靶向hsp70基因rna干扰重组慢病毒载体及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及靶向HSP70基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建、筛选及其用途。本发明利用RNA干扰技术，针对HSP70基因的不同靶序列，构建了四个能在293细胞中表达siRNA的慢病毒真核表达载体，干扰慢病毒是由pLv?HSP70shRNA、pMD2.G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养获得。本发明靶向HSP70基因RNA干扰重组慢病毒载体能高效特异性的抑制HSP70基因表达，可用于制备治疗帕金森病或肿瘤相关性基因药物。
【专利说明】
革田向HSP70基因 RNA干扰重组慢病毒载体及其构建方法
技术领域
[0001 ] 本发明设及祀向热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)基因的RNA干扰 重组慢病毒载体及其构建，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 热休克蛋白化eat shock protein，HSP)又称应激蛋白，是一类广泛存在于各种 生物体内的进化上高度保守的细胞应激蛋白。HSP70是HSP家族中最保守、最主要、含量最 丰富的一种，也是迄今为止研究较多的一种。细胞在受热或其他不良因素刺激下发生应激 反应可诱导产生HSP，参与细胞内各种新生肤链的结合、装配及跨膜转运。主要作为一种分 子伴侣的作用出现，常常在不同的环境和病理刺激下产生。其保护细胞的功能主要是通过 促进新生肤的折叠W及去除变性的蛋白。在各种肿瘤细胞中，HSP70通过抑制调亡和促进肿 瘤细胞的增值，导致肿瘤细胞的存活和增殖活性增加。研究提示，HSP70表达的增高与运些 肿瘤细胞的增殖，侵犯，转移W及预后明显相关。
[0003] 帕金森病典型的病理特征是中脑黑质多己胺能神经元内包涵体（inclusion body)-路易体（Lewy body,LB)形成，包涵体内聚集了许多异常折叠的蛋白质，包括a- synuclein、泛素、氧化硝化蛋白等。目前发现几乎所有的神经变性疾病都W蛋白质聚集物 为病理特征，运类具有毒性的蛋白质聚集反应，最终导致神经细胞缺失和神经元功能丧失。 有学者把帕金森W及许多神经变性疾病看作为"蛋白质构象病"，是指由于正常生理功能的 蛋白质发生构象改变而异常聚集所致，如果能够抑制或逆转此病理过程，挽救错误折叠的 蛋白质，或许能够防治和缓解运类变性疾病。热休克蛋白由于其具有促使异常蛋白质重新 折叠成天然结构而被泛素蛋白酶体系统降解的作用，对其功能的研究日益受到重视。
[0004] RNA干扰技术能特异性降解mRNA，沉默祀基因，在转录后水平抑制基因的表达，从 而可用来进行基因功能的研究和药物祀标的研究。RNA干扰机制研究表明，双链RNA分子首 先被细胞内3魁酶0；[。61'降解成21-23个碱基大小的小分子干扰1?麻（31]1日11；[]116扣61'；[]1邑 RNA, SiRNA) DSiRNA被认为是RNA干扰的主要效应物。慢病毒载体作为常用的病毒载体之 一，其特点是免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能自身携带片段整合入宿主细胞 基因组，并在哺乳动物各类细胞稳定表达SiRNA,长期抑制基因表达。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种祀向服P70基因的RNA干扰重组病毒载体构建、筛选及其用途。
[0006] 本发明WRNA干扰技术为主，针对HSP70基因的不同祀序列，构建了四个能在293T 细胞中表达SiRNA的慢病毒真核表达载体pLv-HSP70shRNA，该载体是自身失活的慢病毒载 体，其示意图谱见图1，能特异性的抑制服P70基因表达。
[0007] 本发明的技术方案如下： 一种祀向HSP70基因的SiRNA重组慢病毒表达载体，是用于帕金森病或肿瘤HSP70基因 相关性治疗性物质，慢病毒是由9^-册?7〇3111?酷、9102.6和95?4乂2载体共转染2931'细胞培 养获得;其中，所述的pLv-HSP70shRNA重组载体是在plv-shRNA载体的多克隆位点中连接双 链DNA片段构建而得，酶切位点是BamH巧日EcoRI，所述的双链DNA片段为W下序列中的一种： (1化SP70-hom〇-Sl寡核巧酸序列1: 正义链： 5'GATCC ccACCATTGAGGAGGTAGATT CTCGAG AATCTACCTCCTCAATGGTGG TTTTT的' 反义链： 5 ' aattcaaaaaccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGGG3 ' (2)服P7O-Iiomo-S2寡核巧酸序列2: 正义链：GATCCgcCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGC TTTTTg 反义链：AATTCAAAAAGCCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGCG (3化SP70-hom〇-S3寡核巧酸序列3: 正义链：GATCCc巧GGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACG TTTTTg 反义链：AATTCAAAAACGTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACGG (4化SP70-hom〇-S4寡核巧酸序列4: 正义链：GATCCgcTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGC TTTTTg 反义链：AATTCAAAAAGCTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCG。
