一种通过微生物转化合成丁二胺的方法
【专利摘要】本发明涉及一种通过微生物转化合成丁二胺的方法，所述方法利用微生物重组菌株表达鸟氨酸脱羧酶基因，将底物鸟氨酸转化成丁二胺，得丁二胺。本发明方法通过构建大肠杆菌重组菌株分泌表达鸟氨酸脱羧酶至大肠杆菌周质腔中，然后向发酵液中投入一定浓度的底物鸟氨酸，周质腔中的鸟氨酸脱羧酶将鸟氨酸转化为丁二胺，解决了丁二胺向细胞外转运的难题，降低了生产成本，经济环保，操作简单方便，提高了丁二胺的产量。
【专利说明】
-种通过微生物转化合成T二胺的方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程菌技术领域，尤其是一种通过微生物转化合成下二胺的方 法，该方法通过过表达鸟氨酸脱簇酶对发酵液中鸟氨酸进行生物转化，从而有效提高下二 胺的产量。
【背景技术】
[0002] 1,4-下二胺（butanediamine，简称下二胺），又名腐胺（PUtrescine)，是一类含氮、 带正电荷的小分子脂肪族化合物，是生物胺类(包括腐胺、精胺、亚精胺和尸胺等）中最简单 的一种。在细胞内，下二胺是鸟氨酸在鸟氨酸脱簇酶的作用下脱簇产生的，与赖氨酸的脱簇 产物尸胺一样都是尸体腐败产生的气味中的成分，作为一种毒碱存在于腐败物中。下二胺 的应用十分广泛。在农业上下二胺适当添加可W减缓瓜果蔬菜腐烂的时间，从而延长保存 时间；在医学上，下二胺作为一些疾病的判断指标;在工业上，下二胺可W与己二酸聚合合 成新型优质的聚酷胺--尼龙46,具有重要的工业用途。
[0003] 目前合成下二胺的方法有化学合成法和生物合成法。化学合成法条件苛刻、污染 环境、破坏生态，生物合成法和微生物转化法可直接规模化制备人类所需产品是最经济、环 保和最有前途的方法，是研究的方向和热点。
[0004] 生物合成法生产下二胺就是通过微生物利用糖类发酵直接合成下二胺。为了提高 下二胺的产量，根据大肠杆菌的下二胺合成调节情况。对下二胺合成的代谢途径进行改造。 专利公开文献CN 103403147A报道了利用利用谷氨酸棒杆菌重组菌株发酵糖类合成下二胺 的方法:通过阻断谷氨酸棒杆菌的自鸟氨酸至精氨酸的生物合成途径，增加细胞内谷氨酸 水平，增强自谷氨酸至鸟氨酸的生物合成途径并引入细胞外鸟氨酸脱梭酶生产下二胺。专 利公开文献W006/005603也报道了通过通过去除降解或使用腐胺的亚精胺和乙酷腐胺合成 途径来提高下二胺的产量。但由于胞内合成下二胺不能有效分泌到细胞外，造成在细胞内 的积累而抑制赖氨酸脱簇酶的活性，影响下二胺的产量。
[0005] 微生物转化法就是利用微生物细胞表达鸟氨酸脱簇酶，将投入的底物鸟氨酸转化 成下二胺。本发明专利申请通过构建大肠杆菌重组菌株分泌表达鸟氨酸脱簇酶至大肠杆菌 周质腔中，然后向发酵液中投入一定浓度的底物鸟氨酸，周质腔中的鸟氨酸脱簇酶将鸟氨 酸转化为下二胺，避免了下二胺向细胞外转运的难题。因此与上述专利公开文献存在本质 的不同。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过微生物转化合成下二 胺的方法，该方法构建能分泌表达鸟氨酸脱簇酶基因的微生物重组菌株，发酵该重组菌株 并诱导鸟氨酸脱簇酶基因分泌表达至周质腔中，把投入到发酵液中的鸟氨酸转化成下二 胺，，解决了下二胺向细胞外转运的难题。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
[000引一种通过微生物转化合成下二胺的方法，所述方法利用微生物重组菌株表达鸟氨 酸脱簇酶基因，将底物鸟氨酸转化成下二胺，得下二胺。
[0009] 而且，步骤如下：
[0010] 构建能够表达鸟氨酸脱簇酶基因的微生物重组菌株，发酵该微生物重组菌株诱导 鸟氨酸脱簇酶基因的表达，得发酵液，然后向表达鸟氨酸脱簇酶的发酵液中加入鸟氨酸，鸟 氨酸脱簇酶将底物鸟氨酸转化成下二胺，得下二胺。
[0011] 而且，所述鸟氨酸的浓度为5-40g/L。
