一种用于检测植物microRNA靶基因的载体及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测植物microRNA靶基因的载体及检测方法，可用于所有植物microRNA与靶基因相互作用的研究。该载体构建，主要通过PCR、纯化、酶切、连接和转化等分子生物学手段，在Luc基因的3′端添加多克隆位点，便于将靶基因与microRNA相互作用的碱基添加到载体中。将含有microRNA过表达载体的根癌农杆菌工程菌和microRNA靶基因根癌农杆菌工程菌共侵染本氏烟，通过Luc/Ren的相对表达检测microRNA与靶基因是否存在相互作用。本发明可简单、快速的检测植物microRNA与靶基因的相互作用。
【专利说明】
-种用于检测植物m i croRNA卽基因的载体及检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种用于检测植物microRNA祀基因的载体及 应用方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，microRNA(miRNA)已成为科学研究的热点。miRNA广泛存在于动植物体内， 是由内源基因编码的长度约21~25nt的一类非编码单链RNA，与祀基因mRNA结合，在转录后 水平上介导祀基因mRNA的降解或抑制祀基因的翻译。
[0003] 目前，基于高通量测序的应用，在拟南芥、水稻、番茄和玉米等植物种均发现了大 量的miRNA,而且在生长发育、信号转导和逆境响应中发挥重要作用。生长素是一种重要的 植物激素，调苄基因的表达影响植物的生长和发育，其中生长素响应因子(Auxin response factors，ARFs)位于生长素的下游调控相关基因的表达。拟南芥ARF6和ARF8促进花茎的伸 长及花瓣、雄蕊和雌蕊后期的发育。番茄中过表达拟南芥miR167a，降低了 ARF6和ARF8的表 达，节间短缩，导致雄性不育。水稻miR397负调控LAC，控制谷粒的大小和花序的分支。此外， miR169是与植物抗旱相关的miRNA。干旱和ABA处理抑制拟南芥miR169的表达，其祀基因 NFYA5被干旱和ABA诱导，过表达miR169a抑制了 NFYA5的表达，增加了叶片失水率和干旱的 敏感性。miR399参与憐元素的代谢，被低憐胁迫所诱导，保持体内憐的平衡和稳定。
[0004] miRNA在生物进程中发挥重要的作用，尽管高通量测序等技术便于发掘新的和特 异性表达的miRNA,但是如何寻找和验证miRNA的祀基因尚不完善。有些学者利用GFP等巧光 蛋白的强度检测miRNA的祀基因，但是农杆菌的活力、烟草的生长状态均会影响巧光的强 弱。利用miRNA的过表达植株检测祀基因的相对表达，结果可靠但周期长。因此探索一项简 单、快速、可靠的检测miRNA的祀基因的方法具有重要的理论和现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种用于检测植物microRNA祀基因的载体及应用，简单、快速、可靠的 检测HiRNA的祀基因。
[0006] -种用于检测植物microRNA祀基因的载体，包括原始载体和依次插入原始载体的 35S启动子、Ren基因和LUC基因，所述Luc基因的y端添加多克隆位点。
[0007] 优选地，所述原始载体为pFG巧941载体。
[000引本发明还提供一种用于检测植物microRNA祀基因的载体的构建方法，包括如下步 骤：
[0009] (1)将35S启动子连入pGreenII Luc载体得重组载体pACOOl，将Ren基因连入 PFGC5941载体中得重组载体PAC002;
[0010] (2)根据Luc序列设计特异性引物，并在引物上分别加上限制性酶切位点AscI和 SmaI,然后W所述重组载体pACOOl为模板对Luc基因进行扩增，扩增产物连入重组载体 PAC002中即得。
[0011] 本发明还提供一种检测植物microRNA祀基因的方法，包括如下步骤：
[0012] (1)构建含有植物microRNA过表达载体的根癌农杆菌工程菌A;构建含待检测基因 和报告基因的融合表达载体的根癌农杆菌工程菌B;
[0013] (2)将所述根癌农杆菌工程菌A和根癌农杆菌工程菌B共侵染本氏烟，通过报告基 因的表达量判断待检测基因是否为所述植物microRNA的目标基因。
[0014] 优选地，所述根癌农杆菌工程菌B的构建方法如下：
[0015] (1)将35S启动子连入pGreenII Luc载体得重组载体pACOOl，将Ren基因连入 PFGC5941载体中得重组载体PAC002;
