养16小时，再于20°C下培养8小时。
[0149] 2、用化qMan验证转基因玉米植株
[0150] 分别取转入优化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株和转入天然MTHFR66核巧酸序列 的玉米植株的叶片约IOOmg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组 DNA，通过化qman探针巧光定量PCR方法检测PMI基因的拷贝数来确定转基因玉米植株的拷 贝数。同时W野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平 均值。
[0151 ]检测PMI基因拷贝数的具体方法如下：
[0152] 步骤11、分别取转入优化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株、转入天然MTHFR66核巧 酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各lOOmg，分别在研鉢中用液氮研成匀浆，每个 样品取3个重复；
[0153] 步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体 方法参考其产品说明书；
[0154] 步骤13、用NanoDrop 2000(The;rmo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度； [01W] 步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80- 100雌/化；
[0156] 步骤15、采用化qman探针巧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，W经过鉴定已知拷 贝数的样品作为标准品，W野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均 值;巧光定量PCR引物和探针序列分别是：
[0157] W下引物和探针用来检测PMI基因：
[015引 引物3:01^^^'6441'〔46〔6口'巧日序列表中沈9 10備：14所示；
[0159] 引物4:6〇1^'66〇：1'1764〔46巧日序列表中沈9 10^:15所示；
[0160] 探针1:16〇1；〇：44〔6441'〔4〇1；6如序列表中沈9 10備:16所示；
[0161] PCR反应体系为：
[0162]
[0163] 所述50X引物/探针混合物包含ImM浓度的每种引物各45化，IOOiiM浓度的探针50y L和86化L 1 X TE缓冲液，并且在4°C，胆藏在班巧试管中。
[0164] PCR反应条件为：
[01 化]
[0166]
[0167]利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。
[016引实验结果表明，优化MTHFR66核巧酸序列和天然MTHFR66核巧酸序列均己整合到所 检测的玉米植株的染色体组中，而且转入优化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株和转入天然 MTHFR66核巧酸序列的玉米植株均获得了含有单拷贝MTHFR66基因的转基因玉米植株。
[0169] 第九实施例、转基因玉米植株的除草剂抗性效果检测
[0170] 将转入优化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株、转入天然MTHFR66核巧酸序列的玉米 植株和野生型玉米植株(V5-V6时期)分别对麦草畏进行除草剂抗性效果检测。
[0171] 分别取转入优化MTHFR66核巧酸序列的玉米植株、转入天然MTHFR66核巧酸序列的 玉米植株和野生型玉米植株的Tl代杂合植株(V5-V6时期），并用麦草畏除草剂(4480g ae/ ha，8倍大田浓度)和空白溶剂(水)喷洒。喷施21天后统计支撑根发育情况。Zm-mMTHFR66共3 个株系（S1、S2和S3)，Zm-MTHFR66共2个株系（S4和S5)，野生型的（CK)共1个株系；从每个株 系选10-15株进行测试。结果如表2所示。
[0172] 表2、转基因玉米Tl植株除草剂抗性实验结果
[0173]
[0174] 表2的结果表明：优化MTHFR66基因赋予转基因玉米植物麦草畏除草剂的高水平耐 受性（由于单子叶植物本身对麦草畏除草剂具有一定抗性，因而表现出高水平抗性）；相比 于Zm-MTHFR66，Zm-mMTHFR66能够产生更高的麦草畏除草剂耐受性，表明所述MTHFR66基因 经植物密码子优化可W增强玉米植物对麦草畏除草剂的耐受性;而野生型玉米植株则不具 有麦草畏除草剂耐受性。
[0175] 综上所述，本发明MTHFR66蛋白可W降解麦草畏除草剂，优化MTHFR66基因采用玉 米和大豆的偏好密码子，使其特别适合在植物中表达;优化MTHFR66基因可W赋予转基因植 物更好的麦草畏除草剂耐受性；同时本发明除草剂耐受性蛋白质MTHFR66还具有甲基四氨 叶酸还原酶活性，其不同于已知的麦草畏耐受型基因，因此可W扩大麦草畏耐受型在植物 上应用范围。
