一种利用重组枯草脯氨酸氨肽酶降解酪蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用重组枯草脯氨酸氨肽酶降解酪蛋白的方法，属于酶工程、食品添加剂领域。本发明利用脯氨酸氨肽酶协同碱性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶水解酪蛋白，游离氨基酸含量为3.968mg/mL，为未水解前的游离氨基酸含量的63倍，2000Da以上的多肽基本上已经不存在了，而180Da以下的小肽含量达到了36.66％，充分水解了暴露出的N端脯氨酸残基，游离的脯氨酸含量为0.044mg/mL，是未水解游离脯氨酸含量的3.67倍，提高了酪蛋白水解深度。本发明方法在食品和饮料中、在食品蛋白资源加工利用领域具有很好的应用前景。
【专利说明】
-种利用重组枯草脯氨酸氨化酶降解酪蛋白的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种利用重组枯草脯氨酸氨肤酶降解酪蛋白的方法，属于酶制剂、食 品添加剂领域。
【背景技术】
[0002] 酶制剂是指从生物中提取的具有酶类性质的物质，现已应用在医药、化工、食品、 酿造等各领域，应用范围非常的广泛。食品加工业与人们的生活关系紧密，酶在食品加工业 中的应用越来越多，作用也越来越重要，在肉类加工、蛋白质的深度水解和作为食品添加剂 中有很大体现。
[0003] 酶制剂伴随着社会的发展其应用也越来越广泛，氨肤酶也在不断的开拓其应用领 域。非特异的氨肤酶能广谱的水解蛋白或多肤N-端的氨基酸残基，可W水解多肤或蛋白N- 端不同种类的氨基酸残基，游离出不同种类的氨基酸。酪蛋白水解物可W应用于食品添加 剂，内切蛋白酶可W对酪蛋白进行水解，但是水解后的产物含有强烈的苦味，从而限制了其 广泛的应用。进一步的研究发现运些苦味来源于酪蛋白被蛋白酶水解后所形成的含有脯氨 酸的中间肤，酪蛋白中脯氨酸含量较高，特别是e-酪蛋白，其209个氨基酸序列中有34个脯 氨酸。对于非特异性的氨肤酶而言，他们可W从多肤末端水解大多数的氨基酸残基，但是却 不能切割N末端为脯氨酸的多肤。因此，如何通过酶的协同降解提高酪蛋白的水解度、增加 小肤的含量及游离的氨基酸含量，也是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明利用脯氨酸氨肤酶协同碱性蛋白酶和亮氨酸氨肤酶降 解酪蛋白，结果大大提高了酪蛋白的水解度，增加了小肤的含量及游离的氨基酸含量。本实 验室生产的脯氨酸氨肤酶是一种具有严格底物特异性的氨肤酶，它只能专一水解N末端的 脯氨酸残基，对Pro-Leu、Pro-Ly S、Pro-Pro、Leu-Pro、Pro-Phe-Gly-Ly S、Pro-Leu-Ser-Ai^g- !'虹-Leu-Ser-化I-Ala-Ala-Lys-Lys等6种二肤或多肤水解时，表现出不同的底物选择性和 水解速率。本发明利用脯氨酸氨肤酶能特异性地切除N末端的脯氨酸残基，可W去除一些特 异性不高的氨肤酶进一步水解Pro的障碍，对脯氨酸含量高的蛋白原料种类能起较好的协 同水解和脱苦作用。
[0005] 本发明提供了一种酪蛋白的水解方法，是依次用碱性蛋白酶、亮氨酸氨肤酶、脯氨 酸氨肤酶进行水解。
[0006] 所述方法，是配制质量浓度为1-3%的酪蛋白溶液，
[0007] (1)加入适量碱性蛋白酶，于40-50°C下反应2.5-3.化，沸水浴10-20min;
[000引（2)冷却后继续加入适量的亮氨酸氨肤酶，45-50°C反应2.5-3.化，沸水浴10- 20min;
[0009] (3)冷却后再加入适量的脯氨酸氨版酶，45-5CTC反应2.5-3.511，沸水浴1〇-2〇111王〇。
[0010] 所述步骤(1)中碱性蛋白酶添加量为30000-34000U/g酪蛋白。
[0011] 所述步骤(2)中亮氨酸氨肤酶添加量为800-1000U/g酪蛋白。
[0012] 所述步骤(3)中脯氨酸氨肤酶添加量为400-500U/g酪蛋白。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述酪蛋白溶液是采用PBS缓冲液配制。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述PBS缓冲液浓度50mM、pH7.5。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸氨肤酶的核巧酸序列如SEQ ID NO.1所 /J、- O