[0016] (2)根据Luc序列设计特异性引物，并在引物上分别加上限制性酶切位点AscI和 SmaI,然后W所述重组载体pACOOl为模板对Luc基因进行扩增，扩增产物连入重组载体 PAC002中得重组载体PAC006;
[0017] (3)将带检测基因连入重组载体PAC006的Luc基因的y端多克隆位点，得重组载体 重组载体PAC004;
[0018] (4)将所得重组载体PAC004转入根癌农杆菌GV3101得所述根癌农杆菌工程菌B。
[0019] 35S启动子的扩增引物序列：
[0020] pGreenII35S-F：CCGCTCGAGGTACCCCTACTCCAAAAATG
[0021] pGreenII35S-R：ACGCGTCGACGTCCTCTCCAAATGAAATG；
[0022] Ren基因的扩增引物序列：
[0023] pGreenII Ren-F：attcgagctcGTACCCCTACTCCAAAAATGTCAAA
[0024] pGreenII Ren-R：gattgggcgcgccGATCTGGATTTTAGTACTGGATTTTGG；
[0025] Luc基因的扩增引物序列：
[00%] pGreenII Luc-F:gatcggcgcgccGTACCCCTACTCCAAAAATGTCAAA
[0027] pGreenII Luc-R:tagtcccgg巧TAATTAATCTAGAGGATCCTTACACGGCGATCTTTCCGC。
[00%]优选地，所述根癌农杆菌工程菌A的构建方法如下：
[0029] 将植物microRNA前体序列连入PFGC1008载体中，得过表达载体，将过表达载体转 入根癌农杆菌GV3101即得。
[0030] 植物microRNA为本领域常见的所有植物microRNA，优选地，所述植物microRNA为 miR6027〇
[0031] 当所述植物microRNA为miR6027时，优选地，所述待检测基因为ATGl&i基因。
[0032] 本发明通过报告基因的表达量判断待检测基因是否为所述植物microRNA的目标 基因，检测原理如下：
[0033] 当microRNA与目标基因结合时，会促进Luc的降解或抑制其翻译，与对照相比， Luc/Ren的相对表达降低；如果microRNA与目标基因不能结合，对Luc没有影响，Luc/Ren的 相对表达与对照保持一致。本发明将待检测基因与Luc/Ren进行融合表达，根据连接待检测 基因后Luc/Ren的相对表达是否降低判断该待检测基因是否为microRNA的目标基因，连接 待检测基因后与对照相比，Luc/Ren的相对表达降低，证明该待检测基因microRNA的目标基 因；连接待检测基因后Luc/Ren的相对表达与对照保持一致，证明该待检测基因不是 microRNA的目标基因。
[0034] 本发明采用含有双巧光素酶报告基因（巧光素酶Luc和海肾巧光素酶Ren)的质粒 pGreenII Luc，经过PCR、纯化、酶切、连接、转化，将35S启动子和Ren和Luc序列连在 pFG巧941载体上，在Luc序列y端添加酶切位点，将质粒命名为PAC006。
[0035] 本发明主要设及miRNA祀基因的研究。设计围绕miRNA与祀基因相互作用，将互作 的区域连在PAC006载体酶切位点处，增力曲iRNA祀基因研究的灵活性和简便性。
[0036] 与现有方法相比，本发明的有益效果如下：请补充本发明无需转基因，可快速、方 便的检测miRNA的祀基因，克服了转基因操作繁琐、耗时长的缺陷，解决了不适合转基因物 种祀基因验证的难题，而且可W集约化、批量化操作。
【附图说明】
[0037] 图1为PAC006质粒图谱示意图。
[003引图2为35S的PCR扩增结果图。M，DNA maker;1，35S的PCR产物；2,无模板的阴性对 照。
[0039] 图3为为Ren的PCR扩增结果图。M，DNA maker; 1，Ren的PCR产物；2，无模板的阴性对 照。
[0040] 图4为Luc的PCR扩增结果图。M，DNA maker; 1，Luc的PCR产物；2，无模板的阴性对 照。
[0041 ] 图5为miR6027的PCR扩增结果图。M，DNA maker;l，miR6027的PCR产物;2,无模板的 阴性对照。
[0042] 图6A和图她为miR6027与ATG1&1的碱基配对图。
[0043] 图6C为侵染后72h miR6027的相对表达量。
[0044] 图抓为侵染后72h Luc/Ren的相对表达。
【具体实施方式】
[0045] 下述实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法，包括PCR、纯化、酶切、 连接、转化、测序等几个步骤。