[0012] 而且，所述鸟氨酸浓度为10-30g/L。
[0013] 而且，所述鸟氨酸浓度为15-25g/L。
[0014] 而且，所述微生物重组菌株为大肠杆菌重组菌株、谷氨酸棒杆菌重组菌株、谷草芽 抱杆菌重组菌株和乳酸菌重组菌株；
[0015] 或者，所述鸟氨酸脱簇酶基因来源于大肠杆菌的spec基因。
[0016] 而且，所述微生物重组菌株的构建方法如下：
[0017] 将鸟氨酸脱簇酶基因连接到微生物的分泌表达载体上，并转化微生物，筛选得到 能分泌表达鸟氨酸脱簇酶基因的微生物重组菌株。
[0018] 而且，所述鸟氨酸脱簇酶基因来源于微生物或高等植物。
[0019] 而且，所述微生物为大肠杆菌、乳酸菌（Lactobaci Ilus)、粗球抱子菌 (Coccidioidesimmits)或摩氏摩根菌(Morganellamorganii);或者，所述高等植物为曼巧 罗、朝鲜劑、冰叶日中花、兰花或白杨。
[0020] 而且，步骤如下：
[0021] (1)产下二胺工程菌株PUT-Cl的构建
[0022] 利用试剂盒提取大肠杆菌的基因组DNA，作为扩增鸟氨酸脱簇酶基因 spec的模板； 根据NCBI提供的大肠杆菌鸟氨酸脱簇酶基因 spec序列设计引物，分别扩增出spec;然后 spec片段通过EcoRI和Nco I酶切后克隆至pET22b+相同酶切位点之间；转化大肠杆菌 E. COli化2UDE3)，经过筛选，获得产下二胺大肠杆菌重组菌PUT-Cl;
[0023] 构建重组菌PUT-Cl所设计的引物序列如下（SEQUENCE1、沈QUENCE2):
[0024]
[0025] 间鸟氨酸脱簇酶SpeC的酶活测定
[0026] ①粗酶液的制备
[0027] 1)从平板上取一环大肠杆菌重组菌PUT-Cl接种于相应抗性的50血液体LB中，在37 °C、200r/min摇床上过夜培养12h;
[00%] 2)按1 %接种量转接入新的LB液体培养基中，在37°C、200巧m的条件下在摇床上培 养；
[0029] 3)当ODsoo = 1.0时，加入终浓度ImM IPTG，然后在37°C，200r/min的条件下诱导化；
[0030] 4)取30mL培养液于50mL离屯、管中，6000r/min离屯、8min;
[0031] 5)弃上清，加入10血无菌憐酸盐缓冲溶液，满旋振荡混匀，补加 PBS至20血，600化/ min离屯、Smin;重复步骤一次；
[0032] 6)加入IOmL PBS，细胞悬液超声处理30min，超声2s，间歇3s，功率40%;
[0033] 7)4°C低溫下8000r/min离屯、15min，除去细胞碎片上清即为粗酶液；
[0034] ②鸟氨酸脱簇酶SpeC的SDS-PAGE分析
[0035] 将待用的凝胶浸泡在缓冲液中，用微量进样器按号向凝胶孔中加样;接上电泳仪， 打开电源，调节电流至20-30mA，保持恒流，待样品迁移至分离胶下端Icm处时，关闭电源；电 泳完毕后，取下电泳凝胶，并在凝胶的一角小屯、切去一小块作为标记，倒入考马斯亮蓝染色 液进行染色化;倾倒出染色液，将凝胶在水中漂洗数次;加入脱色液，开始每隔化更换脱色 液一次，直至凝胶背景清晰；
[0036] PUT-Cl进行诱导表达及SDS-PAGE分析；
[0037] ③酶活测定
[0038] 1)取800化不同pH的憐酸缓冲液于5mL无菌具塞刻度管中，至于37°C水浴预热 5min;平行3个；
[0039] 2)加入10化L粗酶液，加入k精氨酸母液10化L，开始计时30min;对照组用无菌水 替代心精氨酸；
[0040] 3)将具塞刻度管置于冰上，迅速加入50化L 2MNa0H终止反应；
[0041] 4)衍生，上柱检测下二胺的生成量；
[0042] ④鸟氨酸脱簇酶活性检测结果
[0043] 根据HPLC检测下二胺转化结果，检测鸟氨酸脱簇酶SpeC的活性；
[0044] 间重组菌株PUT-Cl的摇瓶发酵及下胺产量的测定
