一种利用TaqMan探针检测桔小实蝇的方法及检测用引物和探针的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用TaqMan探针检测桔小实蝇的方法，包括以下步骤：（1）设计引物和探针：上游引物序列见SEQ ID No：1，下游引物序列见SEQ ID No：2，探针序列见SEQ ID No：3；（2）采用步骤（1）设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。通过设计特异性引物和TaqMan探针，建立检测桔小实蝇的方法，可快速、准确地检测出桔小实蝇。
【专利说明】
-种利用TaqMan探针检测枯小实蜗的方法及检测用引物和 探针
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种利用化qMan探针检测枯小实蛹的方法及 检测用引物和探针。
【背景技术】
[0002] 枯小实蛹Bactrocera dorsalis,又名东方果实蛹Oriental fruit fly、黄苍蛹、 果姐，属双翅目（Diptera)、实蛹科（Tephritidae)、果实蛹属Bactrocera，为世界性检疫害 虫中的一种。枯小实蛹原产于中国的台湾和日本的琉球群岛一带，而后陆续传到周边的20 多个国家和地区，在我国现主要分布于四川、重庆、贵州、云南、湖南、湖北、广西、陕西、台湾 等省市。枯小实蛹为杂食性害虫，寄主范围非常广泛，W热带和亚热带的果蔬为主，可危害 包括番石恼、芒果、香蕉、相橘等46个科250多种水果、蔬菜和花弁，它对各种寄主的选择偏 好有着明显差异，对番石恼、芒果、杨桃、蒲桃、沙田抽等水果的为害最为严重。枯小实蛹主 要W幼虫钻蛙果实为害，成虫将卵产于果皮内，卵解化后，幼虫即潜居果飄内取食，造成果 实腐烂或未熟先黄而脱落，严重影响了水果的产量与质量，给果蔬业及果蔬的对外贸易带 来巨大的经济损失，传播方式主要是幼虫随瓜果、蔬菜的运输来进行传播。因此，加强瓜果、 蔬菜的调运检疫显得尤其重要，从源头上堵住疫情的传播渠道，同时还要建立快速，准确的 枯小实蛹方法。为保护中国的农业生产和生态安全，必须制定严格的检验检疫制度和防除 措施，W防止枯小实蛹的传播，而检测方法则是影响水果进出口贸易通关速度和时间的关 键，因此对其检测方法的研究极其重要。主要检测方法：（1)形态鉴定检测：早期对枯小实蛹 的鉴定主要应用传统的成虫形态鉴定方法。而通常口岸或其他渠道截获的大部分是幼虫或 卵，通常的做法是室内饲养获得成虫后，再进行形态鉴定。通常饲养成虫需要较长的时间， 实蛹形态鉴定的周期一般情况下约需15~25天，检测周期较长，因此传统的成虫形态鉴定 并不利于口岸快速检验通关的实际需求；（2)声波检测:不同的声波频谱特征反映了各种虫 声所特有的信息。邱友德等通过对芒果内枯小实蛹幼虫为害声波进行测试录音，将运些录 音虫声进行频谱分比较，从已得出的蜜相大实蛹幼虫为害声2个样本频谱分析显示出一定 的模式，但声波检测中关于器械灵敏度与抗外界噪声干扰的矛盾问题，一直成为该技术发 展的一个瓶颈；（3)分子检测:害虫的分子鉴定具有快速、准确、客观和对样品要求低等诸多 特点，可对形态鉴定起补充作用。分子检测鉴定实蛹类害虫的方法很多，各有千秋，Lu-KH等 利用RAPD技术从实蛹类害虫中找出特异带，并对特异带进行筛选、纯化、测序，然后根据序 列设计特异引物来区分枯小实蛹、瓜实蛹和南瓜实蛹等几类实蛹类害虫;张亮等筛选得出 的5个引物对枯小实蛹及其幼虫W及番石恼实蛹及其幼虫的基因组DNA扩增结果基本一致， 所建立的指纹图谱可W作为6个种各虫态的鉴定依据，试验结果稳定、可靠，可对6种实蛹近 缘种类进行鉴定区分;孔秋莲等利用特异性嵌套式PCR引物对枯小实蛹的rDNA基因片段进 行扩增，通过进一步序列分析，确定该虫与其近缘种的关系，并能确定样本的种属关系，该 试验建立的分子鉴定体系，可应用于口岸微量枯小实蛹卵快速、准确检验;张红梅等用RAPD 技术对陕西省常见的4种实蛹进行了研究，试验筛选出的5种RAPD引物S61、S107、S126、 S275、S1142,可W对4种实蛹基因组DNA扩增出稳定清晰的多态性片段，其中RAPD引物S126 可W把南瓜实蛹和具条实蛹、具条实蛹和S点棍腹实蛹分开，利用UPGMA法聚类后构建的发 育系统树与传统分类结果完全一致。W上研究结果对开发枯小实蛹快速可靠的分子检测新 技术提供了很好的参考作用。