[0046] 下述实施例中所用实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[004引实施例1
[0049] 35S启动子连入pGreenII Luc载体
[0050] 1. PCR 扩增
[0化1] 根据35S序列设计特异性引物(表1中的pGreenII35S-F和pGreenII35S-R)，并在引 物上分别加上限制性酶切位点(XhoI和Sail),然后对35S启动子进行扩增，纯化、酶切，连接 到pGreenII Luc载体中，PCR电泳图如图2。
[0化2] PCR反应体系如下：
[0化3]
[0化4]
[0化5]
[0056] 2.纯化
[0057] PCR反应结束后根据普通PCR产物纯化试剂盒(TIANGEN)操作说明书进行，具体步 骤如下：
[005引（1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500化的平衡液化， 12，OOOrpm(~13，400 X g)离屯、Imin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管 中；
[0059] (2)估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混 匀；
[0060] (3)将第(2)步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置 2min，12,000巧m(~13,400Xg)离屯、30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收 集管中；
[0061 ] (4)向吸附柱CB2中加入60化L漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400Xg)离屯、30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管 中；
[0062] (5)重复操作步骤(4);
[0063] (6)将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(~13,400Xg)离屯、2min，尽量除去漂 洗液。将吸附柱CB2置于室溫放置数分钟，彻底地惊干，W防止残留的漂洗液影响下一步的 实验；
[0064] (7)将吸附柱CB2放入一个干净的离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-5化L 洗脱缓冲液邸，室溫放置2min，12，000巧m(~13，400 X g)离屯、2min收集DNA溶液。
[0065] 3.酶切PCR产物和质粒
[0066] PCR产物酶切反应体系如下：
[0067]
[006引
[0069]
[0070] 37°C解育化，酶切结束后根据普通PCR产物纯化试剂盒进行纯化，具体步骤同上。
[0071] 4.连接
[0072] 采用全式金生物公司的T4连接酶连接，具体步骤如下：
[0073] 123456789101112 ....... 2
[00巧]16°C连接过夜 3 5.转化大肠杆菌 4 连接产物转化大肠杆菌，具体步骤，如下： 5
[007引（1)从-80°C冰箱中取出感受态细胞悬液，放置于冰上使其解冻，每SOiiL分装一管； 6 (2)每管加入连接产物化L，轻轻摇匀，冰上放置30min; 7 (3) 42 r水浴中热击45s，然后置于冰上冷却2-5min; 8 (4)向离屯、管中加入8(K)化不含抗生素的LB液体培养基，混匀后37°C振荡培养化， 使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因； 9 (5)300化pm离屯、2min，倒置离屯、管去掉部分上清，留下100-20化L，用移液枪吸打 混匀，涂布于含有Kan抗性的LB平板上，37°C倒置培养过夜。 10 6.测序 11 挑取单克隆于ImL含有Kan抗性的LB液体培养基中，37°C振荡培养化，送上海桑尼 生物公司测序，测序结果正确的质粒命名为pACOOl。 12 表1 35S扩增引物序列表
[00861
[0087] 实施例2
[0088] Ren 基因连接 PFGC5941
[0089] 1. PCR 扩增
[0090] 根据Ren序列设计特异性引物(表2中的pGreenII Ren-F和pGreenII Ren-R),并在 引物上分别加上限制性酶切位点（SacI和AscI),然后对Ren基因进行扩增，纯化、酶切，连接 到pFG巧941载体中，PCR电泳图如图3。