[0045] ①摇瓶发酵
[0046] 在平板上挑取一环单克隆重组菌株接种到含有5mL LB培养基中培养10-1化，W 1%的接种量接入到装有50mL LB培养基的250mLS角瓶中，37°C，200r/min培养至ODsoo = 1.0，加入终浓度ImM IPTG，然后在37°C，200r/min的条件下诱导化;投入底物鸟氨酸，其中 鸟氨酸的浓度分别为0旨/1、10旨/1、20旨/1、30旨/1和40旨凡，每组平行^个;37°(：，200以111111培 养12h;发酵液12000r/min离屯、5min，取上清液4°C保存；
[0047] ②HPLC检测下二胺
[0048] 实验采用国标法检测下二胺的含量，通过对水样进行柱前衍生，水样经苯甲酯氯 衍生化后用乙酸萃取，萃取物经溶剂转换溶于甲醇后用高效液相色谱紫外检测；
[0049] 1)样品的衍生和萃取
[0化0] 取ImL上清液加入5mL具塞刻度试管中，加入50化L 2mol/L化OH溶液、1化L苯甲酯 氯，37°C水浴振摇20min，隔5min旋满振荡30s，加入0.5g化Cl、1血乙酸振荡30s静置分层； 把上层乙酸取至另一离屯、管中，待乙酸挥发完全，加入5(K)化甲醇溶解，过膜后作为HPLC检 测用样;标准溶液的衍生和萃取步骤同样品处理步骤；
[0化1] 2)HPLC 测定 [0化2] a色谱条件
[0化3] A)色谱柱:C18色谱柱，5wii，4.6 X 250mm，或性能相当者；
[0化4] B)柱溫:室溫；
[0055] C)流动相:A(乙腊），B(0.02mol/L乙酸锭），梯度洗脱条件如下：
[0化6]
[0化7] D)检测波长：254nm。
[0化引 E)进样量：
[0059] F)流速：lmL/min;
[0060] b液相色谱分析测定
[0061] 开机，预热，使用流动相冲洗色谱柱，基线稳定30min后开始进样；
[0062] 将发酵液上清稀释后衍生进行HPLC分析，通过峰面积计算出下二胺的含量。
[0063] 本发明的优点和积极效果：
[0064] 本发明方法通过构建大肠杆菌重组菌株分泌表达鸟氨酸脱簇酶至大肠杆菌周质 腔中，然后向发酵液中投入一定浓度的底物鸟氨酸，周质腔中的鸟氨酸脱簇酶将鸟氨酸转 化为下二胺，解决了下二胺向细胞外转运的难题，降低了生产成本，经济环保，操作简单方 便，提高了下二胺的产量。
【附图说明】
[00化]图1为本发明中E.COli基因组DNA图；
[0066] 图2为本发明中spec的PCR产物图；
[0067] 图3为本发明中祀T22b-speC双酶切结果图；
[006引图4为本发明中诱导表达产物SDS-PAGE分析图；
[0069] 图5为本发明中下二胺的标准品图；
[0070] 图6为本发明中样品色谱图；
[0071 ]图7为本发明中下二胺含量的标准曲线图；
[0072] 图8为本发明中不同投料量的下二胺的产量图。
【具体实施方式】
[0073] 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能W下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0074] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的 方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0075] 本发明所运用的技术手段：
[0076] 本发明的基因序列设及鸟氨酸脱簇酶基因，其序列为已知序列。质粒祀T2化+、分 子操作技术、微生物培养技术及下二胺的检测等，对于本领域的技术人员而言都是公知的。
[0077] 实施例1
[0078] -种通过微生物转化合成下二胺的方法，所述方法利用微生物重组菌株表达鸟氨 酸脱簇酶基因，将底物鸟氨酸转化成下二胺。
[0079] 步骤可W如下：