[0003] 自90年代化qMan探针诞生W来，虽然巧光探针（引物)不断有新的技术出现，但是 作为一种经典的定量PCR技术，TaqMan探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的 首选，运主要是因为相对于SYBR巧光染料，TaqMan探针具有序列特异性，只结合到互补区， 而且巧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优 化容易；而相对于杂交探针，TaqMan探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而 且也能完成基本的定量PCR要求。一般化qMan定量PCR实验过程为：目的基因查找比对^探 针与引物设计^探针与引物合成^配置反应体系^反应参数^重复实验，优化条件^获得 曲线数据，比对标准曲线^再重复验证。但检测枯小实蛹的化qMan探针未见报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种利用化qMan探针检测枯小实蛹 的方法及检测用引物和探针，利用该引物和探针可快速、准确地对枯小实蛹进行检测鉴定。
[0005] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006] 本发明的一方面，提供一种利用化qMan探针检测枯小实蛹的方法，包括W下步骤：
[0007] (1)设计引物和探针：
[000引引物序列为：
[0009] 上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGATATT-3'（沈Q ID No:l);
[0010] 下游引物序列：5'-AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3'（SEQ ID No:2);
[0011 ] I^qMan探针的序列：5 'FAM-TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-B册3 '（ SEQ ID No: 3);
[001。 其中FAM为标记在探针5 '端的巧光集团，B册为标记在探针3 '端的巧光泽灭集团；
[0013] (2)采用步骤(1)设计的引物和探针进行巧光定量PCR检测。
[0014] 步骤（2)中巧光定量PCR检测的反应体系为10化，包括2X化qMan probe Supermix 化L，上、下游引物各0.化L，化qMan探针0.化L，DNA模板0.化L，去离子水补至10化。
[001引步骤(2)中巧光定量PCR检测的反应程序为:95°C预变性10min，95°C变性10s，55.8 °C退火20s(采集巧光信号），40个循环。
[0016] 本发明的另一方面，提供一种用于检测枯小实蛹的引物，其序列为：
[0017] 上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGATATT-3' ；
[001 引下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 '。
[0019] 本发明的第S方面，提供一种用于检测枯小实蛹的化qMan探针，其序列为:5'FAM- TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-BHQ3 ' ；其中FAM为标记在探针5 '端的巧光集团，B册为标记在 探针3'端的巧光泽灭集团。
[0020] 本发明提供的一种利用化qMan探针检测枯小实蛹的方法及检测用引物和探针，具 有W下有益效果:该引物和探针容易设计，特异性好，稳定性高，重复性强，灵敏度高，检测 方法简单有效，易操作，检测时间短，准确率高，可快速、准确地检测出枯小实蛹。
【附图说明】
[0021 ]图1为不同退火溫度的Ct值结果图；
[0022] 图2为特异性实验扩增曲线图；
[0023] 图3为6个10倍系列稀释样品的巧光定量PCR扩增曲线；
[0024] 图4为重复性实验扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1
[00%] 1、样品模板:6份已知物种的实蛹DNA，编号分别为：1，2,3,4,5,6，样品名称分别为 枯小实蛹、番石恼实蛹、具条实蛹、南瓜实蛹、川黑实蛹和瓜实蛹，其中前五个种类由四川国 际旅行卫生保健中屯、口岸实验室提供，瓜实蛹由华南农业大学资源环境学院昆虫教研室提 供，具体见表1。
[0027]表1样品信息 [002引
[0029] 2、一种利用化qMan探针检测枯小实蛹的方法，包括W下步骤：
[0030] (1)设计引物和探针：
[0031] 引物是根据枯小实蛹DM特异片段设计的：根据枯小实蛹线粒体DM序列 (Genebank accession numbe;r:NC_008748)，使用Beacon Desi即er 6软件设计其引物和探 针序列，并将设计的引物和探针在NCBI Blast比对，确认为枯小实蛹特异性序列；
[0032]引物序列为：
[0033] 上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGATATT-3' ；
[0034] 下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 ' ；