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸氨肤酶是利用重组菌生产、纯化得到的。 所述重组菌是在前期构建（中国专利201510497845.0)的重组枯草芽抱杆菌的基础上，在编 码脯氨酸氨肤酶基因的上游加入了编码组氨酸标签的基因，而得到的。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述纯化，是将重组菌的发酵液经离屯、、超滤、透析、 儀亲和层析、透析得到的电泳纯的脯氨酸氨肤酶。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述方法，具体是：用50mM pH7.5的PBS缓冲液配制 2%的酪蛋白溶液;然后，
[0019 ] (1)加入适量的碱性蛋白酶粉末，50 °C反应化，沸水浴15min;
[0020] (2)冷却后继续加入适量的亮氨酸氨肤酶粉末，50°C反应化，沸水浴15min;
[0021] (3)冷却后再加入适量的脯氨酸氨肤酶酶液，50°C反应化，沸水浴15min。
[0022] 所述步骤(3)反应后，冷却后将所得水解液在100(K)rpm的条件下离屯、15min，取上 清液；将上清液用10%=氯乙酸等体积稀释，放置Ih,然后用针头式滤器过滤，滤液于 1000化pm离屯、lOmin，再次取上清液。然后分别进行多肤分子量分布、游离氨基酸分析。
[0023] 本发明W不同的小分子底物进行水解，水解速率作为指标，判断该酶的底物选择 性；W酪蛋白为底物，该酶与碱性蛋白酶、亮氨酸氨肤酶协同水解，W小肤和游离氨基酸含 量为依据，优化脯氨酸氨肤酶在酪蛋白降解中的作用。
[0024] 本发明还提供所述方法在食品和饮料中、在食品蛋白资源加工利用领域的应用。
[0025] 本发明还提供一种纯化所述脯氨酸氨肤酶的方法，是将重组菌发酵液离屯、取上 清，得粗酶液，再利用截留分子量30kDa的超滤离屯、管进行超滤浓缩，得到的超滤浓缩液在 缓冲液A中透析过夜，取透析液上样儀亲和层析柱，流速保持ImL/min，先用5个柱体积的缓 冲液A洗脱，再用5个柱体积的缓冲液B洗脱，根据紫外检测器读数变化，分批收集洗脱液，将 得到的洗脱液，在Tris-HCl pH7.5缓冲液中透析过夜，即得到脯氨酸氨肤酶纯酶液。
[00%]本发明的有益效果：
[0027]本发明脯氨酸氨肤酶通过儀柱纯化，简化了提取工艺，小分子底物的选择性，为脯 氨酸氨肤酶的应用提供了参照，该酶协同碱性蛋白酶和亮氨酸氨肤酶水解酪蛋白后，游离 氨基酸含量为3.968mg/mL，为未水解前的游离氨基酸含量的63倍，2000DaW上的多肤基本 上已经不存在了，而ISODaW下的小肤含量达到了36.66%，充分水解了暴露出的N端脯氨酸 残基，游离的脯氨酸含量为0. 〇44mg/mL，是未水解游离脯氨酸含量的3.67倍，提高了酪蛋白 水解深度，在食品和饮料中具有很好的应用前景。
【附图说明】
[00%]图1: SDS-PAGE结果(M:低分子量蛋白标准，1:粗酶液，2:儀亲和层析洗脱液）。
【具体实施方式】
[0029] 缓冲液A:40mmol/L咪挫，50mM Tris-肥 1(抑7.5)和0.5mol/L NaCl。
[0030] 缓冲液B:0.5mol/L咪挫，50mM Tris-HCl(pH7.5)和0.5mol/L NaCl。
[0031] 脯氨酸氨肤酶酶活测定方法：脯氨酸-对硝基苯胺为底物（底物储藏液用 Tris-肥1 7.5配制，浓度为4.25mM)，反应混合物包括1血稀释后的酶液，2血Tris-肥1 7.5 缓冲液和ImL底物储藏液，50°C水浴反应10min，在405nm处测定吸光值。
[0032] 酶活单位化)定义为50°C每分钟分解k脯氨酸-对硝基苯胺产生IiiM对硝基苯胺所 需的酶量。
[0033] 多肤分子量分布检测:Waters600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和Empower 工作站）。
[0034] 水解液中游离氨基酸的测定:使用氨基酸液相色谱仪(AgllOO)进行测定。
[0035] 实施例1:重组枯草脯氨酸氨肤酶的制备