[000引根据本发明，所述的祀向HSP70基因的SiRNA重组慢病毒表达载体的构建方法，包 括步骤如下： a. 根据HSP70 mRNA序列，设计合成双链DNA片段，所述的双链DNA片段为所述的HSP70- homo-Sl、服P70-hom0-S2、服P70-hom0-S3 及服P70-hom0-S4 核酸序列中的一种； b. 然后将所述的双链DNA片段连接到plv-shRNA载体的多克隆位点中构建成 pLv-服P70shRNA重组载体； C.再将所述的pLv-服P70shRNA重组载体与pMD2. G和PSPAX2载体共转染293T细胞培养， 得祀向服P70基因RNA干扰的重组慢病毒载体系统。
[0009] 为了对祀向HSP70基因RNA干扰的重组慢病毒载体对HSP70基因的抑制效果进行鉴 定，将化v-HSP70shRNA与包装质粒共转染293T细胞后进行巧光定量PCR检测目的基因表达 水平，筛选出有效干扰质粒。
【附图说明】
[0010] 图1为实施例中慢病毒表达载体plv-shRNA结果示意图。
[0011] 图2 HSP70干扰RNA慢病毒载体瞬转293T细胞48h图片（巧光、可见光）。其中（a)为 普通光镜(IOOX) ;(b)为巧光光镜(IOOX)。
[0012] 图3不同干扰序列下的服P70表达水平。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0014] 主要材料； 293T细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所;大肠杆菌感受态D册a购自北京全式 金生物技术有限公司；慢病毒载体plv-shRNA购自Clontech公司，含有人U6启动子，编码绿 色巧光蛋白报告基因；各种限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶及化q DNA聚合酶均为美国肥B 公司产品；SYBR Green I q RT-PCR Mixs购与上海生工生物工程技术服务公司；胎牛血清 及DMEM培养液购自美国Gib i CO公司。
[0015] 实施例1祀向服P70基因的慢病毒载体构建 1.寡聚核酸的设计与合成 设计祀向服P70基因(NM_005345.5)的4个干扰序列(表1)，并合成相应的单链DNA 車HSPVO其阳RN么不：1#度方Il
ShRNA寡核巧酸的3 '末端是TTTTT，作为RNA聚合酶虹型启动子U6的终止信号，其5 '和3 ' 末端分别是BamHI和EcoRI的限制性酶切位点，plv-shRNA模板中的loop结构选用了 CTCGAG。 各自单链DNA合成片段如下： (1化SP70-hom〇-Sl寡核巧酸序列1: 正义链： 5 ' GATCCccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGGTTTTT的' 反义链： 5 ' aattcaaaaaccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGGG3 ' (2)服P7O-Iiomo-S2寡核巧酸序列2: 正义链：GATCCgcCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGCTTTTT邑 反义链：AATTCAAAAAGCCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGCG (3化SP70-hom〇-S3寡核巧酸序列3: 正义链：GATCCc巧GGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACG TTTTTg 反义链：AATTCAAAAACGTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACGG (4化SP70-hom〇-S4寡核巧酸序列4: 正义链：GATCCgcTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCTTTTT 邑 反义链：AATTCAAAAAGCTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCG。
[0016] 2.寡聚核酸退火 将合成的寡聚核酸分别用无酶水溶解，浓度为20yM。取相应正义链和反义链溶液，按照 如下配比配制退火反应体系：
在PCR仪上按照如下程序进行退火处理:95°C 5min; 85°C 5min; 75°C 5min; 70 °C5 min; 4°C 保存。
[0017] 3.pl-shRNA 载体樂性化 取化g plv-shRNA载体，按照如下体系进行酶切处理：