[0080] 构建能够表达鸟氨酸脱簇酶基因的微生物重组菌株，发酵该微生物重组菌株诱导 鸟氨酸脱簇酶基因的表达，得发酵液，然后向表达鸟氨酸脱簇酶的发酵液中加入鸟氨酸，鸟 氨酸脱簇酶将底物鸟氨酸转化成下二胺；
[0081] 其中，所述鸟氨酸的浓度可W是5-40g/L，优选的鸟氨酸浓度是10-30g/L，更优选 的鸟氨酸浓度是15-25g/L。
[0082] 进一步地，所述微生物重组菌株为大肠杆菌重组菌株、谷氨酸棒杆菌重组菌株、谷 草芽抱杆菌重组菌株和乳酸菌重组菌株；
[0083] 或者，所述鸟氨酸脱簇酶基因来源于大肠杆菌的spec基因。
[0084] 进一步地，所述微生物重组菌株的构建方法如下：
[0085] 将鸟氨酸脱簇酶基因连接到微生物的分泌表达载体上，并转化微生物，筛选得到 能分泌表达鸟氨酸脱簇酶基因的微生物重组菌株。
[0086] 进一步地，所述鸟氨酸脱簇酶基因可W来源于大肠杆菌、乳酸菌 (Lactobacillus)、粗球抱子菌（Coccidioidesimmits)、摩氏摩根菌(MorgansIlamo!Tganii) 等微生物；也可W来源于曼巧罗（DaturaStramonium)、朝鲜劑（切narascoIymus )、冰叶日中 花(Mesembiranthemumcrystallinum)、兰花（切mbidium)、白杨（poplar)等高等植物；更优 选的是来源于大肠杆菌的spec基因。
[0087] 实施例2
[0088] -种通过微生物转化合成下二胺的方法，具体步骤如下：
[0089] (1)产下二胺工程菌株PUT-Cl的构建
[0090] 将鸟氨酸脱簇酶基因连接于表达质粒pET22b+上构建质粒pET22b-speC，转化入 E.coli BL2UDE3)中构建成工程菌株E.coli 化21(DE3)/祀T22b-speC。
[0091] 具体地，利用试剂盒提取大肠杆菌的基因组DM,作为扩增鸟氨酸脱簇酶基因 spec 的模板，如图1;根据NCBI提供的大肠杆菌鸟氨酸脱簇酶基因 spec序列设计引物，分别扩增 出spec,如图2;然后spec片段通过EcoRI和化0 I酶切后克隆至祀T2化+相同酶切位点之间， 得质粒祀T2化-spec，如图3;转化大肠杆菌E. COl i化21 (DE3)，经过筛选，获得产下二胺大 肠杆菌重组菌PUT-Cl。
[0092] 构建重组菌PUT-Cl所设计的引物序列如表1:
[0093] 表1:构建重组菌PUT-Cl所需引物
[0094]
[OOM] (2)鸟氨酸脱簇酶Spec的酶活测定
[0096] 测定鸟氨酸脱簇酶Spec的活性方法步骤如下：
[0097] 1、粗酶液的制备
[009引1)从平板上取一环重组菌株接种于相应抗性的50mL液体LB中，在37°C、200r/min 摇床上过夜培养12h。
[0099] 2)按1 %接种量转接入新的LB液体培养基中，在37°C、200rpm的条件下在摇床上培 养。
[0100] 3)当0〇6日日=1.0时，加入终浓度111111?16，然后在37°(：，20化/111111的条件下诱导化。
[0101 ] 4)取30mL培养液于50mL离屯、管中，6000;r/min离屯、8min。
[0102] 5)弃上清，加入IOmL无菌憐酸盐缓冲溶液(PBS)，满旋振荡混匀，补加 PBS至20mL， BOOOr/min离屯、8min。重复步骤一次
[0103] 6)加入IOmL PBS，细胞悬液超声处理30min，超声2s，间歇3s，功率40%。
[0104] 7)4°C低溫下8000r/min离屯、15min，除去细胞碎片上清即为粗酶液。
[0105] 2、鸟氨酸脱簇酶SpeC的SDS-PAGE分析
[0106] 将待用的凝胶浸泡在缓冲液中，用微量进样器按号向凝胶孔中加样。接上电泳仪， 打开电源，调节电流至20-30mA，保持恒流，待样品迁移至分离胶下端Icm处时，关闭电源。电 泳完毕后，取下电泳凝胶，并在凝胶的一角小屯、切去一小块作为标记，倒入考马斯亮蓝染色 液进行染色，约化。倾倒出染色液，将凝胶在水中漂洗数次。加入脱色液，开始每隔化更换脱 色液一次，直至凝胶背景清晰。