[0091] PCR反应体系化下：
[0092]
[0093]
[0094]
[0095]
[0096] 2.纯化
[0097] PCR反应结束后根据普通PCR产物纯化试剂盒(TIANGEN)操作说明书进行，具体步 骤同实施例1。
[009引 3.酶切PCR产物和质粒
[0099] PCR产物酶切反应体系如下：
[0100]
[0101] J
[0102]
[0103] 37°C解育化，酶切结束后PCR产物根据普通PCR产物纯化试剂盒(TIANGEN)进行纯 化，具体步骤同实施例1。质粒根据DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)进行纯化，具体步 骤如下：
[0104] (1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500化的平衡液化， 12,000rpm(~13,400Xg)离屯、lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2重新放回收集管 中；
[0105] (2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分)放入干净的 离屯、管中，称取重量；
[0106] (3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1 g,其体积可视为10化1，则加 入10化1 PN溶液），50°C水浴放置，其间不断溫和地上下翻转离屯、管，W确保胶块充分溶解。 如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解；
[0107] (4)将第(3)步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置 2min，12,000巧m(~13,400Xg)离屯、30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收 集管中；
[0108] (5)向吸附柱CA2中加入60化L漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400Xg)离屯、30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管 中。
[0109] (6)重复操作步骤(5);
[0110] (7)将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400Xg)离屯、2min，尽量除尽漂 洗液。将吸附柱CA2置于室溫放置数分钟，彻底地惊干，W防止残留的漂洗液影响下一步的 实验；
[0111] (8)将吸附柱CA2放入一个干净的离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-5化L 洗脱缓冲液邸，室溫放置2min，12，000巧m(~13，400 X g)离屯、2min收集DNA溶液。
[0112] 4.连接
[0113] 采用全式金生物公司的T4连接酶连接，具体步骤同实施例1。
[0114] 5.转化大肠杆菌
[0115] 连接产物转化大肠杆菌，具体步骤同实施例1。
[0116] 6.测序
[0117] 挑取单克隆于ImL含有Kan抗性的LB液体培养基中，37°C振荡培养化，送上海桑尼 生物公司测序，测序结果正确的质粒命名为PAC002。
[011引表2 Ren基因扩增引物序列表 [0119]
[i
[0121] 实施例3
[0122] PAC006载体构建
[0123] 1. PCR 扩增
[0124] 根据Luc序列设计特异性引物(表3中的pGreenII Luc-F和pGreenII Luc-R),并在 引物上分别加上限制性酶切位点(AscI和SmaI),然后对Luc基因进行扩增，纯化、酶切，连接 到PAC002载体中，PCR电泳图如图4。
[01巧]PCR反应体系如下：
[0126]
[0127]
[012 引
[0129] 2.纯化
[0130] PCR反应结束后根据普通PCR产物纯化试剂盒(TIANGEN)操作说明书进行，具体步 骤同实施例1。
[0131] 3.酶切PCR产物和质粒
[0133]
[0132] PCR产物酶切反应体系如下：
[0134]
[0135]
[0136]