37°C酶切1小时，1.5%琼脂糖电泳，使用DNA纯化试剂盒回收，核酸蛋白浓度测定仪测定 回收质量。
[001引 4.plv-服P70-shRNA载体的构建 利用T4DNA连接酶，按照如下体系进行载体连接反应：
20°C连接过夜，转化质大抽杆菌感受态D册a,挑选阳性克隆送去测序。本步骤得到的产 物是 plv-服 P70-shRNA。
[0019] 实施例2 RNA干扰慢病毒瞬转293T细胞 将4种干扰慢病毒质粒，采用瞬时转染的方法转染293T细胞。293T细胞采用含10%FBS的 高糖DMEM培养基，置于37°C，5%C02培养箱内培养。转染前1天消化293T细胞，计数，将细胞接 种至35mm培养皿内，每个培养皿接种6 X IO5个细胞;次日用不含FBS的DMEM培养基分别配制 巧转试剂和RNA干扰质粒，每8化1培养基内加入16山巧转试剂，每I(K)山培养基内加入化g质 粒，分别混匀后将巧转溶液和质粒溶液轻轻混匀，室溫静置10分钟，逐滴加入培养皿内，在 37°C，5%C02培养箱内培养24h，更换新鲜的含10% FBS的高糖DMEM培养基继续培养4她，收集 细胞，提取细胞RNA。
[0020] 实施例3总RNA的提取、CDNA的合成及RNA干扰效应的RT-PCR检测 分别取化g RNA反转录cDNA，采用巧光定量PCR法检测服P70的表达水平，Wbe化-actin 作为内参，巧光定量PCR所采用的引物探针序列见表2,采用2AAET相对定量方法计算不同 RNA干扰序列样品的HSP70表达水平。筛选出表达水平最低的RNA干扰序列。检测结果（见图 3)表明S3序列的HSP70表达水平最低，说明S3序列的RNA干扰效果最好，选该序列作为建立 稳定细胞系的干扰序列。 「00211 亲9_]1?1~170未化(='1~。-?1。.1~1口弓1物探针1皆奸
【主权项】
1. 一种靶向HSP70基因的SiRNA重组慢病毒表达载体，是用于帕金森病或肿瘤HSP70基 因相关治疗性物质，干扰慢病毒是由口1^-批?70此1?祖、？102.6和?5?4乂2载体共转染2931'细 胞培养获得;其中， 所述的pLv-HSP70shRNA重组载体是在pLv-shRNA载体的多克隆位点中连接双链DNA片 段构建而得，酶切位点是BamHI和EcoRI;所述的双链DNA片段为以下序列中的一种： (I )HSP7〇-homo_Sl寡核昔酸序列1: 正义链： 5. GATCCccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGG TTTTTg3 ' 反义链： 5. aattcaaaaaccACCATTGAGGAGGTAGATT CTCGAG AATCTACCTCCTCAATGGTGGG3 ' (2) HSP70-hom〇-S2寡核苷酸序列2: 正义链：GATCCgcCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGC ITITTg 反义链：AATTCAAAAAGCCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGCG (3) HSP70-hom〇-S3寡核苷酸序列3: 正义链：GATCCcgTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGITTCTCTTGAACTCCTCCACG ITITTg 反义链：AATTCAAAAACGTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACGG (4) HSP70-hom〇-S4寡核苷酸序列4: 正义链：GATCCgcTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGC ITITTg 反义链：AATTCAAAAAGCTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCG。2. 根据权利要求1所述的靶向HSP70基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建方法， 包括步骤如下： a. 根据HSP70 mRNA序列，设计合成双链DNA片段，所述的双链DNA片段为所述的批?70_ homo-Sl、批卩70-11〇111〇-52、批？70-11〇111〇-53及邯？70-11〇111〇-54核算序列中的一种 ； b. 然后将所述的双链DNA片段连接到plv-shRNA载体的多克隆位点中构建成 pLv-HSP70shRNA 重组载体； c. 再将所述的pLv-HSP70shRNA重组载体与pMD2. G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养， 得靶向HSP70基因 RNA干扰的重组慢病毒载体系统。3. 权利要求1所述的靶向HSP70基因的siRNA重组慢病毒表达载体在制备治疗帕金森病 或肿瘤相关性基因药物中的应用。
【文档编号】C12N15/867GK105925611SQ201610254028
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月23日
【发明人】郭佳, 蒋明, 尹衍新, 于丽华, 蒋韵, 王玏
【申请人】同济大学苏州研究院