一种检测嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因mRNA表达水平的特异性引物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种检测嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因mRNA表达水平的特异性引物，其核苷酸序列如下：上游引物序列：5′?AAGCCCGTGCCTAAAGTG?3′，下游引物序列：5′?CTGCCATAGTTGGTGTTGT?3′。本特异性引物可对嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因转录水平进行检测，在检测基因mRNA表达水平方面具有灵敏度高、特异性好等优点。通过实时监测硫氧化代谢过程中sor基因mRNA表达水平，用于解释嗜酸氧化硫硫杆菌的硫氧化机理。
【专利说明】一种检测嗜酸氧化硫硫杆菌基因mRNA表达水平的特异性引物
技术领域
[0001]
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因mRNA表达水平的特异性引物。
【背景技术】
[0002]作为一种无机化能自养型、革兰氏阴性、杆状的极端微生物，嗜酸氧化硫硫杆菌与硫化矿系(煤矿、黄铜矿、黄铁矿、辉铜矿等)的生物浸出密切相关，其在工业应用领域具有广泛的前景。嗜酸氧化硫硫杆菌能以元素硫及还原型无机硫化合物(Reduced InorganicSulfur Compounds，简称RISCs)作为能源物质。关于嗜酸氧化硫硫杆菌的研究至今从未间断，但对于其生物化学过程则有待进一步的补充和完善。在嗜酸氧化硫硫杆菌中硫氧化酶系的作用下，元素硫或还原型无机硫化合物经过一系列的酶反应或非酶反应最终产生硫酸盐而释放到机体外，硫酸盐对于维持体系中的PH至关重要。
[0003]作为需氧的硫氧化过程中的初始酶，硫氧化还原酶(SOR)存在于某些嗜热古菌和嗜酸菌中，其在嗜酸嗜热古菌如腾冲嗜酸两性菌(d c i c/ia/3 us ie/设cA o/3ge/3 si s)和布氏嗜酸两性菌ambivalens)以及喜温硫杆菌{Acidith1baciIIuscaldus)均有敬道。SOR依赖氧分子催化单质硫发生歧化反应，能够同时产生硫化物、亚硫酸盐和硫代硫酸盐。该酶催化的反应具备以下特点:①反应相关的酶是可溶性的且位于细胞质内；②反应的最适 pH 和最适温度分别为 7.0 ± 0.5 ( Sulfolobusbrierleyi)和 65_85°C{Acidianustengchongensis及Acidianusambivalens);③该反应不需借助外源辅助因子及电子供体。硫氧化还原酶具有催化元素硫发生歧化反应的能力，其产物硫化物、硫代硫酸盐以及亚硫酸盐均在硫氧化途径中充当重要的中间代谢产物，因此该酶在元素硫和还原型无机硫化合物的氧化过程至关重要。
[0004]荧光定量PCR技术是在普通PCR(Polymerase Chain React1n, PCR)的基础上，结合实时荧光检测技术和计算机分析技术。它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。它的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种检测嗜酸氧化硫硫杆菌硫氧化还原酶基因mRNA表达水平的特异性引物，并采用荧光定量PCR技术，通过反复实验和优化，我们得到一组能够有效检测嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因mRNA表达量的引物，并总结出一套最佳的PCR反应使用的参数。
[0006]本发明提供一种嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因mRNA表达水平的荧光定量PCR检测的特异性引物，所述引物的核苷酸序列为:上游引物:57 -AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37，
下游引物:5' -CTGCCATAGTTGGTGTTGT-37。
[0007 ]对应地，本发明提供一种嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因mRNA表达水平的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤:
(1)嗜酸氧化硫硫杆菌总RNA的提取和纯化；
(2)对步骤(I)提取的RNA进行逆转录生成cDNA，利用权利要求1所述的特异性引物进行荧光定量PCR;
(3)根据荧光定量PCR的结果计算出mRNA表达水平。
[0008]其中步骤(3)中的PCR扩增的反应程序为:95°C变性30 sec;在退火温度56° C下复性15s; 72° C延伸25 s，40个循环。
[0009]优选地，其中采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因作为转录内参基因；使用△ACt方法计算基因的相对表达量。
[0010]本发明还提供一种用于上述的荧光定量PCR检测方法的检测试剂盒，该试剂盒包括如上所述的特异性引物。
[0011 ]具体地，所述方法更具体步骤如下:
(1)采用离心的方法回收菌体，然后使用Trizol试剂来提取RNA，接着使用MicroElute RNA Clean-Up Kit (OMEGA)，提取的总RNA按照说明进行纯化，然后使用RNase-free DNase I (OMEGA)去除提取物中含有的基因组DNA;