[0107] PUT-Cl进行诱导表达及SDS-PAGE分析，电泳结果如图4。鸟氨酸脱簇酶的分子量大 小均为SOkD左右。
[010引3、酶活测定
[0109] 1)取800化不同pH的憐酸缓冲液于5mL无菌具塞刻度管中，至于37°C水浴预热 5min。平行3个。
[0110] 2)加入10化L粗酶液，加入k精氨酸母液10化L，开始计时30min。对照组用无菌水 替代心精氨酸。
[0111] 3)将具塞刻度管置于冰上，迅速加入50化L 2MNa0H终止反应。
[0112] 4)衍生，上柱检测下二胺的生成量。
[0113] 4、鸟氨酸脱簇酶活性检测结果
[0114] 根据HPLC检测下二胺转化结果，鸟氨酸脱簇酶SpeC的活性为17.48U/mL。
[0115] (3)重组菌株PUT-Cl的摇瓶发酵及下胺产量的测定
[0116] 1、摇瓶发酵
[0117] 在平板上挑取一环单克隆重组菌株接种到含有5mL LB培养基中培养10-1化，W 1%的接种量接入到装有50mL LB培养基的250mLS角瓶中，37°C，200r/min培养至ODsoo = 1.0,加入终浓度ImM IPTG，然后在37°C，200r/min的条件下诱导化。投入底物鸟氨酸，其中 鸟氨酸的浓度分别为0旨/1、10旨/1、20旨/1、30旨/1和40旨凡，每组平行^个。37°(：，200以111111培 养12h。发酵液12000r/min离屯、5min，取上清液4°C保存。
[011引 2、HPLC检测下二胺
[0119] 实验采用国标法检测下二胺的含量，通过对水样进行柱前衍生，水样经苯甲酯氯 衍生化后用乙酸萃取，萃取物经溶剂转换溶于甲醇后用高效液相色谱化PLC)紫外检测。此 法灵敏度局，下二胺在2-40mg/L范围内呈线性关系。
[0120] 1)样品的衍生和萃取
[0121] 取ImL上清液加入5mL具塞刻度试管中，加入50化L 2mol/L化OH溶液、1化L苯甲酯 氯，37°C水浴振摇20min，隔5min旋满振荡30s，加入0.5g化Cl、1血乙酸振荡30s静置分层。 把上层乙酸取至另一离屯、管中，待乙酸挥发完全，加入5(K)化甲醇溶解，过膜后作为HPLC检 测用样。标准溶液的衍生和萃取步骤同样品处理步骤。
[0122] 2) HPLC 测定
[0123] a色谱条件
[0124] A)色谱柱:C18色谱柱，5皿，4.6 X 250mm，或性能相当者。
[0125] B)柱溫:室溫。
[0126] C)流动相:A(乙腊），B(0.02mol/L乙酸锭），梯度洗脱条件见表2。
[0127] D)检测波长:254nm。
[012引 E)进样量：10化。
[0129] F)流速：lmL/min
[0130] b液相色谱分析测定
[0131] 开机，预热，使用流动相冲洗色谱柱，基线稳定30min后开始进样
[0132] 表2梯度洗脱条件
[0133]
[0134] 将发酵液上清稀释一定倍数后衍生进行HPLC分析，标准品和样品液相色谱图分别 为图5和图6,下二胺衍生物在约6.Smin时出峰。根据图7标准曲线，通过峰面积计算出下二 胺的含量。
[0135] 采用外标法生成峰面积(y)-下二胺盐酸盐样品浓度(X)的标准曲线及其线性回归 方程。从图4可W得出，采用外标法生成峰面积(y)-下二胺盐酸盐样品浓度(X)的标准曲线 及其线性回归方程。
[0136] 7 = 16.342针5.：34式（1)
[0137] 其中，y为峰面积，X为下二胺盐酸盐浓度，方程线性回归相关系数(Rs)为0.999。