[0035] I^qMan探针的序列：5 ' FAM-TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-B册3 ' ；
[0036] 其中FAM为标记在探针5'端的巧光集团，B册为标记在探针3'端的巧光泽灭集团；
[0037] (2)采用步骤(1)设计的引物和探针进行巧光定量PCR检测:反应体系为10化，包括 2 X^qMan probe Supermix化L，上、下游引物各0.化L(引物终浓度分别为200nmol/L)， 化qMan探针0.化L(探针终浓度为lOOnmol/L)，DNA模板0.扣L，去离子水补至10化;反应程序 为:95 °C预变性IOmin，95 °C变性10s，合适溫度退火20s (采集巧光信号），40个循环。
[0038] 实施例2巧光定量PCR实验中退火溫度的优化
[0039] 选取的退火溫度分别为：55.8 °C、56.8 °C、57.8 °C、58.8 °C，观察其差异，不同的退 火溫度，其循环阔值(Ct)结果见表2和图1。
[0040] 表2不同退火溫度时的Ct值 r 00411
[0042] 由结果可知，同一浓度的番石恼实绳DNA模板在不同的退火溫度下，其循环阔值 (Ct)不同，退火溫度为55.8°C时，循环阔值最小，因此，最优的退火溫度为55.8°C。
[0043] 实施例3特异性和敏感性实验
[0044] 特异性实验：W枯小实蛹DNA模板为阳性对照，W实施例1中的检测方法结合实施 例2中退火溫度，对6个样品的DNA模板进行巧光定量PCR检测，检测结果见图2;
[0045] 由图2可知，仅有枯小实蛹出现了特异性扩增，其余5种实绳并没有出现扩增，说明 该检测方法特异性良好。
[0046] 敏感性实验:将枯小实蛹DNA(原浓度为l(K)ngAiL)进行10倍系列稀释，稀释6次，每 个稀释样品取化L作为模板进行巧光定量PCR检测，检测结果见表3和图3。
[0047] 表3 10倍系列稀释样品检测结果 rnru 只 1
[0049]当模板浓度在0.0 Ol-IOOng/化时，与相应的Ct值有良好的相关性，相关系数为 0.998，可信度为0.99559，结果表明，TaqMan探针可对DNA浓度>0 . OOlngAiL的枯小实蛹进 行精确定量。
[0化日]实施例4重复性实验
[0051]为检测化qMan探针定量的重复性和稳定性，对同一浓度（12. SngAiL)的10个枯小 实蛹DNA模板进行重复性实验，其Ct值结果见表4和图4。
[0化2]
[0053]重复性扩增曲线显示该方法重复性好，由统计结果可知，10个模板的重复性实验 标准差为0.47，表明该方法重复性良好而且稳定。
【主权项】
1. 一种利用TaqMan探针检测桔小实蝇的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 设计引物和探针： 引物序列为： 上游引物序列：5 ' -GCTAATTCATCTGTAGATATT-3 ' ； 下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 ' ； TaqMan探针的序列：5 'FAM-TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-BHQ3 ' ； 其中FAM为标记在探针5'端的荧光集团，BHQ为标记在探针3'端的荧光淬灭集团； (2) 采用步骤(1)设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。2. 根据权利要求1所述的利用TaqMan探针检测桔小实蝇的方法，其特征在于，步骤(2) 中所述焚光定量PCR检测的反应体系为10yL，包括2 XTaqMan probe Supermix 5yL，上、下 游引物各〇 · 4μ L，TaqMan探针0 · 2μ L，DNA模板0 · 5μ L，去离子水补至1 Ομ L。3. 根据权利要求1或2所述的利用TaqMan探针检测桔小实蝇的方法，其特征在于，步骤 (2)中所述荧光定量PCR检测的反应程序为:95°C预变性10min，95°C变性10s，55.8°C退火 20s采集荧光信号，40个循环。4. 一种用于检测桔小实蝇的引物，其特征在于，序列为： 上游引物序列：5 ' -GCTAATTCATCTGTAGATATT-3 ' ； 下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 '。5. -种用于检测桔小实蝇的TaqMan探针，其特征在于，序列为：5 'FAM-TGACACATATTACGTAGTAGCTCAT-BHQ3 ' ；其中FAM为标记在探针5 '端的荧光集团，BHQ为标记在 探针3'端的荧光淬灭集团。
【文档编号】C12N15/11GK105925702SQ201610407483
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】林丹, 李楠, 赵峰, 林凤, 陈琳
【申请人】成都丹凤科技有限公司