(2)使用NanoDropND-1000 分光光度计(NanoDrop Technologies)检测RNA 的浓度和纯度，参数设置为0D260 和0D280，使用OMEGA MicroElute RNA Clean-Up Kit (50)纯化 RNA;
(3)利用FirstStrand cDNA Synthesis Kit (TOYOBO)对2 Hg总RNA进行逆转录;
(4)以I μ I 逆转录产物 cDNA 作为模板，使用 QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit(QIAGEN)配置25 μ? 的体系，然后使用MyIQ Single Color Real-Time PCR Detect1nSystem (B10-RAD)进行实时定量PCR。
[0012]本发明采用上述的技术方案，通过监测不同时期嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因mRNA表达水平和用于解释硫氧化机理，进而可以作为该菌对硫元素或还原型无机硫化合物氧化速率的依据。
[0013]本发明以嗜酸氧化硫硫杆菌中的sor基因为模板，设计出一系列引物，并通过优化条件和反复实验，挑选出一对高特异性的引物。该引物在mRNA水平监测sor基因不同时期的表达差异更具有针对性，能够有效地反映硫氧化过程中基因的表达情况，从而能够作为考查硫氧化速率的一项重要的参照指标。
【附图说明】
[0014]图1为实施例2中的样品扩增曲线；
图2为实施例2中的标准曲线；
图3为实施例2中的样品溶解曲线。
[0015]
【具体实施方式】
[0016]实施例1、特异性引物对的筛选与获得
硫氧化还原酶由sor基因编码，该酶具有催化元素硫发生歧化反应的能力，在元素硫和还原型无机硫化合物的氧化过程至关重要。硫氧化还原酶存在于某些嗜热古菌和嗜酸菌中，其在嗜酸嗜热古菌如腾冲嗜酸两性菌和布氏嗜酸两性菌以及嗜酸细菌如喜温硫杆菌均有报道。
[0017]通过全基因组测序，我们获得th10xidans AOl的全基因组序列信息，并首次在该种中报道了硫氧化还原酶编码基因的存在。根据儿th10xidansAOl的sor基因(NCBI登录号为KJ483962)，通过Primer 5设计多组引物，尽量满足引物设计的规则，尤其是尽可能避免引物二聚体、错配和发夹结构。5对引物分别为:
引物 I上游序列:5' -ACCAACTATGGCAGTCAGG-37引物 I 下游序列:5' -ATCATGGGTCCAAAGAGC-37引物2上游序列:57 -AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37引物2下游序列:57 -CTGCCATAGTTGGTGTTGTAC-37引物3上游序列:5' - AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37引物3下游序列:57 - CTGCCATAGTTGGTGTTGT-37引物4上游序列:57 -CAACACCAACTATGGCAGTC-37引物4下游序列:57 -ATCATGGGTCCAAAGAGC-37引物5上游序列:5' -ACCAACTATGGCAGTCAGG-37引物5下游序列:57 -CATGGGTCCAAAGAGCAT-37
通过设置温度梯度(50°C?60°C;以2为步长递增)，引物4和5出现多处明暗不等的杂带，可判断该引物对的特异性差;而引物I和2的电泳图显示，靠近目的条带的地方出现较暗的杂带，初步分析可能为引物二聚体。而引物3具有较好的特异性，且根据不同温度下的实验结果，最终确定引物最佳的退火温度(56° C)。
[0018]实施例2、嗜酸氧化硫硫杆菌在不同能源下硫氧化还原酶基因mRNA表达水平一、培养基和培养条件
菌株Acidith1baciIliis th10xidans AOl分别选用9K培养基和德国生物材料资源中心培养基71 (DSMZ medium 71)进行液体培养。其中，含10.0 g/L元素硫的9K培养基用5 mol/L的H2S04调节培养液初始pH至2.0，而含5.0 g/L硫代硫酸钠的DSMZ medium 71培养基调pH至4.4。细菌在装有100 mL培养液的锥形瓶(规格为250 mL)培养，其细菌初始浓度为2.5X 16个/毫升，培养温度为30°C，摇床振荡频率为170 rpm。
[0019]二、RNA 的提取
在对数中期(54 h)(三个重复实验求平均值)采用离心的方法回收菌体并用以提取RNA，然后使用RNase-free (MH2O清洗样品两次。具体步骤如下:
(I)细胞裂解。12000 rpm离心20 min收集菌体，加入I ml的Trizol试剂，并反复吹打移液枪，使细胞充分裂解。
[0020](2)为使核酸蛋白复合物完全分离，将匀浆样品在15-30°C温育5 min。
[0021](3) 4。C下，10000 rpm 离心2 min，收集上清液。
[0022](4)按每I ml Trizol加0.2 ml的比例添加氯仿，盖好离心管，吸打15 S，室温温育3 min。
[0023](5) 4。C下，10000 rpm离心10-15 min后，样品分成三层:底层为黄色的有机相，中间层及上层无色的水相，而RNA主要在水相中，使用移液枪小心把水相(约600 μ?)转移到新离心管中。
[0024](6)在加有水相溶液的新离心管中加入等体积(600 μ?)的异丙醇，经充分混匀后，室温放置20-30 min。
[0025](7) 4。C，10000 rpm 离心 10 min，弃上清。