[0176] 最后所应说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明 的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种基因，其特征在于，包括： (a) 编码SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列;或 (b) 在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列;或 (c) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。2. -种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求1所述基 因。3. 根据权利要求2所述表达盒，其特征在于，所述调控序列为叶绿体转运肽，所述叶绿 体转运肽与权利要求1所述基因有效连接。4. 根据权利要求3所述表达盒，其特征在于，所述叶绿体转运肽的核苷酸序列具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。5. -种包含权利要求1所述基因或权利要求2-4任一项所述表达盒的重组载体。6. -种增加耐受除草剂范围的方法，其特征在于，包括:将SEQ ID NO: 2所示的氨基酸 序列组成的蛋白质或权利要求2-4任一项所述表达盒编码的蛋白质在植物中与至少一种不 同于SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或权利要求2-4任一项所述表达盒编码 的蛋白质的第二种蛋白质一起表达。7. 根据权利要求6所述增加除草剂耐受性的方法，其特征在于，所述第二种蛋白质为草 甘膦耐受性蛋白质、草铵膦耐受性蛋白质、α酮戊二酸双加氧酶、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、 乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。8. -种选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，包括：用权利要求1所述基因或权利 要求2-4任一项所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所述基因或所述表达盒的转 化细胞生长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养所述细胞，所 述除草剂为麦草畏。9. 一种控制杂草的方法，其特征在于，包括:对种植植物的大田施用有效剂量的麦草畏 除草剂，所述植物包含权利要求1所述基因、权利要求2-4任一项所述表达盒或权利要求5所 述重组载体。10. -种保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括:将权利要求1所 述基因、权利要求2-4任一项所述表达盒或权利要求5所述重组载体导入植物，使导入后的 植物产生足够保护其免受麦草畏损害量的除草剂耐受性蛋白质。11. 一种赋予植物麦草畏除草剂耐受性的方法，其特征在于，包括:将权利要求1所述基 因、权利要求2-4任一项所述表达盒或权利要求5所述重组载体导入植物。12. -种控制草甘膦耐受性植物的大田中草甘膦耐受性杂草的方法，其特征在于，包 括:对种植草甘膦耐受性植物的大田施用有效剂量的麦草畏，所述草甘膦耐受性植物包含 权利要求1所述基因、权利要求2-4任一项所述表达盒或权利要求5所述重组载体。13. -种产生麦草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因组中引入 权利要求1所述基因或权利要求2-4任一项所述表达盒，以产生麦草畏耐受性植物。14. 根据权利要求13所述产生麦草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括:通过将亲 本植物自交或与第二种植物杂交而产生麦草畏耐受性植物，所述亲本植物和/或第二种植 物包含权利要求1所述基因或权利要求2-4任一项所述表达盒，所述麦草畏耐受性植物遗传 了来自所述亲本植物和/或第二种植物的所述基因或所述表达盒。15. -种培养对麦草畏除草剂具有耐受性的植物的方法，其特征在于，包括： 种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括权利要求1所述基因或权利要 求2-4任一项所述表达盒； 使所述植物种子长成植株； 用有效剂量麦草畏除草剂喷洒所述植株，收获与其他不具有所述基因或所述表达盒的 植株相比具有减弱的植物损伤的植株。16. 根据权利要求6-15任一项所述方法，其特征在于，所述植物为大豆、棉花、玉米、水 稻、小麦、甜菜或甘蔗。17. -种甲基四氢叶酸还原酶耐受麦草畏除草剂的用途，其特征在于，所述甲基四氢叶 酸还原酶具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。18. -种产生甲基四氢叶酸还原酶的植物耐受麦草畏除草剂的用途，其特征在于，所述 甲基四氢叶酸还原酶具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
【文档编号】C12N5/10GK105925590SQ201610440763
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月18日
【发明人】何健, 姚利, 贾兴军, 谢香庭, 吴业春, 陶青, 丁德荣
【申请人】北京大北农生物技术有限公司, 南京农业大学