[0137] 37 °C解育化，酶切结束后PCR产物根据普通PCR产物纯化试剂盒进行纯化，具体步 骤同实施例1。质粒根据DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，具体步骤如实施例2。
[013引 4.连接
[0139] 采用全式金生物公司的T4连接酶连接，具体步骤同实施例1。
[0140] 5.转化大肠杆菌
[0141] 连接产物转化大肠杆菌，具体步骤同实施例1。
[01创 6.测序
[0143] 挑取单克隆于ImL含有Kan抗性的LB液体培养基中，37°C振荡培养化，送上海桑尼 生物公司测序，测序结果正确的质粒命名为PAC006。
[0144] 表3 Luc基因扩增引物序列表
[0145]
[0146] 实施例4
[0147] 番茄miR6027过表达载体构建
[014引根据11111?8日3日数据库化1:19://\￥丽.111；[1'6日3日.0'旨/)查找番茄11111?6027的前体序列及 在染色体上的位置，设计可W扩增miR6027前体序列的引物（表4中的1008-miR6027S和 1008-miR6027R)，并在引物上分别加上限制性酶切位点(AscI和BamHI),然后对miR6027的 前体进行扩增，纯化、酶切，连接到pFGCl 008载体中，PCR电泳图如图5。
[0149] PCR反应体系如下：
[0150]
[0151] ]
[0152]
[0153] 2.纯化
[0154] PCR反应结束后根据普通PCR产物纯化试剂盒(TIANGEN)操作说明书进行，具体步 骤同实施例1。
[01巧]3.酶切PCR产物和质粒
[0156] PCR产物酶切反应体系如下：
[0157]
[015 引
[0159]
[0160] 37°C解育化，酶切结束后PCR产物根据普通PCR产物纯化试剂盒（TIANGEN)进行纯 化，具体步骤同实施例1。质粒根据DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)进行纯化，具体步 骤如实施例2。
[0161] 4.连接
[0162] 采用全式金生物公司的T4连接酶连接，具体步骤同实施例1。
[0163] 5.转化大肠杆菌
[0164] 连接产物转化大肠杆菌，具体步骤同实施例1。
[01例 6.测序
[0166] 挑取单克隆于ImL含有CM抗性的LB液体培养基中，37°C振荡培养化，送上海桑尼生 物公司测序，测序结果正确的质粒命名为PAC003,电击转化农杆菌GV3101，获得含有番茄 miR6027过表达的根癌农杆菌工程菌A。
[0167] 表4番茄miR6027扩增引物序列表 [01ARl
[0169] 实施例5
[0170] 番茄miR6027祀基因检测
[0171] 本实施例中WmiR6027为例用于说明PAC006载体的使用方法，其它miRNA的使用方 法与本实例相同。
[0172] 本实施例中用的培养基和抗生素配制方法如下：
[017：3] Y邸培养基的配制：5g牛肉膏，Ig酵母提取物，5g蛋白腺，0.5g MgS〇4 ? 7此0,5g薦 糖，用蒸馈水定容至IL，调节抑值为7.0，121°C高压灭菌20min备用。Y邸固体培养基每升加 琼脂粉15g，其它分成份同液体培养基。
[0174] 利福平:50mg/m巧醇溶解，过滤除菌，-20°C分装保存。
[0175] 卡那霉素 :50mg/mL，过滤除菌，-20°C分装保存。
[0176] 氯霉素:34mg/mL，乙醇溶解，过滤除菌，-20°C分装保存。
[0177] 庆大霉素:25mg/mL购于上海生物工程有限公司，-20°C保存。
[017引侵染液配制：10mM氯化儀、IOmM MES，抑=5.7，用时力日150測/1乙酷下香酬。
[0179] 番茄miR6027的成熟序列与番茄ATGlSa的mRNA序列有18个碱基配对（图6A)，因此 我们推测ATGlSa可能是miR6027的祀基因。将ATGlSa中与miR6027配对的碱基连入PAC006质 粒酶切位点处获得质粒PAC004，电击转化农杆菌GV3101，获得含有番茄miR6027祀序列的根 癌农杆菌工程菌B，同时将ATGlSa中与miR6027配对的碱基突变（图她)连入PAC006质粒酶切 位点处获得质粒PAC005,电击转化农杆菌GV3101，获得含有根癌农杆菌工程菌C，将构建 miR6027过表达的空载体PFGC1008电击转化农杆菌GV3101，获得含有根癌农杆菌工程菌D。
[0180] 侵染方法如下：
[0181] (1)将含有目的基因的农杆菌GV310U根癌农杆菌工程菌A、B、C、和D)划平板，36- 4化出现单菌落；
[0182] (2)挑取单菌落于含有5mL Y邸培养基的IOmL管中摇菌，在28°C条件下20化pm摇菌 24h；