[0026]三、RNA的纯化
(I) RNA样品加DEPC-Water至总体积为100 μ?。
[0027](2)加350 μ I QVL Lysis buffer (每 Iml 加20 μ I β_ 巯基乙醇)，另加入 2 μ ILinear Acrylam1le，祸方定混勾。
[0028](3)加250 μ?无水乙醇到样品混合液中，混合均匀。
[0029](4)转移700 μ?混合液到套着2 ml收集管的RNeasy纯化柱子中，12，000 rpm离心I min，弃收集液。
[0030](5)加300 μ I RffB Buffer (已稀释)到柱子中，10，000 rpm、离心 I min，弃收集液。
[0031](6)取另一新的离心管，加入 73.5 μ I DNase I Digest1n Buffer和I.5 μ IRNase-free DNase I，充分混勾。
[0032](7)将配成的75 μ? DNase I消化混合液转移到RNeasy纯化柱硅胶膜正中间，室温(25-30°C)放置15 min。
[0033](8)加400μ1 RffB Wash buffer (已稀释)到RNeasy纯化柱中，室温放置5 min, 10,000 rpm离心I min，弃收集液。
[0034](9)加500 μ I RffB Buffer (已稀释)到RNeasy 纯化柱中，10,000 rpm 离心 I min,
弃收集液。
[0035](10)重复步骤9。
[0036](11)空柱13,000 rpm离心2 min空用干燥柱子基质。
[0037](12)将柱子转移到新的1.5ml离心管，加入30 μ I DEPC-treated Water到RNeasy纯化柱基质中，静置2 min，10 ,OOOrpm离心I min。
[0038]四、反转录cDNA的合成
(I)配置反应体系:11 μ? RNA样品和I μ?随机引物。
[0039](2)轻轻混匀反应体系后，进行如下处理:65°C加热5 min，置于冰上2_3 min，充分冷却后，短暂低速离心。
[0040](3)再在反应体系中依次添加12 μ?变性RNA，4 μ? 5 X RT buffer，2 μ? dNTPMixture，I μI RNase Inhibitor和I μ? ReverTra Ace。
[0041 ] (4)轻轻上下吸打均匀。
[0042](5)样品依次在如下条件下进行处理:30°C，10 min;42°C，20 min;99°C，5 min；4°C，5 min0
[0043](6)使用NanoDrop微量分光光度计检测cDNA质量，然后将样品稀释成200 ng/μI，再使用Real-time PCR进行检测以备待用。
[0044]五、实时定量RT-PCR
PCR的参数设置为:95°C，30 s;56。C，15s;72。C，25 s，循环数为40。此外，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因作为转录内参基因，并使用△ ACt方法计算基因的相对表达量，其倍数变化采用2—AAet表示。
[0045]实验结果请参见图1至图3，图1显示样品扩增曲线，图2显示标准曲线，图3显示样品溶解曲线。其中，样品扩增曲线(图1)显示，样品扩增的Ct值为26，且扩增在38个循环后达到平台期。Real-time PCR标准曲线(图2)表明，扩增的动力学方程相关系数为0.999，PCR扩增效率为82.1%。一般地，扩增效率的范围在80%?120%，所以该标准曲线的标准方程是理想的。该样品溶解曲线(图3)为单一吸收峰，无非特异性产物和引物二聚体等生成，从而表明该引物的特异性良好，能够用于后续实验，且Real-time PCR结果能够准确反映样品初始浓度。
【主权项】
1.一种嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因mRNA表达水平的荧光定量PCR检测的特异性引物，所述引物的核苷酸序列为: 上游引物:57 -AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37， 下游引物:5' -CTGCCATAGTTGGTGTTGT-37。2.—种嗜酸氧化硫硫杆菌sor基因mRNA表达水平的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤: 嗜酸氧化硫硫杆菌总RNA的提取和纯化； 对步骤(I)提取的RNA进行逆转录生成cDNA，利用权利要求1所述的特异性引物进行荧光定量PCR; 根据荧光定量PCR的结果计算出mRNA表达水平。3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测方法，其中步骤(3)中的PCR扩增的反应程序为:95°C变性30 sec;在退火温度56°(:下复性158;72°(:延伸25 s，40个循环。4.根据权利要求2或3所述的荧光定量PCR检测方法，其中采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因作为转录内参基因；使用A ACt方法计算基因的相对表达量。5.—种用于如权利要求2至4任一项所述的荧光定量PCR检测方法的检测试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述的特异性引物。
【文档编号】C12Q1/04GK105925667SQ201610199719
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】尹华群
【申请人】中南大学