[0138] 根据标准曲线测定不同样品中的下二胺的含量。每个样品做=个重复，求下二胺 产量的平均值。结果如图8所示。从图8可W看出，未投入鸟氨酸的发酵液中下二胺产量为0; 当投入鸟氨酸的浓度为lOg/L时，下二胺产量为500±17111邑/1;当投入鸟氨酸的浓度为20g/L 时，下二胺产量为1690±64111旨几；当投入鸟氨酸的浓度为30g/L时，下二胺产量为1240± 27111旨几；当投入鸟氨酸的浓度为40g/L时，下二胺产量为696±8mg/L。说明在底物浓度为 20g/L时，发酵液中下二胺积累量最大，表达鸟氨酸脱簇酶转化鸟氨酸为下二胺可W有效提 高下二胺的产量。
【主权项】
1. 一种通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:所述方法利用微生物重组菌 株表达鸟氨酸脱羧酶基因，将底物鸟氨酸转化成丁二胺，得丁二胺。2. 根据权利要求1所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:步骤如下： 构建能够表达鸟氨酸脱羧酶基因的微生物重组菌株，发酵该微生物重组菌株诱导鸟氨 酸脱羧酶基因的表达，得发酵液，然后向表达鸟氨酸脱羧酶的发酵液中加入鸟氨酸，鸟氨酸 脱羧酶将底物鸟氨酸转化成丁二胺，得丁二胺。3. 根据权利要求2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:所述鸟氨酸 的浓度为5_40g/L。4. 根据权利要求2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:所述鸟氨酸 浓度为10_30g/L。5. 根据权利要求2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:所述鸟氨酸 浓度为15_25g/L。6. 根据权利要求1或2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:所述微 生物重组菌株为大肠杆菌重组菌株、谷氨酸棒杆菌重组菌株、谷草芽孢杆菌重组菌株和乳 酸菌重组菌株； 或者，所述鸟氨酸脱羧酶基因来源于大肠杆菌的speC基因。7. 根据权利要求1或2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:所述微 生物重组菌株的构建方法如下： 将鸟氨酸脱羧酶基因连接到微生物的分泌表达载体上，并转化微生物，筛选得到能分 泌表达鸟氨酸脱羧酶基因的微生物重组菌株。8. 根据权利要求1或2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:所述鸟 氨酸脱羧酶基因来源于微生物或高等植物。9. 根据权利要求5所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:所述微生物 为大肠杆菌、乳酸菌(Lactobacillus )、粗球孢子菌（Coccidioidesimmits)或摩氏摩根菌 (Morganellamorganii);或者，所述高等植物为曼陀罗、朝鲜蓟、冰叶日中花、兰花或白杨。10. 根据权利要求1或2所述的通过微生物转化合成丁二胺的方法，其特征在于:步骤如 下： ⑴产丁二胺工程菌株PUT-C1的构建 利用试剂盒提取大肠杆菌的基因组DNA，作为扩增鸟氨酸脱羧酶基因 speC的模板;根据 NCBI提供的大肠杆菌鸟氨酸脱羧酶基因 speC序列设计引物，分别扩增出speC;然后speC片 段通过EcoRI和Nco頂每切后克隆至pET22b+相同酶切位点之间；转化大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)，经过筛选，获得产丁二胺大肠杆菌重组菌PUT-C1; 构建重组菌PUT-C1所设计的引物序列为SEQUENCE1、SEQUENCE2; ⑵鸟氨酸脱羧酶SpeC的酶活测定 ①粗酶液的制备 1) 从平板上取一环大肠杆菌重组菌PUT-C1接种于相应抗性的50mL液体LB中，在37°C、 200r/min摇床上过夜培养12h; 2) 