[0036] 取40mL经2地培养的重组枯草芽抱杆菌WB600发酵液，在1000化pm、4°C条件下离屯、 lOmin，取上清，弃沉淀，得粗酶液，再进行超滤浓缩，所用的为截留分子量30kDa超滤离屯、 管，超滤条件为5000rpm、4°C离屯、20min，浓缩倍数控制在3-4倍，超滤浓缩液在4°C、1L缓冲 液A中透析过夜，取5mL透析液上样儀亲和层析柱，流速保持ImL/min，先用5个柱体积的缓冲 液A洗脱，再用5个柱体积的缓冲液B洗脱，根据紫外检测器读数变化，分批收集洗脱液，将得 到的洗脱液，在化iS-HCl pH7.5缓冲液中，4°C透析过夜，透析液进行SDS-PAGE。
[0037] 实施例2:重组枯草脯氨酸氨肤酶小分子底物选择性
[0038] 用0.05M的PBS pH 7.5缓冲液配置lmM合成的二肤和多肤：Pro-Leu、Pro-Lys、Pro- pro、Leu-Pro、Pro-Phe-Gly-Lys、Pro-Leu-Ser-Arg-Thr-Leu-Ser-Val-Ala-Ala-Lys-Lys。
[0039] 分别取0.9mL的二肤和多肤溶液，然后加入0.1mL经0.05M的PBSpH7.5缓冲液稀 释的酶液(酶液为实施例1所述方法得到，酶活为15.4U/mL)。
[0040] 在50°C下反应10min后，立即加入2.5mL乙酸和2.5血巧S酬溶液，沸水浴30min，在 480nm测吸光值，空白对照为0.1 mL0.0 5M的PBS pH 7.5缓冲液代替稀释酶液，W水解能力最 高者为100 %。结果表明：水解Pro-Leu的相对活力为69.5%、对Pro-Lys的相对活力为 74.4%、对Pro-Pro相对活力为44.1%、对Leu-Pro的相对活力为0、对Pro-陆e-Gly-Lys的相 对活力为 100 %、对Pro-Leu-Ser-Arg-Thr-Leu-Ser-Val-Ala-Ala-LyS-LyS的相对活力为 17.4%。重组脯氨酸氨肤酶对不同小分子底物的水解能力存在差异，对小分子底物水解具 有选择性。实施例3:重组枯草脯氨酸氨肤酶在酪蛋白降解中的作用
[0041 ] 用50mM pH7.5的PBS缓冲液配制2%的酪蛋白溶液，加入32000U/g酪蛋白的碱性蛋 白酶粉末，50°C反应化，沸水浴15min，冷却后继续加入900U/g酪蛋白的亮氨酸氨肤酶粉末， 50°C反应化，沸水浴15min，冷却后再加入450U/g酪蛋白的重组脯氨酸氨肤酶酶液(实施例1 方法所得），50°C反应化，沸水浴15min，冷却，酪蛋白水解液中2000化W上的多肤基本上已 经不存在了，而180化W下的小肤含量达到了36.66%，游离的脯氨酸含量为0.044mg/血，是 未水解游离脯氨酸含量的3.67倍。
[0042]此外，发明人还比较了不同酶解方法对酪蛋白水解效果的影响，结果如表1所示。 结果显示，碱性蛋白酶单独水解时ISODaW下的小肤含量为23.28%，亮氨酸氨肤酶单酶水 解时180Da W下的小肤含量为6.17 %，碱性蛋白酶和亮氨酸氨肤酶双酶水解时180Da W下的 小肤含量为34.25%，碱性蛋白酶和脯氨酸氨肤酶双酶水解时ISODaW下的小肤含量为 22.41%。
[0043]表1不同酶解方法对酪蛋白水解效果的影响 「rwvMl
[0045] 注：1:酪蛋白溶液，2:碱性蛋白酶单酶水解液，3:亮氨酸氨肤酶单酶水解液，4:碱 性蛋白酶和亮氨酸氨肤酶双酶水解液，5:脯氨酸氨肤酶、碱性蛋白酶和亮氨酸氨肤酶协同 水解液，6:碱性蛋白酶和脯氨酸氨肤酶双酶水解液。
[0046] 另外，本发明方法得到的游离氨基酸含量为3.968mg/mL，为未水解的游离氨基酸 含量的63倍，其中脯氨酸含量为未水解的3.67倍。而碱性蛋白酶单独水解时游离氨基酸含 量为1.449mg/mL，亮氨酸氨肤酶单酶水解时游离氨基酸含量为0.767mg/mL，碱性蛋白酶和 亮氨酸氨肤酶双酶水解时游离氨基酸含量为3.361mg/mL，碱性蛋白酶和脯氨酸氨肤酶双酶 水解时游离氨基酸含量为2.193mg/mL且脯氨酸含量为未水解的2.8倍。
[0047] 本发明通过W富含脯氨酸的酪蛋白为底物，脯氨酸氨肤酶与碱性蛋白酶、亮氨酸 氨肤酶协同水解得到的水解物中游离氨基酸的含量和小肤含量都大幅增加，酪蛋白的水解 度不仅大大提高，原本小肤末端的疏水氨基酸被水解也可大大消除苦味。
[004引实施例4:酪蛋白降解方法
[0049] 本发明的酪蛋白水解方法，是配制质量浓度为1.5 %的酪蛋白溶液，
[0050] (1)加入适量碱性蛋白酶，于40 r下反应3.化，沸水浴IOmin;
[0051 ] (2)冷却后继续加入适量的亮氨酸氨肤酶，45°C反应3.化，沸水浴IOmin;
[0052] (3)冷却后再加入适量的脯氨酸氨肤酶，45°C反应3.化，沸水浴IOmin;
[0053] 其中碱性蛋白酶添加量为34000U/g酪蛋白；亮氨酸氨肤酶添加量为800U/g酪蛋 白；脯氨酸氨肤酶添加量为400U/g酪蛋白。