[0183 ] (3)按1:100的比例将步骤(2)的工程菌A和的夜加入含有氯霉素、利福平、庆大霉素 巧中抗生素的50mL Y邸培养基中，工程菌B和C液加入卡那霉素、利福平、庆大霉素巧巾抗生素 的50mL Y邸培养基中，扩大培至OD册日=0.8-1.0 (约12h);
[0184] (4)4°C，4000g，离屯、lOmin，弃上清；
[01化](5)预冷灭菌水20mL洗涂，4000g，4°C ,IOmin离屯、，弃上清；
[0186] (6)重复步骤(5)-次；
[0187] (7)预冷侵染液溶解沉淀至ODsoo = O. 6-0.8;
[0188] (8)室溫放置化，工程菌A:工程菌B = 50 :1、工程菌D:工程菌B = 50:1、工程菌A:工 程菌C = 50:l、工程菌D:工程菌C = 50:l分别混合侵染五至六叶时期的本氏烟；
[0189] (9)侵染后48-7化取样检测Ren和Luc基因的表达量。
[0190] 图6C为侵染后72h miR6027的相对表达量，图抓为侵染后72h Luc/Ren的相对表 达。
[0191] 结果表明，农杆菌侵染后miR6027的表达提高了 600倍，miR6027与ATGlSa共侵染 Luc/Ren降低了52%，而miR6027与ATGlSa突变共侵染Luc/Ren没有显著性降低，表明 ATGlSa是miR6027的祀基因。
[0192] W上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于 此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专 利范围之中。
【主权项】
1. 一种用于检测植物microRNA靶基因的载体，其特征在于，包括原始载体和依次插入 原始载体的35S启动子、Ren基因和LUC基因，所述Luc基因的3'端添加多克隆位点。2. 根据权利要求1所述载体，其特征在于，所述原始载体为PFGC5941载体。3. -种用于检测植物mi croRNA祀基因的载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将35S启动子连入pGreenll Luc载体得重组载体pACOOl，将Ren基因连入pFGC5941 载体中得重组载体PAC002; (2) 根据Luc序列设计特异性引物，以所述重组载体pACOOl为模板对Luc基因进行扩增， 扩增产物连入重组载体PAC002中即得。4. 一种检测植物mi croRNA祀基因的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 构建含有植物microRNA过表达载体的根癌农杆菌工程菌A;构建待检测基因和报告 基因的融合表达载体并转入根癌农杆菌得根癌农杆菌工程菌B; (2) 将所述根癌农杆菌工程菌A和根癌农杆菌工程菌B共侵染本氏烟，通过报告基因的 表达量判断待检测基因是否为所述植物microRNA的目标基因。5. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述融合表达载体的构建方法如下： (1) 将35S启动子连入pGreenll Luc载体得重组载体pACOOl，将Ren基因连入pFGC5941 载体中得重组载体PAC002; (2) 根据Luc序列设计特异性引物，以所述重组载体pACOOl为模板对Luc基因进行扩增， 扩增产物连入重组载体PAC002中得重组载体pAC006; (3) 将带检测基因连入重组载体pAC006的Luc基因的3'端多克隆位点，得重组载体重组 载体PAC004即为所述融合表达载体。6. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述根癌农杆菌工程菌A的构建方法如下： 将植物microRNA前体序列连入pFGC1008载体中，得过表达载体，将过表达载体转入根 癌农杆菌即得。7. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述植物microRNA为miR6027。8. 根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述待检测基因为ATGl 8a基因。
【文档编号】C12N15/65GK105925604SQ201610264351
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】周杰, 王玉, 喻景权
【申请人】浙江大学