按1 %接种量转接入新的LB液体培养基中，在37°C、200rpm的条件下在摇床上培养； 3) 当0D6Q()= 1.0时，加入终浓度ImM IPTG，然后在37°C，200r/min的条件下诱导6h; 4) 取30mL培养液于50mL离心管中，6000r/min离心8min; 5) 弃上清，加入10mL无菌磷酸盐缓冲溶液，涡旋振荡混匀，补加 PBS至20mL，6000r/min 离心8min;重复步骤一次； 6) 加入10mL PBS，细胞悬液超声处理30min，超声2s，间歇3s，功率40 % ; 7 )4 °C低温下8000r/min离心15min，除去细胞碎片上清即为粗酶液； ② 鸟氨酸脱羧酶SpeC的SDS-PAGE分析 将待用的凝胶浸泡在缓冲液中，用微量进样器按号向凝胶孔中加样;接上电泳仪，打开 电源，调节电流至20_30mA，保持恒流，待样品迀移至分离胶下端lcm处时，关闭电源；电泳完 毕后，取下电泳凝胶，并在凝胶的一角小心切去一小块作为标记，倒入考马斯亮蓝染色液进 行染色lh;倾倒出染色液，将凝胶在水中漂洗数次;加入脱色液，开始每隔2h更换脱色液一 次，直至凝胶背景清晰； RJT-C1进行诱导表达及SDS-PAGE分析； ③ 酶活测定 1) 取800yL不同pH的磷酸缓冲液于5mL无菌具塞刻度管中，至于37°C水浴预热5min;平 行3个； 2) 加入100yL粗酶液，加入L-精氨酸母液100yL，开始计时30min;对照组用无菌水替代 L-精氨酸； 3) 将具塞刻度管置于冰上，迅速加入500yL 2MNaOH终止反应； 4) 衍生，上柱检测丁二胺的生成量； ④ 鸟氨酸脱羧酶活性检测结果 根据HPLC检测丁二胺转化结果，检测鸟氨酸脱羧酶SpeC的活性； (3)重组菌株PUT-C1的摇瓶发酵及丁胺产量的测定 ① 摇瓶发酵 在平板上挑取一环单克隆重组菌株接种到含有5mL LB培养基中培养10-12h，以1 %的 接种量接入到装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37°C，200r/min培养至0D6Q()= 1.0，加 入终浓度ImM IPTG，然后在37°C，200r/min的条件下诱导6h;投入底物鸟氨酸，其中鸟氨酸 的浓度分别为〇g/L、10g/L、20g/L、30g/L和40g/L，每组平行三个;37°C，200r/min培养 12h; 发酵液12000r/min离心5min，取上清液4°C保存； ② HPLC检测丁二胺 实验采用国标法检测丁二胺的含量，通过对水样进行柱前衍生，水样经苯甲酰氯衍生 化后用乙醚萃取，萃取物经溶剂转换溶于甲醇后用高效液相色谱紫外检测； 1) 样品的衍生和萃取 取lmL上清液加入5mL具塞刻度试管中，加入500yL 2mol/LNaOH溶液、10yL苯甲酰氯，37 °C水浴振摇20min，隔5min旋涡振荡30s，加入0.5g NaCl、lmL乙醚振荡30s静置分层;把上层 乙醚取至另一离心管中，待乙醚挥发完全，加入500yL甲醇溶解，过膜后作为HPLC检测用样； 标准溶液的衍生和萃取步骤同样品处理步骤； 2. HPLC测定 a色谱条件 A)色谱柱:C18色谱柱，5以111，4.6\25〇111111，或性能相当者； B) 柱温:室温； C) 流动相:A(乙腈），B(0.02mol/L乙酸铵），梯度洗脱条件如下：D) 检测波长:254nm〇 E) 进样量：10yL; F) 流速：lmL/min; b液相色谱分析测定 开机，预热，使用流动相冲洗色谱柱，基线稳定30min后开始进样； 将发酵液上清稀释后衍生进行HPLC分析，通过峰面积计算出丁二胺的含量。
【文档编号】C12N15/60GK105925629SQ201610317948
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】黎明, 路福平, 随树珍
【申请人】天津科技大学