[0054] 得到的酪蛋白水解液中2000化W上的多肤基本上已经不存在了，而1 SODa W下的 小肤含量达到了 36.25%，游离氨基酸含量为3.849mg/mL，游离的脯氨酸含量为未水解的 3.46 倍。
[0055] 实施例5:酪蛋白降解方法
[0056] 本发明的酪蛋白水解方法，是配制质量浓度为2.5 %的酪蛋白溶液，
[0057] (1)加入适量碱性蛋白酶，于45 °C下反应2.化，沸水浴20min;
[005引（2)冷却后继续加入适量的亮氨酸氨肤酶，50°C反应2.化，沸水浴20min;
[0059] (3)冷却后再加入适量的脯氨酸氨肤酶，50°C反应2.化，沸水浴20min;
[0060] 其中碱性蛋白酶添加量为30000U/g酪蛋白；亮氨酸氨肤酶添加量为lOOOU/g酪蛋 白；脯氨酸氨肤酶添加量为500U/g酪蛋白。
[0061 ] 得到的酪蛋白水解液中2000化W上的多肤基本上已经不存在了，而1 SODa W下的 小肤含量达到了 37.82 %，游离氨基酸含量为4.142mg/mL。
[0062]虽然本发明已W较佳实施例公开如上，但其并非用W限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该W权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种酪蛋白的水解方法，其特征在于，所述方法是依次用碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽 酶、脯氨酸氨肽酶进行水解。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，是配制质量浓度为1-3%的酪蛋 白溶液， (1) 加入适量碱性蛋白酶，于40-50 °C下反应2.5-3.5h，沸水浴10-20min; (2) 冷却后继续加入适量的亮氨酸氨肽酶，45-50 °C反应2.5-3.5h，沸水浴10-20min; (3) 冷却后再加入适量的脯氨酸氨肽酶，45-50 °C反应2.5-3.5h，沸水浴10-20min。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸氨肽酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中碱性蛋白酶添加量为 30000-34000U/g 酪蛋白。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中亮氨酸氨肽酶添加量为 800-1000U/g 酪蛋白。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中脯氨酸氨肽酶添加量为 400-500U/g 酪蛋白。7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法，具体是：用50mM pH7.5的PBS缓 冲液配制2 %的酪蛋白溶液;然后， (1) 加入适量的碱性蛋白酶粉末，50 °C反应3h，沸水浴15min; (2) 冷却后继续加入适量的亮氨酸氨肽酶粉末，50°C反应3h，沸水浴15min; (3) 冷却后再加入适量的脯氨酸氨肽酶酶液，50°C反应3h，沸水浴15min。8. 权利要求1-7任一所述方法在食品领域的应用。9. 一种纯化脯氨酸氨肽酶的方法，其特征在于，所述方法是将重组菌发酵液离心取上 清，得粗酶液，再利用截留分子量30kDa的超滤离心管进行超滤浓缩，得到的超滤浓缩液在 缓冲液A中透析过夜，取透析液上样镍亲和层析柱，流速保持lmL/min，先用5个柱体积的缓 冲液A洗脱，再用5个柱体积的缓冲液B洗脱，根据紫外检测器读数变化，分批收集洗脱液，将 得到的洗脱液，在Tris-HCl pH7.5缓冲液中透析过夜，即得到脯氨酸氨肽酶纯酶液。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述重组菌是在中国专利 201510497845.0的重组枯草芽孢杆菌的基础上，在编码脯氨酸氨肽酶基因的上游加入了编 码组氨酸标签的基因，而得到的。
【文档编号】C12R1/125GK105925650SQ201610382986
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】田亚平, 汪克红, 王开道, 周楠迪
【申请人】江南大学